Summary
Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef iskelet kası aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu video segmental CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir.
Abstract
Larvaların zebrafish spinal motor nöron ve hedef kas aynı anda yama kelepçe kayıt izin vermek için ilk omurgalı model sistemi temsil eder. Bu her iki hücre tipleri ve yeteneği, görsel olarak morfolojisi ve lokasyon bazında tek segmental CaP motor nöron ayırt etmek için erişilebilirlik doğrudan bir sonucudur. Bu video bir CaP motor nöron ve hedef kas hücrelerinin yanı sıra, her bir hücre tipi kayıt için metodolojiler tanımlamak için kullanılır mikroskobik yöntemler göstermektedir. CaP motor nöron tipi Kimlik boya dolum birinin veya biyofiziksel aksiyon potansiyeli dalga şekli ve hücre giriş direnci gibi özellikleri ile teyit edilir. Motor nöron kayıtları, bir saat, birden fazla farklı hedef kas hücreleri uzun vadeli kayıtları izin rutin son. Motor nöron ateşleme deseni üzerinde kontrol nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim frekans bağımlılığı ölçümleri sağlar. Üniter olaylar büyük bir quantal boyutu ve tüm hücre gerilimi kelepçe tarafından sağlanan düşük gürültü seviyesi sayesinde, tüm kas çözülebilir. Bu özellik sürüm özellikleri, vezikül yanı sıra geri dönüşüm, sinaptik depresyon ve kolaylaştırılması gibi temel sinaptik özellikleri çalışma izin verir. Motor nöron genellikle ekstrasellüler elektrotlar tarafından teşvik eden bu in vivo hazırlık eclipse önceki nöromüsküler model sistemler tarafından sunulan avantajları okudu ve kaslar tüm hücre yama kelepçe için çok büyük. Zebra balığı hazırlık yaklaşımların transgenik hatları, morfolino demonte, farmakolojik müdahale ve in vivo görüntüleme dahil olmak üzere geniş bir yelpazede elektrofizyolojik analizi birleştirerek için uygun. Bu yaklaşımlar, giderek artan sayıda zebrafish mutant hatları tarafından sağlanan nöromüsküler hastalık modelleri ile birleştiğinde, insan nöromüsküler bozukluklar yeni bir anlayış için kapıyı açmak.
Protocol
1. Eşleştirilmiş Kayıtlar Balık hazırlanması
- Yordama başlamadan önce, dahil beş anahtar teslim çözümler hazırlamak: Banyo Çözüm Tricaine (MS222), Formamid, Nöron İç Çözüm ve kas İç Çözüm Çözüm Banyo Banyo Çözüm.
- Daha sonra, 72 ila 96 saat arasında yaş ve Banyo Çözüm Tricaine ile yer arasında bir tek larva Zebra balığı toplamak. Anestezi maruz kalma bir dakika içinde, balık, dokunmaya karşı cevap vermez.
- Plastik bir tabak balık üstüne yerleştirin ve bir stereomikroskopta kullanarak, çift kenar jilet ile başını kesmek.
- Sylgard ile kaplı ve Banyo Çözümü ile dolu bir cam kayıt odasına balık aktarın. Notokord ile elektrolitik bilenmiş tungsten pimleri takarak her iki ucunda sabitleyin.
- Rostral sonuna yakın, ince forseps bir çifti için yeterli bir kavrama sağlayacak bir iğne ile balık flep oluşturun. Bir çift ince forseps ile rostral pin yakınında sürükleyici örten deri çıkarın. Kaudal yönde yavaş yavaş soyun cilt kaldırmak için.
- Kayıtları ile etkileşebilir kas kasılmaları engellemek için 3-5 dakika Formamid Banyo Çözüm 3 ml ile balık davranın. Normal Banyo Çözümü ile 5 kez yıkayın. 5 ila 6 segmentleri üzerinde yüzeysel kas tabakasının parçası hafifçe tungsten pin tarafı hurdaya çıkarın.
