Summary
Clathrin-vermittelte Endozytose hängt Adapter Proteine, die Fracht Auswahl und Clathrin-Mantel Montage zu koordinieren. Hier beschreiben wir Verfahren, die Adapter-Clathrin physikalische Interaktion und Live Cell Imaging Ansätze benutzt als Modell die Hefe endocytischen Adapter-Protein Sla1p studieren.
Abstract
Ein großer endocytischen initiiert mit der Bildung von Clathrin-coated Vesikel (CCVS), dass der Transport Fracht von der Zelloberfläche bis 1-6 Endosomen. CCVs sind durch eine polyedrische Gitter Clathrin, dass Coats die Vesikelmembran aus und dient als mechanischer Gerüst. Clathrin Mäntel sind während der Vesikelbildung aus einzelnen Clathrin triskelia, die lösliche Form von Clathrin von drei schweren und drei leichten Kette Untereinheiten zusammengesetzt 7,8 montiert. Da die triskelion nicht über die Fähigkeit, sich an die Membran direkt zu binden, sind Clathrin-bindenden Adapter entscheidend für die Bildung von Clathrin Gitter an der Membran Link durch die Verbindung mit Lipiden und / oder Membranproteine 9. Adapter auch Paket Transmembranprotein Fracht, wie Rezeptoren und können untereinander und mit anderen Komponenten des CCV-Maschinerie 9 interagieren.
Über zwanzig Clathrin-Adapter sind beschrieben worden, mehrere sind in der Clathrin vermittelten Endozytose beteiligt und andere lokalisieren, die trans-Golgi-Netzwerk oder Endosomen 9. Mit Ausnahme der HIP1R (Hefe Sla2p), binden alle bekannten Clathrin-Adapter auf die N-terminal-Propeller-Domäne des Clathrin schwere Kette 9. Clathrin-Adapter sind modular Proteinen bestehend aus gefalteten Domänen von unstrukturierten flexible Linker verbunden. Innerhalb dieser Linker Regionen, vermitteln kurze Bindungsmotive Interaktionen mit dem Clathrin N-terminalen Domäne oder andere Komponenten des Vesikelbildung Maschinen 9. Zwei verschiedene Clathrin-bindenden Motive wurden definiert: die Clathrin-Box und die W-Box-9. Der Konsens Clathrin-Box-Sequenz wurde ursprünglich definiert als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, aber Varianten wurden anschließend 11 entdeckt. Das W-Feld entspricht der Reihenfolge PWxxW (wobei x jede Rückstand).
Sla1p (Synthetic Lethal mit Actin bindendes Protein-1) wurde ursprünglich als ein Aktin-assoziierten Protein identifiziert und ist notwendig für den normalen Aktin-Zytoskelett Struktur und Dynamik bei endocytischen Standorten in Hefezellen 12. Sla1p bindet auch die NPFxD endocytischen Sortierung Signal und ist entscheidend für die Endozytose von Fracht mit der NPFxD Signal 13,14. In jüngerer Zeit Sla1p Es wurde gezeigt, binden durch ein Motiv ähnlich wie die Clathrin Box, LLDLQ Clathrin, bezeichnet eine Variante Clathrin-box (VCB), und als endocytischen Clathrin Adapter 15-Funktion. Darüber hinaus hat Sla1p zu einem weit verbreiteten Marker für die endocytischen Mantel in lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie Studien 16. Hier verwenden wir Sla1p als Modell, Ansätze für Adapter-Clathrin Studien zu Wechselwirkungen zu beschreiben. Wir konzentrieren uns auf Live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie, GST-Pull-Down-und Co-Immunopräzipitation Methoden.
Protocol
1. Der Einbau eines GFP-Tag und Selektionsmarker in der SLA1 Gen
Übernehmen Sie die Longtine Methode 17, um eine GFP-Tag direkt Sicherung am 3 'Ende des Gens SLA1 open reading frame (Sla1p C-Terminus) und gleichzeitig markieren das Gen mit dem E. coli kan r-Gen, das für die G418-Selektion ermöglicht.
- Generieren Sie ein DNA-Fragment mittels PCR unter Verwendung als Vorlage das Plasmid pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 und den folgenden Primern: vorwärts, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 'und reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. Die unterstrichene Sequenz entspricht der SLA1 Gen spezifischen Segment unmittelbar vor (Vorwärts-Primer) und nach dem Stop-Codon (Reverse-Primer). Isolieren Sie die PCR-Produkt durch Agarosegelelektrophorese von DNA-Aufreinigung gefolgt.
