Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

In vivo ו במבחנה של אינטראקציה מתאם-clathrin

doi: 10.3791/2352 Published: January 26, 2011

Summary

Clathrin בתיווך אנדוציטוזה תלוי חלבונים מתאם לתאם מבחר מטען הרכבה מעיל clathrin. כאן אנו מתארים את נוהלי ללמוד מתאם-clathrin אינטראקציה פיזית הדמיה תא חי באמצעות גישות כמודל מתאם endocytic שמרים Sla1p חלבון.

Abstract

מסלול endocytic הגדולות יוזם עם הקמתה של clathrin מצופה שלפוחית ​​(CCVs) כי מטען הובלה מתא השטח כדי endosomes 1-6. CCVs מאופיינים סריג polyhedral של clathrin קרום כי שלפוחית ​​מעילים משמש פיגום מכני. מעילים Clathrin נאספו במהלך היווצרות שלפוחית ​​מ triskelia clathrin הפרט, את הטופס מסיסים של clathrin מורכבת משלושה כבד ושלושה שרשרת אור יחידות משנה 7,8. מכיוון triskelion אין את היכולת לאגד הממברנה ישירות, clathrin מחייב מתאמים הן קריטיות הקישור סריג clathrin להרכיב את הממברנה דרך בשיתוף עם שומנים ו / או חלבונים בממברנה 9. מתאמי גם הטרנסממברני חבילת מטען חלבון, כגון קולטנים, והוא יכול לתקשר אחד עם השני וגם עם רכיבים אחרים של היווצרות CCV מכונות 9.

מעל עשרים מתאמי clathrin תוארו, מספר מעורבים אנדוציטוזה מתווכת clathrin ואחרים למקם את Golgi טרנס רשת או endosomes 9. למעט HIP1R (שמרים Sla2p), כל המתאמים clathrin ידוע להיקשר תחום הטרמינל-N-המדחף של שרשרת כבדה clathrin 9. מתאמי Clathrin הם חלבונים מודולרי המורכב תחומים מקופל המחוברים באמצעות linkers גמישה מובנה. בתוך האזורים הללו והמקשר, מוטיבים מחייב לתווך קצר אינטראקציות עם תחום ה-N-מסוף clathrin או רכיבים אחרים של היווצרות שלפוחית ​​מכונות 9. שני ברורים clathrin מחייב מוטיבים הוגדרו: תיבת clathrin ו-W-9 התיבה. רצף clathrin תיבת קונצנזוס הוגדר במקור L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 אבל וריאנטים התגלו לאחר מכן 11. ה-W-box תואמת PWxxW את הרצף (כאשר x הוא שאריות).

Sla1p (קטלני סינתטי עם אקטין מחייב חלבון-1) זוהה במקור החלבון אקטין הקשורים הכרחי מבנה נורמלי cytoskeleton אקטין ודינמיקה באתרים endocytic בתאי שמרים 12. Sla1p גם קושר את האות NPFxD מיון endocytic הוא קריטי עבור אנדוציטוזה של מטען הנושאת את האות NPFxD 13,14. לאחרונה, Sla1p הודגם להיקשר clathrin באמצעות מוטיב דומה לתיבת clathrin, LLDLQ, כינה גרסה תיבת clathrin-(VCB), וכן לתפקד מתאם clathrin endocytic 15. בנוסף, Sla1p הפך סמן בשימוש נרחב עבור המעיל endocytic ב לחיות פלואורסצנטי תא מחקרים מיקרוסקופיה 16. כאן אנו משתמשים Sla1p כמודל לתיאור גישות מתאם-clathrin מחקרים אינטראקציה. אנו מתמקדים מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי, GST, לנתץ, ושיתוף immunoprecipitation שיטות.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. התאגדות של תג ה-GFP ו סמן לבחירה בגן SLA1

החלת שיטת Longtine 17 כדי הפתיל תג ה-GFP ישירות בסוף '3 ​​של מסגרת SLA1 הקריאה לפתוח גן (Sla1p C-הסופית) ובמקביל לסמן את הגן עם E. coli קאן r הגן המאפשר בחירה G418.