- Elektriksel gürültü kalkan bir Faraday kafesi bulunan dik bir mikroskop balık aktarın. Mikroskop, uzun 4x mesafe 40x objektif ve zoom 0,5, sabit bir sahne ile donatılmıştır. Mikroskop yüksek güç altında sinir ve kas arasındaki hazırlık taşımak için motorize XY çeviri aşamasında üzerine monte edilmiştir. Diferansiyel girişim kontrast optik nöron görselleştirmek için yardımcı olur.
- 0,5 x zoom örten kas altında, kaldırmak ve omurilik ortaya çıkarmak için geniş bir çap 15 mikron pipet kullanın. Negatif basınç, 3 cc tek kullanımlık şırınga ve kas hücreleri ile uygulanan tek tek çıkarılır. Bu prosedür, iskelet kası 5 ila 6 dorsal segmentleri için tekrarlanır. Aynı geniş delik pipet de hedef hızlı iskelet kas elde etmek için karın kas üst iki kat kaldırmak için kullanılır.
- Bu eşleştirilmiş kayıtları için hazırlık tamamlar ve mikroskop zum yaklaşık 1.6x 'e yükselmiştir.
2. Eşleştirilmiş CaP Motor nöron Kayıtlar ve Hedef kas hücreleri
- Temizlenir segmentleri CaP nöronlar bulmak için taranır. Her omurilik hemi-segment, büyük bir, 10 mikron çapında, PCa motor nöron içerir. Bu gözyaşı şeklindeki soma segmental sınır kaudal en sonuna yakın spinal dura altında yüzeysel olarak yer almaktadır. Bir CaP nöron kayıt için seçilir ve komşu kaudal segmentinde ventral hedef kas bütünlüğünü kontrol etmek için taranır.
- İki kayıt, nöron ve kas için ikinci bir yama elektrotlar yerleştirilir. Üst elektrodun sert spinal dura ve yaklaşık 2 mikron ucu açılış penetrasyon için sığ bir konik vardır. Alt elektrot iskelet kas düşük direnç gerilim kelepçe kayıt için dik konik
- Nöron elektrot spinal dura nüfuz yaklaşık 30 derecelik bir açıyla yerleştirin, yaklaşık bir yarım seçilen CaP nöron rostral-segment. Avans yaklaşık 60 milimetre cıva nazik bir sürekli pozitif basınç uygulayarak eksenel bir sürücü manipülatör kullanarak elektrot. Elektrot dura delerek geçer gibi, CaP nöron odak yeniden düzenlenmesi gerektiren elektrottan perfüzyon yerinden olabilir.
- Elektrot değdiğinde CaP nöron soma pozitif basınç yayınlandı ve gigaohm mühür hemen oluşumunda genellikle sonuçları. Ancak, bazı durumlarda bir mühür formu başarısız, nazik bir negatif basınç uygulamak için gerekli olur. Mühür kurulmasından sonra, elektrot potansiyeli to-80mV ayarlanabilir ve negatif basınç uygulaması hücre zarı rüptür. CaP nöron 140-180 Mega ohm ve aksiyon potansiyeli, bu artım +40 milivolt bir giriş direnci ile karakterizedir. Bu aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı kadar akım pensi altında depolarizan adımları aşamalı olarak artan enjekte edilerek test edilir.
- Daha sonra, mikroskop altında XY motorlu tercümecisi yüksek güç kullanarak ventral kas taşındı. Hızlı bir kas hücre hedef alan seçilir.
- Serbest bırakıldığında, gigaohm mühür formları pozitif basınç altında hedef kas hücresi, kas elektrot doğru ilerletilir. Elektrot potansiyeli -50 milivolt sodyum kanallarını inaktive ayarlanır ve yumuşak emmek altında hücre zarının delinmiş veya yırtılmış. 100 ile 200 Mega-ohm direnç ve büyük kapasitif transientler sinyalleri giriş aniden ortaya bir damla.