- Bereiten Sie eine 50 ml Kultur S. cerevisiae SEY6210 Stamm (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) 19 in YPD, wächst in den frühen logarithmischen Phase (OD 600 = 0,2 bis 0,6). Spin bei Raumtemperatur für 3 min bei 2.000 xg, zweimal waschen mit sterilem Wasser.
- Transform des PCR-Fragments in Schritt 1 in den Zellen unter Verwendung des Lithium-Acetat Verfahren 20 erhalten. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml sterilem Wasser, 1 ml YPD und Inkubation für 4 h bei 30 ° C in einem Shaker.
- Verbreiten Sie die Zellen auf YPD-G418-Platten für G418-resistente Transformanten, bei 30 ° C für 2-3 Tage inkubiert wählen. Pick-Kolonien und streifenfrei sie auf YPD-G418-Platten.
- Mit Kolonie-PCR, identifizieren Transformanten, in denen die GFP-kan-Modul korrekt mit der SLA1 Gensequenzen durch homologe Rekombination integriert wurde. Verwenden Sie ein Forward-Primer, die glüht im SLA1 open reading frame und ein Reverse-Primer, der glüht im Inneren des GFP-kan-Modul. Identifizieren Kolonien, die PCR-Produkte der erwarteten Größe und überprüfen Sie durch Sequenzierung.
- Bildschirm die Kolonien durch Fluoreszenzmikroskopie zu bestätigen haben sie GFP-Fluoreszenz.
2. Mutation der Variante Clathrin Box (VCB) in der SLA1 Gen
- Einführung eines LLDLQ zu AAALQ Mutation im Gen SLA1 (Nukleotide 2407-2415) nach einem zweistufigen Ansatz 15.
- Zunächst verstärken SLA1 Nukleotide 1207-1410 und 2427-2589 durch PCR und Klonierung der Fragmente in NotI / BamHI und EcoRI / SalI von pBluescriptKS jeweils.
- Subklon in die BamHI / EcoRI-Sites eine PCR-Fragment, das URA3.
- Cleave das resultierende Plasmid mit NotI / SalI, isolieren die URA3-Fragment von Gelreinigung und führen sie durch Lithium-Acetat-Transformation in die SLA1-GFP-Stamm in Teil 1, oder in TVY614 (MATa ura3-52 leu2-3112 his3-Δ200 trp1 generiert -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 PEP4:: LEU2 PRB1: hisG PRC1:: HIS3) 21.
- Verbreiten Sie die Zellen auf SD ergänzt Platten ohne Uracil. Bestätigen Sie mit der Kolonie-PCR und Sequenzierung, dass die Ura +-Kolonien gut integrierten URA3 enthält anstelle der VCB-Fragment.
- In einem zweiten Schritt Subklon SLA1 Nukleotide 1207-2589 in NotI / SalI von pBluescriptKS. Mit den QuickChange-XL Mutagenese-Kit (Stratagene), mutieren die VCB-Rückstände LLDLQ zu AAALQ. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung.
- Cleave das resultierende Konstrukt mit BSGI / AgeI, und zu isolieren, die Mutante VCB mit Fragment durch Gel-Reinigung. Cotransform die BSGI / AgeI Fragment mit pRS313 (HIS3) 22 in den Stamm in Teil 2.3.
- Verbreiten Sie die Zellen auf SD-Platten ergänzt fehlende Histidin. Replica-Platte Sein + Kolonien auf Agar-Medium mit 5-fluorotic Säure zu Zellen, in denen das mutierte Sequenzen ersetzt URA3, damit die Regeneration des SLA1 Gen, das die LLDLQ zu AAALQ Mutation (SLA1 AAA) zu identifizieren. Bestätigen Sie mit der Kolonie-PCR und Sequenzierung.
3. Fluoreszenzmikroskopie
- Wachsen die Hefestämme SLA1-GFP und SLA1 AAA-GFP in Teil 1 und 2 in 4 ml ergänzt SD-Medien bei 30 ° C in einem Rotator in der Dunkelheit erzeugt bis zum Erreichen einer OD 600 = 0,1 bis 0,4. Spin 1 ml Kultur in Mikrozentrifuge bei 4.000 xg für 1 min bei Raumtemperatur. Discard ~ 950 ul Überstand. Die Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit (~ 50 ul).
- Kaution 3 ul der Zellsuspension auf eine Mikroskopie Objektträger geben und mit einem Deckglas. Schützen Sie die Probe aus Licht.
- Montage auf einer 100x Ölimmersionsobjektiv eines Spinning-Disc konfokalen Mikroskop-Objektträger.