  1. יצירת קטע DNA באמצעות PCR באמצעות כתבנית הפלסמיד pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 ו primers הבאה: קדימה, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG tta ATT AA-3 ", ולהפוך, 5'-CA תאת AGC TTG TTT TAG tta tta TCC תאת AAA ATC tta AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3". רצף הדגיש המתאים קטע SLA1 את הגן הספציפי שקדמה (קדימה פריימר) ולאחר קודון העצירה (פריימר הפוכה). לבודד את מוצר ה-PCR על ג'ל אלקטרופורזה agarose ואחריו טיהור DNA.
  2. הכן 50 מ"ל תרבות S. SEY6210 cerevisiae זן (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) 19 ב YPD, גוברת בשלב מוקדם לוגריתמי (OD 600 = 0.2-0.6). ספין בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות XG ב 2000, לשטוף פעמיים עם מים סטריליים.
  3. המרה שבר PCR שהושגו בשלב 1 לתוך התאים באמצעות ליתיום אצטט ההליך 20. לשטוף את התאים עם מים 1 מ"ל סטרילי, להוסיף 1 מ"ל YPD ו דגירה של 4 שעות ב 30 מעלות צלזיוס שייקר.
  4. מורחים את התאים YPD-G418 צלחות כדי לבחור עבור G418 עמידים transformants, דגירה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבות פס אותם YPD-G418 צלחות.
  5. שימוש ב-PCR המושבה, לזהות transformants שבו מודול ה-GFP-קאן היה משולב היטב על ידי רקומבינציה הומולוגיים עם SLA1 רצפי גנים. השתמש פריימר קדימה כי anneals במסגרת SLA1 הקריאה פתוח פריימר הפוכה כי anneals בתוך מודול ה-GFP-קאן. זיהוי מושבות אילו מוצרים PCR יש את גודל צפוי לאמת על ידי רצף.
  6. מסך המושבות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאשר להם הפלואורסנציה של GFP.

2. מוטציה של תיבת גרסה clathrin (VCB) בגן SLA1

  1. הציגו LLDLQ AAALQ מוטציה בגן SLA1 (נוקלאוטידים 2407-2415) בעקבות הגישה שני צעד 15.
  2. ראשית, להגביר SLA1 נוקלאוטידים 1207-1410 ו - 2427-2589 על ידי PCR ולשכפל את השברים לתוך אתרי NotI / BamHI EcoRI ו / סאלי של pBluescriptKS, בהתאמה.
  3. Subclone לתוך האתרים BamHI / EcoRI קטע PCR המכיל URA3.
  4. קליב הפלסמיד שהתקבל עם NotI / סאלי, לבודד את שבר URA3 ידי טיהור ג'ל, ולהציג אותו על ידי שינוי ליתיום אצטט לתוך זן Sla1-GFP שנוצר בחלק 1, או לתוך TVY614 (מאטה ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801-suc2 Δ9 pep4: LEU2 prb1: HISG prc1: HIS3) 21.
  5. מורחים את התאים על צלחות SD בתוספת חסר אורציל. אישור על ידי המושבה-PCR וסדר כי + מושבות עורה מכילים URA3 משולב כראוי החלפת קטע VCB.
  6. בשלב השני, subclone SLA1 נוקלאוטידים 1207-2589 לתוך NotI / סאלי אתרי pBluescriptKS. שימוש QuickChange-XL אתר מכוונת mutagenesis Kit (Stratagene), מוטציה שאריות VCB LLDLQ כדי AAALQ. אמת על ידי רצף.
  7. קליב לבנות וכתוצאה מכך עם BsgI / AgeI, ולבודד את VCB מוטנט המכיל שבר על ידי טיהור ג'ל. Cotransform שבר BsgI / AgeI עם pRS313 (HIS3) 22 לתוך המתח המתקבל בפרק 2.3.
  8. מורחים את התאים על צלחות SD בתוספת חסר היסטידין. שלו Replica-צלחת + מושבות על אגר בינוני המכילים חומצה 5-fluorotic כדי לזהות תאים בהם רצפים מוטציה החליף URA3, ובכך מחדש את גן sla1 המכיל את LLDLQ מוטציה AAALQ (sla1 AAA). אישור על ידי המושבה-PCR וסדר.