- Test etmek içinbir aksiyon potansiyeli ortaya çıkardı kadar eşleştirilmiş kayıt için, motor nöron aşamalı olarak daha büyük akım enjeksiyonu depolarize. Bu noktada bir uç plakası akımı kas anlaşılabilir olmalıdır. Arızasız son plağın akımları 1 Hertz sonuçları motorneuron Devamı stimülasyonu. 100 Hertz uyaran frekansı arttıkça uç plakası akımları genlik dalgalanma ve stimülasyon 10 saniye içinde fonksiyonel tükenmesi tabi.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Tipik olarak, nöron kayıt için bir saat kadar istikrarlı ama kas hücreleri seri direnç bir artış olarak yansır bozulabilir. Bu oluştuğunda deney ya iptal edilir ya da başka bir kas hücresi yama kelepçeli. Tüm kayıtlar bir saat içinde tamamlanmalıdır.
Şekil 1 motorneuron aksiyon potansiyeli (AP, üst) ve ilgili kas uç plakası mevcut (EPC, alt) Kayıtlar. CaP nöron için aksiyon potansiyeli aşmayı +40 mV ve EPC 1 msn altında sabit bir süre ile üstel bir zaman seyri boyunca 300 μsec ve çürüme içinde yükselmeye etmelidir.
| Isim | Reçete |
| Banyo Çözümü (mM) | 134 NaCl, 2.9 KCl, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 Glikoz, 10 Na-Hepes, pH 7.8 |
| Tricaine ile Banyo Çözüm | Banyo Çözüm içeren% 0.02 tricaine |
| Banyo Formamid ile Çözüm | 2M formamid içeren Banyo Çözüm |
| Nöron İç Çözümü (mM) | 115 K-glukonat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7.2 |
| Kas İç Çözüm (mM) | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7.4 |
Tablo 1. Çözümler.
Discussion
Biz esas olarak yüksek frekanslı stimülasyon sırasında vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm süreçlerini incelemek için zebrafish eşleştirilmiş kayıtları (Wen ve Brehm, 2005) ile olmuştur. Bu süreç, temel sinaptik bileşenler, nokta mutasyonları nedeniyle tehlikeye motilite mutantlar neyin normal sinaptik iletimi bozulur. Örneğin, mutasyonlar postsinaptik reseptör agrega (Ono ve arkadaşları, 2001, 2002, 2004) ve presinaptik verici sentezi (Wang ve ark, 2008) un koordine yüzme sonucu bozabilir. Eşleştirilmiş kayıtları böylece davranış, genetik ve fizyoloji bağlama, fonksiyonel defekti kaynak kesin bilgi verir. Şimdi daha akıllıca rehberleri kullanarak CaP motor nöronların sinaptik iletim yoluyla geçici ifade yatan süreçleri incelemek mümkün olmalıdır. Bu şekilde dominant negatif ya da mutasyona uğramış genlerin, özellikle bu nöronların ifade ve hem de davranışsal ve elektrofizyolojik sonuçları belirlenen olabilir. CaP soma ajanları ile potansiyel vezikül geri dönüşüm, Clostrodiol toksinler ve kalsiyum tamponlar gibi değiştirebilir diyaliz tüm hücre yapılandırması tarafından sunulan ek bir avantaj sağlar. Soma ve kas arasındaki kısa mesafe nedeniyle, difüzyon kayıtların zaman çerçevesi içinde yapılması gerekir. Bu hazırlık potansiyeli sadece dokundunuz başladı. Ayrıca, bu yaş ve yüzeysel sinaps yerde balık şeffaflık, optik aletler kullanımı (Fetcho ve Higashijima, 2004 Fetcho ve O'Malley, 1997) kolaylaştırır. FM boyalar ve Synaptophluorin (Li ve ark, 2003) gibi genetik göstergeleri kullanarak yaşayan balık endo ve ekzositoz ölçme çok başarılı olmuştur. Ayrıca, floresan konjuge toksinler canlı balık (Ibanez-Tallon ve ark, 2004) görüntüleme için sinaptik proteinlerin etiket kullanılabilir. Bu preparatın basitliği göz önüne alındığında gelecekteki çalışma için büyük umut vaat.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NIH (NS-18.205) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