- Suchen richtigen Brennebene Zellen mit Hellfeld oder 488 nm Laser mit geeigneten Filtern zu begeistern und zu erkennen Fluoreszenz von GFP.
- Erfassen Zeitraffer-Bilder von SLA1-GFP und SLA1 AAA-GFP in Zellen mit Belichtungszeit von 500 ms (oder den entsprechenden Wert) bei einern Abstand von einem Bild pro Sekunde für 150 Sekunden. Erwartetes Ergebnis: GFP-markierten Tränenpünktchen wird auf der inneren Oberfläche der Grenzmembran der Zelle angezeigt wird, bestehen für mehrere Sekunden, und bewegen sich zur Mitte der Zelle das Signal schnell verschwindet (Angabe Mantel Demontage).
- Wählen Sie einen Teil eines Bildes, in dem Flecken gesehen zu erscheinen, bleiben für einige Sekunden, und wieder verschwinden. Crop diesem Abschnitt des Bildes für jeden Frame der Zeitraffer-Bilder.
- Generieren Sie ein Kymographion repräsentiert dieser Bereich des Bildes in jedem Frame der 150 Sekunden Zeitraffer-Bild, indem Sie die Bilder entlang einer Achse entspricht der Zeit vergangen ist.
- Berechnen Sie die Dauer der einzelnen Punkt auf, wie viele Sekunden (Time-Lapse-Frames) der Spots ist in der Kymographion basiert. Beachten Sie, dass jeder Ort sollte "Kurve" in Richtung des Inneren der Zelle, wie es verschwindet, was Endozytose und Abbau des Fells.
- Vergleichen Wildtyp SLA1-GFP mit SLA1 AAA-GFP. Wiederholen, um festzustellen, ob die Ergebnisse statistisch signifikant sind. Erwartetes Ergebnis: SLA1 AAA-GFP-Spots bestehen signifikant länger (~ 80 sec) als der Wildtyp (~ 30 sec) einen Defekt in Mantel Bildung 15.
4. Vorbereitung der Hefe zytosolischen Extrakt und insgesamt Zellextrakt
- Inoculate 3 Liter YPD mit einem geeigneten Hefestamm, wie TVY614 21 und wachsen bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator bis zum Erreichen einer OD 600 = 1-2.
- Centrifuge der Hefekultur bei Raumtemperatur für 20 min bei 3.700 x g. Überstand verwerfen, add 3-5 ml sterilem Wasser und Pipette auf und ab, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist.
- Gießen Sie ~ 150 ml flüssigem Stickstoff in einem 250 ml Kunststoffbecher. Flash-Freeze der Hefe durch Zutropfen in den flüssigen Stickstoff in einem kreisförmigen Muster auf Agglutination der gefrorenen Pellets zu vermeiden. Lassen Sie sich nicht die Pellets auftauen, fügen Sie mehr flüssigem Stickstoff, wenn nötig.
- Gefühlt einem Edelstahl-Mixer-Container durch Gießen flüssiger Stickstoff in ihm. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff fast vollständig verdampfen. Fügen Sie die gefrorene Hefe Pellets in die kalte Mixerbehälter. Schließen Sie den Mixer Behälter mit einem kalten Gummistopfen und schleifen die Hefe Pellets für 10 Sekunden. Kehren Sie die Behälter 3-4 mal um den Inhalt zu mischen und wiederholen Sie den Mahlvorgang zweimal. Der Boden gefroren Hefe wird ein Pulver-Aussehen.
- Gefühlt einem Trichter und einem 50 ml konischen Rohr mit flüssigem Stickstoff. Mit der kalten Trichter, übertragen Sie die Masse Hefe mit dem Rohr. Der gefrorene Boden Hefe kann gespeichert werden bei -80 ° C oder sofort verwendet.
- Um eine zytosolische Extrakt für die GST-Fusionsprotein Affinität Test (Teil 5), Gewicht 3 g des gefrorenen Boden TVY614 Hefe in einem 15 ml konischen Rohr und resuspendieren in 3 ml Raumtemperatur Puffer A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma).
- Cap und das Röhrchen mehrere Male, bis sie vollständig aufgetaut und dann auf Eis gelegt.
- Ultrazentrifuge der Extrakt bei 4 ° C für 20 min bei 300.000 x g. Vorsichtig den Überstand (zytosolische Extrakt) zu einem konischen Rohr mit einer Pipette, ohne das Pellet. Halten Sie die zytosolische Extrakt auf Eis.