3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. לגדל את זני שמרים Sla1-GFP ו sla1 AAA-GFP שנוצר חלקים 1 ו -2 מ"ל 4 בתוספת של SD התקשורת ב 30 מעלות צלזיוס rotator בחושך עד שמגיעים OD 600 = 0.1-0.4. ספין 1ml תרבות microcentrifuge XG ב 4000 1 דקות בטמפרטורת החדר. בטל ~ 950 μl של supernatant. Resuspend תאים הנוזל הנותר (~ 50 μl).
  2. הפקדה 3 μl של ההשעיה תא לשקופית מיקרוסקופיה ומכסים coverslip זכוכית. הגנה על מדגם מן האור.
  3. הר להחליק על מטרה הנפט טבילה 100x של המיקרוסקופ ספינינג, דיסק confocal.
  4. אתר משטח הפוקוס הנכון של תאים באמצעות תאורה brightfield או 488 ננומטר לייזר עם מסננים מתאימים לרגש לזהות הקרינה מן ה-GFP.
  5. לכידת זמן לשגות תמונות של Sla1-GFP ו sla1 AAA-GFP בתאים עם זמן חשיפה של 500 ms (או הערך המתאים) בשעהn מרווח של תמונה אחת לשנייה עבור 150 שניות. התוצאה הצפויה: punctae GFP שכותרתו יופיעו על המשטח הפנימי של הגבלת קרום התא, להימשך כמה שניות, ולהמשיך לכיוון מרכז התא כמו האות נעלמת במהירות (המציין את המעיל פירוק).
  6. בחר חלק מן התמונה שבה נראים כתמי להופיע, להישאר במשך כמה שניות, ונעלם. לחתוך את הקטע הזה של התמונה עבור כל מסגרת של זמן לשגות תמונות.
  7. צור רשם גלים המייצגים את הקטע הזה של התמונה בכל מסגרת של תמונה 150 זמן לשגות השני על ידי יישור מסגרות לאורך ציר המקביל הזמן שחלף.
  8. חשב את משך הזמן של כל נקודה על כמה שניות (זמן לשגות מסגרות) כתמים שוהה רשם גלים. שים לב כי כל מקום "עקומה" כלפי פנים התא צריך כפי שהוא נעלם, המשקף אנדוציטוזה ועל פירוק של המעיל.
  9. השווה סוג בר Sla1-GFP עם sla1 AAA-GFP. חזור על מנת לקבוע אם התוצאות מובהקות סטטיסטית. התוצאה הצפויה: sla1 AAA-GFP נקודות להתמיד זמן רב יותר באופן משמעותי (~ 80 שניות) מאשר סוג בר (~ 30 שניות) המעיד על פגם במבנה מעיל 15.

4. הכנת תמצית שמרים cytosolic ולחלץ תאים הכולל

  1. לחסן 3 ליטר YPD עם זן שמרים המתאים, כגון TVY614 21, ולצמוח בקצב של 30 ° C בתוך אינקובטור שייקר עד שמגיעים OD 600 = 1-2.
  2. צנטריפוגה התרבות שמרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ב 3700 x גרם. בטל supernatant, להוסיף 3-5 מ"ל של מים סטריליים, ו פיפטה למעלה ולמטה עד גלולה הוא resuspended לחלוטין.
  3. יוצקים ~ 150 מ"ל של חנקן נוזלי בכוס 250 מ"ל פלסטיק. פלאש להקפיא את השמרים על ידי הוספת dropwise בחנקן הנוזלי בתבנית עגולה, כדי למנוע התלכדות של כדורי קפוא. אל תתנו כדורי להפשיר, להוסיף חנקן נוזלי יותר במידת הצורך.
  4. צ'יל מיכל נירוסטה בלנדר ידי שפיכת חנקן נוזלי בו. אפשר חנקן נוזלי כדי להתאדות כמעט לחלוטין. מוסיפים את כדורי שמרים קפואים למיכל הבלנדר קר. סגור את המיכל בלנדר עם פקק גומי קר לטחון את כדורי השמרים למשך 10 שניות. היפוך הזמנים מכולה 3-4 לערבב תכנים לחזור על השלב שחיקה פעמיים. שמרים הקרקע הקפואה תהיה הופעה אבקת דמויי.
  5. צ'יל משפך צינור חרוטי 50 מ"ל עם חנקן נוזלי. בעזרת משפך הקרה, להעביר את השמרים הקרקע הצינור. שמרים הקרקע הקפואה ניתן לאחסן ב -80 ° C או להשתמש מיד.
  6. כדי לקבל תמצית cytosolic עבור assay GST-Fusion חלבון זיקה (חלק 5), במשקל 3 גרם של הקרקע הקפואה TVY614 השמרים צינור חרוטי 15 מ"ל ו resuspend ב 3 מ"ל של חיץ בטמפרטורת החדר (10 HEPES מ"מ, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל (Sigma).
  7. שווי ו להפוך את הצינור מספר פעמים עד מופשר לחלוטין ואז לשים על הקרח.
  8. Ultracentrifuge תמצית על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב 300.000 x ז בזהירות ההעברה (תמצית cytosolic) supernatant אל צינור חרוטי בעזרת פיפטה מבלי להפריע גלולה. שמור את תמצית cytosolic על הקרח.
  9. הוסף 100 μl של slurry 50% גלוטתיון-Sepharose (v / v) במאגר A. זה נוח לחתוך את הקצה של קצה על מנת להקל pipeting את החרוזים. סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ספין את החרוזים על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות XG ב 1000, ולהעביר את (תמצית cytosolic) supernatant לצינור טריים. רזרב 50 μl של תמצית שליטה קלט.
  10. כדי להשיג תמציות תא הכולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים (חלק 6), להשתמש זן TVY614 (WT SLA1), את המתח sla1 AAA נושאת מוטציה LLDLQ AAALQ שנוצר חלק 2 ברקע TVY614, ועל זן sla1 נושא המחיקה של SLA1 כגון GPY3130 23 גנים. משקל 2 גרם של שמרים הקרקע המתאים קפוא צינורות חרוטי ו resuspend אותם מ"ל 2 של חיץ בטמפרטורת החדר, המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל (Sigma) ואת טריטון 2% X-100.
  11. שווי ו להפוך את הצינור מספר פעמים עד מופשר לחלוטין ואז לדגור על קרח למשך 10 דקות, ערבוב מעת לעת על ידי היפוך.
  12. העברת את החומר צינורות microcentrifuge ספין על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בכל XG 16,000 (מהירות העליון microcentrifuge). בזהירות ההעברה (תמצית התא סה"כ) supernatant לצינור חרוט על הקרח בעזרת פיפטה מבלי להפריע גלולה.
  13. הוסף 100 μl של חלבון 50% (v / v) A-Sepharose slurry במאגר א סיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ספין את החרוזים על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות XG ב 1000, והעברת supernatant (תמצית הכל) על צינור טריים. רזרב 50 μl של תמצית שליטה קלט.