- Geben Sie 100 ul einer 50% (v / v) Glutathion-Sepharose Suspension in Puffer A. Es ist zweckmäßig, das Ende der Spitze abgeschnitten, um zu erleichtern Pipettieren der Perlen. Drehen bei 4 ° C für 15 min, Spin-down der Beads durch Zentrifugation bei 4 ° C für 2 min bei 1.000 xg und den Überstand (zytosolische Extrakt) in ein frisches Röhrchen. Reserve 50 pl des Extraktes für die Eingabe kontrollieren.
- Um insgesamt Zellextrakten für Co-Immunopräzipitation Experimenten (Teil 6), verwenden Sie belasten TVY614 (WT SLA1), die SLA1 AAA Belastung Bei dem mit LLDLQ zu AAALQ Mutation in Teil 2 in TVY614 Hintergrund erzeugt, und ein SLA1 Stamm, der eine Deletion der SLA1 Gen wie GPY3130 23. Gewicht 2 g der entsprechenden gefrorenen Boden Hefe in konische Rohre und resuspendieren sie in 2 ml Raumtemperatur Puffer A, mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma) und 2% Triton X-100.
- Cap und das Röhrchen mehrere Male, bis sie vollständig aufgetaut und dann auf Eis inkubieren für 10 min, in regelmäßigen Abständen Mischen durch Umdrehen.
- Das Material in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin bei 4 ° C für 15 min bei 16.000 xg (Höchstgeschwindigkeit in Mikrozentrifuge). Vorsichtig den Überstand (insgesamt Zellextrakt) zu einem konischen Rohr auf Eis mit einer Pipette, ohne das Pellet.
- Geben Sie 100 ul einer 50% (v / v) Protein A-Sepharose Suspension in Puffer A. Drehen bei 4 ° C für 15 min, Spin-down der Beads durch Zentrifugation bei 4 ° C für 2 min bei 1.000 xg und Transfer der Überstand (Gesamtextrakt) in ein frisches Röhrchen. Reserve 50 pl des Extraktes für die Eingabe kontrollieren.
5. GST-Fusionsprotein Affinität Test
- Amplify von PCR ein Fragment containing der Sla1p Variante Clathrin-box (VCB) (Rückstände von 803 bis 807), Klon es in pGEX-5X, um pGEX-5X-VCB zu erhalten. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung.
- Mit pGEX-5X-VCB als Vorlage und die QuickChange-XL Mutagenese-Kits (Stratagene) site-directed, mutieren die VCB-Rückstände LLDLQ zu AAALQ um pGEX-5X-vCBmut erhalten. Stellen Sie sicher durch Sequenzierung.
- Express GST und die Fusionsproteine GST-VCB-und GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), reinigen unter Verwendung von Glutathion-Sepharose eluieren von den Perlen mit reduziertem Glutathion, gegen PBS dialysiert und bestimmen Proteinkonzentration.
- Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen: GST, GST-VCB und GST-vCBmut und 1 ml PBS, 30 ul einer 50% (v / v) Glutathion-Sepharose Suspension in Puffer A und 50 ug dialized GST, GST -VCB-oder GST-vCBmut Fusionsproteine.
- Drehen Sie bei Raumtemperatur für 30 min bis zur Bindung ermöglichen.
- Waschen Sie die Perlen 2-mal mit PBS und 1 mal mit Puffer A. 1 ml Hefe zytosolischen Extrakt - wie in Teil 4 beschrieben - in jedes Röhrchen.
- Drehen Sie die Rohre 1 h bei 4 ° C, Spin 10 sec bei 5.000 xg für Pellet die Perlen, Überstand verwerfen und schnell waschen die Perlen 3-mal mit Puffer A mit 0,1% Triton X-100 und 1 Mal mit Puffer A.
- Spin down die Perlen ein weiteres Mal und mit einer Spitze für Gel so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt fortzusetzen.
- Add 15 ul 2x Laemmli-Probenpuffer in jedes Röhrchen, bei 96 ° C für 5 min inkubieren und Spin 10 sec bei 5.000 x g.
- Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen den Clathrin schwere Kette. Erwartete Ergebnisse: Clathrin bindet an GST-VCB aber nicht GST oder GST-vCBmut. Auch die Proben analysieren durch SDS-PAGE, um ähnliche Belastung der GST-Fusionsproteine zu bestätigen.
6. Co-Immunpräzipitationsassay
- Label 3 Mikrozentrifugenröhrchen: WT (Wildtyp SLA1), SLA1 AAA und sla1Δ und 1 ml PBS, 30 ul einer 50% (v / v) Protein A-Sepharose Suspension in Puffer A, und 2 ug eines Kaninchen-Anti-Sla1p Antikörper.
- Drehen Sie bei Raumtemperatur für 30 min.
- Waschen Sie die Kugeln zweimal mit PBS und 1 mal mit Puffer A mit 1% Triton X-100.
- 1 ml der entsprechenden insgesamt Hefeextrakte in Teil 4 vorbereitet: SLA1, SLA1 AAA und sla1Δ. Drehen 1 h bei 4 ° C.
- Spin 10 sec bei 5.000 xg für Pellet die Perlen, Überstand verwerfen und schnell waschen die Perlen 3-mal mit Puffer A mit 0,1% Triton X-100 und 1 Mal mit Puffer A.
- Spin down die Perlen ein weiteres Mal und mit einer Spitze für Gel so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt fortzusetzen.
- Add 15 ul 2x Laemmli-Probenpuffer in jedes Röhrchen, bei 96 ° C für 5 min inkubieren und Spin 10 sec bei 5.000 x g.
- Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot mit einem Antikörper gegen den Clathrin schwere Kette. Erwartete Ergebnisse: Clathrin Zusammenarbeit Immunpräzipitaten mit Wildtyp Sla1p aber nicht mit SLA1 AAA, oder in der sla1Δ Probe.
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Analyse von Sla1p Clathrin-Adapter am endocytischen Websites von lebenden Zellen Fluoreszenz-Mikroskopie. Ein Frame (links) aus einem Video und entsprechende kymographs (rechts) von Hefe-Zellen, die SLA1-GFP oder SLA1 AAA-GFP Bei dem mit LLDLQ zu AAALQ Mutation. Sowohl Wildtyp und Mutante SLA1-GFP wurden aus dem endogenen SLA1 locus ausgedrückt. Endocytischen Seiten sind als helle Flecken in der Zellperipherie (Bilder links) verteilt beobachtet. Der Bereich zwischen weißen Linien entspricht dem Bereich, aus dem kymographs generiert wurden. Filme wurden bei einer Bildrate von 1 Bild / s aufgenommen. Beachten Sie die längere Lebensdauer der SLA1-GFP in der LLDLQ zu AAALQ Mutante (SLA1 AAA) im Vergleich zum Wildtyp (SLA1).
Abbildung 2. Physische Interaktion zwischen Clathrin und der Sla1p-Variante Clathrin Box. GST fusioniert Fragment aa798-813, die die Sequenz LLDLQ (GST-VCB), die entsprechende AAALQ Mutante (GST-vCBmut) oder GST alleine (GST) Sla1p wurden an Glutathion-Sepharose-Beads gebunden und inkubiert mit einem zytosolischen Extrakt aus Wildtyp- Typ Hefezellen. Die zugehörigen Proteine wurden eluiert und durch Immunoblot (IB) für Clathrin schwere Kette analysiert.
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Discussion
Clathrin-beschichteten Vesikeln (CCV) in Endozytose und Transport vom trans-Golgi-Netzwerk zu beteiligen und Endosomen, konservierte Signalwege, die von grundlegender Bedeutung für eukaryotischen Zelle Biologie. Die Ansätze in diesem Papier beschrieben Methoden sind nützlich, um die molekularen Mechanismen, die für CCV Bildung, insbesondere Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Adapter Clathrin zu studieren. GST-Fusionsprotein Affinität und Co-Immunopräzipitation Assays erlauben Prüfung der physikalischen Verbindung zwischen einem Adapter (Kandidat) und Clathrin. GFP-Tagging-und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben dynamische Studien in lebenden Zellen. Hefezellen bieten insbesondere den Vorteil der einfachen genetischen Manipulation, um tags und Mutationen in den Adapter endogenen Gen somit die Aufrechterhaltung der normalen Ausdruck Regulierung des tagged / mutierte Protein einzuführen. Ebenso können Clathrin oder andere Komponenten des CCV mit RFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um doppelte bildgebenden Untersuchungen in lebenden Zellen 16 zu erleichtern.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
DF wird von einem NSF Brücken in die Promotion Stipendium gefördert. Das Mikroskop in dieser Arbeit verwendet wird teilweise durch das Mikroskop Imaging Network Kerninfrastruktur Zuschuss von der Colorado State University unterstützt. Die Arbeiten an Clathrin-Adapter in Laboratorium des Autors wird von CSU Start-up-Fonds und der American Heart Association ausgezeichnet 09SDG2280525 auf SD unterstützt
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene | |||
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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