5. GST-Fusion זיקה חלבון assay

  1. Amplify על ידי PCR containi שברng הגרסה Sla1p תיבת clathrin-(VCB) (שאריות 803-807), שיבוט אותו pGEX-5X להשיג pGEX-5X-VCB. אמת על ידי רצף.
  2. שימוש pGEX-5X-VCB כתבנית ואת QuickChange-XL אתר מכוונת mutagenesis Kit (Stratagene), מוטציה שאריות VCB LLDLQ AAALQ כדי להשיג pGEX-5X-vCBmut. אמת על ידי רצף.
  3. אקספרס GST ואת החלבונים היתוך GST-VCB ו GST-vCBmut ב E. coli (BL21 DE3), לטהר באמצעות גלוטתיון-Sepharose, elute מן החרוזים עם גלוטתיון מופחתת, dialyze נגד PBS, ולקבוע את ריכוז החלבון.
  4. 3 לייבל microcentrifuge צינורות: GST, GST-VCB, ו-GST vCBmut, ולהוסיף 1 מ"ל של PBS, 30 μl של slurry גלוטתיון-Sepharose 50% (v / v) במאגר, ו -50 מיקרוגרם של dialized GST, GST -VCB, או GST-vCBmut חלבונים היתוך.
  5. סובב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי לאפשר מחייב.
  6. שטפו את החרוזים 2 פעמים עם PBS ו פעם 1 עם חיץ א הוסף 1 מ"ל של תמצית שמרים cytosolic - מוכן כמתואר חלק 4 - אל צינור אחד.
  7. סובב את צינורות 1 ש 'ב 4 ° C, ספין 10 שניות ב 5000 XG כדי גלולה את החרוזים, להשליך supernatant, ובמהירות לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם חיץ זמן המכיל 0.1% Triton X-100, ו 1 עם חיץ א
  8. ספין למטה חרוזים עוד פעם אחת ושימוש טיפ טעינת ג'ל נוזלי כמו להסיר כמה שיותר. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן -20 ° C כדי להמשיך במועד מאוחר יותר.
  9. הוסף 15 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ל צינור אחד, דגירה על 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 10 שניות ו - ספין ב 5000 x ז
  10. ניתוח דגימות ידי immunoblotting באמצעות נוגדן לשרשרת כבדה clathrin. תוצאות צפויות: clathrin נקשר GST-VCB אך לא GST או GST-vCBmut. כמו כן לנתח דגימות על ידי SDS-PAGE לאשר טעינת דומה של חלבונים היתוך GST.

6. Co-immunoprecipitation assay

  1. 3 לייבל microcentrifuge צינורות: WT (סוג בר SLA1), sla1 AAA ו sla1Δ, ולהוסיף 1 מ"ל של PBS, 30 μl של חלבון 50% (v / v) A-Sepharose slurry במאגר, ו -2 מיקרוגרם של ארנב נגד Sla1p נוגדן.
  2. סובב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. שטפו את החרוזים פעמיים עם PBS ו פעם 1 עם חוצץ המכיל 1% Triton X-100.
  4. הוסף 1 מ"ל של תמציות שמרים המקביל סך שהוכנו חלק 4: SLA1, sla1 AAA ו sla1Δ. סיבוב 1 ש 'ב 4 ° C.
  5. ספין 10 שניות ב 5000 XG כדי גלולה את החרוזים, להשליך supernatant, ובמהירות לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם מאגר המכיל 0.1% Triton X-100, ו פעם 1 עם חיץ א
  6. ספין למטה חרוזים עוד פעם אחת ושימוש טיפ טעינת ג'ל נוזלי כמו להסיר כמה שיותר. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן -20 ° C כדי להמשיך במועד מאוחר יותר.
  7. הוסף 15 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ל צינור אחד, דגירה על 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 10 שניות ו - ספין ב 5000 x ז
  8. ניתוח דגימות ידי immunoblotting באמצעות נוגדן לשרשרת כבדה clathrin. תוצאות צפויות: clathrin שיתוף immunoprecipitates עם Sla1p סוג בר, אבל לא עם sla1 AAA, או במדגם sla1Δ.

7. נציג תוצאות

איור 1
באיור 1. ניתוח מתאם Sla1p clathrin באתרים endocytic על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי. אחת מסגרת (משמאל) מתוך וידאו ו kymographs המקביל (מימין) של תאים שמרים להביע Sla1-GFP או sla1 AAA-GFP נושאת מוטציה LLDLQ AAALQ. שניהם סוג בר מוטציה Sla1-GFP באו לידי ביטוי מתוך מוקד SLA1 אנדוגני. אתרי Endocytic הם נצפו כמו כתמים בהירים מופץ בפריפריה תא (תמונות משמאל). השטח בין קווים לבנים מתאים לאזור שממנו kymographs נוצרו. סרטים צולמו על מסגרת בשיעור של 1 מסגרת / sec. שימו לב חיים ארוך יותר Sla1-GFP ב LLDLQ כדי AAALQ מוטציה (sla1 AAA) לעומת סוג בר (SLA1).

איור 2
איור 2. אינטראקציה פיזית בין clathrin ותיבת Sla1p-variant clathrin. GST התמזגו Sla1p שבר aa798-813 המכיל את רצף LLDLQ (GST-VCB), המקביל AAALQ מוטציה (GST-vCBmut) או GST לבד (GST) היו חייבים גלוטתיון-Sepharose חרוזים מודגרות עם לחלץ cytosolic מ פראי שמרים מסוג תאים. חלבונים הקשורים היו eluted ונותחו על ידי immunoblotting (IB) עבור שרשרת כבד clathrin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Clathrin מצופה שלפוחית ​​(CCV) להשתתף אנדוציטוזה והובלה של Golgi טרנס רשת endosomes, מסלולים שמורים כי הם בסיסי בביולוגיה של התא האיקריוטים. הגישות המתוארת במאמר זה שיטות מועילים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים האחראים ליצירת CCV, באינטראקציות בין חלבונים מסוימים מתאם clathrin. GST-Fusion זיקה חלבון ושיתוף immunoprecipitation מבחני לאפשר בדיקת העמותה פיזי בין מתאם (מועמד) ו clathrin. GFP תיוג הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי היתר מחקרים דינמי בתאים חיים. בתאי שמרים בפרט להציע את היתרון של מניפולציה גנטית קל להציג תגיות מוטציות בגן מתאם אנדוגני ובכך שמירה על ויסות ביטוי נורמלי של חלבון מתויג / מוטציה. באופן דומה, מרכיבים clathrin או אחרים של CCV יכול להיות מתוייגים עם RFP או חלבוני ניאון אחרים כדי להקל על בדיקות הדמיה כפולה בתאים חיים 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

DF הוא נתמך על ידי גשרים-NSF המילגה דוקטורט. מיקרוסקופ השתמשו בעבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הדמיה מיקרוסקופ רשת תשתית הליבה מענק מקולורדו סטייט. העבודה על מתאמי clathrin במעבדה המחבר הוא נתמך על ידי המז"פ הזנק וקרנות איגוד הלב האמריקני בפרס 09SDG2280525 אל SD

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit Stratagene
protease inhibitor cocktail Sigma

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
  2. Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
  3. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  4. Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
  5. Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
  6. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
  7. Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
  8. Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
  9. Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
  10. Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
  11. Dell'Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network! Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
  12. Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
  13. Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
  14. Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
  15. Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
  16. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
  17. Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
  18. Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
  19. Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
  20. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
  21. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
  22. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  23. Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
<em>In vivo</em> ו <em>במבחנה</em> של אינטראקציה מתאם-clathrin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).More

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter