Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

في الجسم الحي والدراسات في المختبر من محول - clathrin التفاعل

doi: 10.3791/2352 Published: January 26, 2011

Summary

Clathrin بوساطة الإلتقام يعتمد على البروتينات التي تنسق محول اختيار البضائع وclathrin التجمع معطف. نحن هنا وصف لدراسة الإجراءات محول clathrin التفاعل الجسدي والتصوير الخلية الحية باستخدام النهج نموذجا الخميرة البروتين محول التقامي Sla1p.

Abstract

ومسارا رئيسيا التقامي يبدأ مع تشكيل clathrin الحويصلات المغلفة (CCVs) أن نقل البضائع من سطح الخلية لالإندوسومات 1-6. وتتميز CCVs بواسطة شعرية متعددة السطوح من المعاطف التي clathrin غشاء الحويصلة وبمثابة سقالة الميكانيكية. ويتم تجميع المعاطف Clathrin خلال تشكيل حويصلة من triskelia clathrin الفردية ، النموذج القابل للذوبان من clathrin تتألف من ثلاثة الثقيلة وثلاث مفارز ضوء سلسلة 7،8. لأن triskelion لا يملك القدرة على ربط الغشاء مباشرة ، clathrin ملزم محولات حاسمة لربط شعرية تشكيل clathrin إلى غشاء من خلال الجمعيات مع الدهون و / أو بروتينات غشاء 9. مهايئات عبر الغشاء أيضا شحن حزمة البروتين ، مثل المستقبلات ، ويمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض ومع المكونات الأخرى لتشكيل لجنة تنسيق المفردات آلات 9.

وقد وصفت أكثر من عشرين محولات clathrin ، وتشارك في عدة بوساطة الإلتقام clathrin وغيرها توطين لشبكة جولجي أو عبر الإندوسومات 9. باستثناء HIP1R (Sla2p الخميرة) ، وكلها معروفة clathrin محولات ربط المحطة المجال N - - المروحة من السلسلة الثقيلة clathrin 9. محولات Clathrin هي بروتينات وحدات تتألف من المجالات مطوية متصلة بواسطة linkers مرنة غير منظم. رابط داخل هذه المناطق ، زخارف ملزمة قصيرة التوسط التفاعلات مع المجال N - محطة clathrin أو المكونات الأخرى لتشكيل حويصلة آلات 9. وقد تم تحديد متميزتين clathrin ملزم الزخارف : clathrin مربع وعلى W - 9 مربع. وقد عرفت أصلا الآراء clathrin علبة تسلسل كما L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] (10) ولكن تم اكتشافها في وقت لاحق المتغيرات 11. وW - مربع يتفق مع تسلسل PWxxW (حيث x هو أي مخلفات).

وحددت أصلا Sla1p (القاتل الاصطناعية مع ملزم أكتين 1 - البروتين) باعتبارها بروتين يرتبط أكتين وضروري لبنية الهيكل الخلوي أكتين العادي وديناميكية في مواقع التقامي في خلايا الخميرة 12. Sla1p يربط أيضا إشارة NPFxD التقامي والفرز هو أمر حاسم لالإلتقام من البضائع التي تحمل إشارة NPFxD 13،14. ووصف في الآونة الأخيرة ، وقد تجلى Sla1p ربط clathrin من خلال فكرة مماثلة لصندوق clathrin ، LLDLQ ، متغير clathrin علبة (VCB) ، وتعمل كما هو محول an clathrin التقامي 15. بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت علامة Sla1p المستخدمة على نطاق واسع للمعطف التقامي في دراسات الخلايا الحية المجهري مضان 16. هنا نستخدم Sla1p نموذجا لوصف النهج للدراسات التفاعل محول clathrin. ونحن نركز على العيش الخلية المجهر مضان ، GST - المنسدلة ، وأساليب التعاون مناعي.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إدراج علامة وعلامة اختيار GFP في الجين SLA1

تطبيق أسلوب Longtine 17 من أجل فتيل علامة GFP مباشرة في نهاية 3 'من الإطار الجين SLA1 القراءة المفتوحة (C - Sla1p محطة) وعلامة في الوقت نفسه على الجين مع هاء ص اساسه القولونية الجين الذي يسمح لاختيار G418.

  1. توليد جزء DNA بواسطة PCR به كنموذج للبلازميد pFA6a - GFP (S65T) - kanMX6 (18) والشعائل التالية : إلى الأمام ، 5' - CA AGG الجهاز المركزي للمحاسبات مجلس التعاون الخليجي AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT TTT GGA CCG TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA - 3 "، والعكس ، 5' - CA TAT TTG AGC TAG TTA TTA TTT TAT TCC ATC TTA AAA AAA TAC ATT GAG AAT CTC TTC GAA GTT TAA AC - 3". وأكد تسلسل يتوافق مع شريحة معينة الجين SLA1 السابقة مباشرة (إلى الأمام التمهيدي) ، وبعد وقف رامزة (التمهيدي العكسي). عزل المنتج عن طريق PCR agarose هلام إستشراد تليها تنقية الحمض النووي.
  2. تعد الثقافة 50 مل س. الجعوية SEY6210 سلالة (MAΤα ura3 - 52 ، leu2 - 3 ، 112 - his3 Δ200 ، trp1 - Δ901 ، lys2 - 801 ، suc2 Δ9 - GAL - MEL) 19 في YPD ، وتزايد في مرحلة مبكرة لوغاريتمي (OD 600 = 0،2-0،6). تدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق على XG 2000 ، ويغسل مرتين مع الماء المعقم.
  3. تحويل جزء PCR حصلت عليه في الخطوة 1 في الخلايا باستخدام الإجراء خلات ليثيوم 20. غسل الخلايا بالماء المعقم 1 مل ، إضافة 1 مل YPD واحتضان لمدة 4 ساعات في 30 درجة مئوية في شاكر.
  4. انتشار الخلايا على YPD - G418 لوحات لتحديد لG418 transformants المقاوم ، في احتضان 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختيار المستعمرات ومنها على خط YPD - G418 لوحات.
  5. باستخدام مستعمرة - PCR ، وتحديد transformants الذي تم بشكل صحيح وحدة متكاملة GFP - اساسه مع تسلسل الجينات التي SLA1 تأشب مثلي. استخدام التمهيدي للمضي قدما في إطار anneals SLA1 قراءة مفتوحة والتمهيدي عكس ذلك anneals داخل وحدة GFP - اساسه. تحديد المنتجات التي مستعمرات PCR لديها والتحقق من الحجم المتوقع من قبل التسلسل.
  6. الشاشة المستعمرات التي مضان المجهري للتأكد من أنهم GFP مضان.

2. طفرة في مربع متغير clathrin (VCB) في الجين SLA1

  1. بتقديم وLLDLQ إلى طفرة في جين AAALQ SLA1 (النيوكليوتيدات 2407-2415) اتباع نهج الخطوة الثانية 15.
  2. الأول ، تضخيم SLA1 النيوكليوتيدات 1207-1410 2427-2589 والتي PCR واستنساخ شظايا في مواقع NOTI / BamHI وEcoRI / سالي من pBluescriptKS ، على التوالي.
  3. Subclone في مواقع BamHI / EcoRI جزء PCR يحتوي URA3.
  4. يلتصق على البلازميد الناتج مع NOTI / سالي وعزل جزء URA3 بواسطة تنقية هلام ، وأعرض عليه التحول خلات ليثيوم في سلالة Sla1 - GFP ولدت في الجزء 1 ، أو في TVY614 (MATA ura3 - 52 - 3112 leu2 his3 - Δ200 trp1 - Δ901 lys2 - 801 - suc2 Δ9 pep4 : LEU2 prb1 : HISG prc1 : HIS3) 21.
  5. انتشار الخلايا على لوحات SD تستكمل تفتقر اليوراسيل. تأكيد من قبل PCR - مستعمرة وتسلسلها أن المستعمرات + أورا متكاملة تحتوي على URA3 صحيح استبدال جزء VCB.
  6. في الخطوة الثانية ، subclone SLA1 النيوكليوتيدات في 1207-2589 NOTI / سالي مواقع pBluescriptKS. باستخدام QuickChange - XL موقع الموجه الطفرات مجموعة (Stratagene) ، تتحول بقايا VCB LLDLQ لAAALQ. تحقق عن طريق التسلسل.
  7. يلتصق في بناء الناتج مع BsgI / AgeI ، وعزل VCB الطافرة التي تحتوي على جزء تنقية هلام. Cotransform جزء BsgI / AgeI مع pRS313 (HIS3) 22 في السلالة التي تم الحصول عليها في الجزء 2.3.
  8. انتشار الخلايا على لوحات SD تستكمل تفتقر الحامض الاميني. طبق الاصل لوحة + المستعمرات على صاحب المتوسطة أجار التي تحتوي على حامض 5 - fluorotic لتحديد الخلايا التي تسلسل استبدال URA3 متحولة ، وبالتالي تجديد الجين الذي يحتوي على sla1 LLDLQ إلى الطفرة AAALQ (sla1 AAA). تأكيد من قبل PCR - مستعمرة وتسلسلها.

3. مضان المجهر

  1. زراعة سلالات الخميرة Sla1 GFP - AAA - sla1 ولدت GFP في الجزأين 1 و 2 في 4 مل من وسائل الإعلام SD تستكمل في 30 درجة مئوية في المدورة في الظلام حتى التوصل الى OD 600 = 0،1-0،4. تدور 1ml الثقافة في microcentrifuge في 4000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل ~ 950 ميكرولتر من طاف. Resuspend الخلايا في السائل المتبقي (~ 50 ميكرولتر).
  2. إيداع 3 ميكرولتر لتعليق الخلية على شريحة المجهر ، وتغطي مع ساترة الزجاج. حماية عينة من الضوء.
  3. جبل الشريحة على هدف للنفط من الغمر 100X المجهر الغزل قرص مبائر.
  4. تحديد موقع الطائرة التنسيق الصحيح من الخلايا باستخدام brightfield إنارة أو 488 نانومتر ليزر مع مرشحات مناسبة لإثارة وكشف مضان من GFP.
  5. القبض على مرور الزمن صور Sla1 GFP - AAA - sla1 وGFP في الخلايا مع مرور الوقت تعرض مللي 500 (أو القيمة المناسبة) فين فاصلة من صورة واحدة في الثانية الواحدة لمدة 150 ثانية. النتيجة المتوقعة : punctae GFP المسمى سوف تظهر على السطح الداخلي للحد من غشاء الخلية ، وتستمر لعدة ثوان ، والتحرك باتجاه مركز الخلية حيث يختفي بسرعة إشارة (تشير إلى معطف التفكيك).
  6. تحديد جزء من الصورة التي ينظر اليها في لتظهر البقع ، تبقى لعدة ثوان ، وتختفي. محصول هذا الجزء من الصورة لكل إطار من الصور مرور الزمن.
  7. إنشاء kymograph يمثل هذا الجزء من الصورة في كل إطار للصورة 150 الوقت الفاصل بين الثانية محاذاة الإطارات على طول محور المقابلة لمرور الزمن.
  8. حساب مدة كل بقعة على أساس كم ثانية (الوقت الفاصل بين الإطارات) البقع موجودة في kymograph. علما أن كل بقعة ينبغي "منحنى" تجاه الداخلية للخلية لأنها في طريقها إلى الزوال ، والتي تعكس الإلتقام والتفكيك من معطف.
  9. قارن نوع البرية Sla1 GFP - AAA - مع sla1 GFP. أكرر لتحديد ما إذا نتائج ذات دلالة إحصائية. النتيجة المتوقعة : sla1 AAA - GFP البقع تستمر لفترة أطول كثيرا (~ 80 ثانية) من النوع البري (~ 30 ثانية) التي تشير إلى وجود خلل في تكوين طبقة 15.

4. إعداد خلاصة الخميرة عصاري خلوي ومجموع استخراج الخلايا

  1. تلقيح 3 لترات من YPD مع سلالة الخميرة المناسبة ، مثل TVY614 21 ، وينمو بمعدل 30 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى التوصل الى OD 600 = 1-2.
  2. الطرد المركزي ثقافة الخميرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في ز س 3700. تجاهل طاف ، إضافة 3-5 مل من الماء المعقم ، وماصة صعودا وهبوطا حتى يتم معلق تماما بيليه.
  3. ~ صب 150 مل من النيتروجين السائل في كوب من البلاستيك 250 مل. فلاش تجميد الخميرة عن طريق إضافة قطرة قطرة في النيتروجين السائل في نمط دائري لتجنب تراص من الكريات المجمدة. لا تدع ذوبان الكريات ، إضافة النيتروجين السائل أكثر إذا لزم الأمر.
  4. البرد a غير القابل للصدأ الحاويات الصلب خلاط بصب النيتروجين السائل في ذلك. السماح للالنيتروجين السائل لتتبخر تماما تقريبا. إضافة حبيبات الخميرة المجمدة إلى الحاوية خلاط الباردة. إغلاق الحاوية خلاط مع سدادة مطاطية الباردة وطحن الكريات الخميرة لمدة 10 ثانية. عكس المرات الحاويات لخلط محتويات 3-4 وكرر الخطوة طحن مرتين. فإن خميرة الأرض المتجمدة لها مظهر يشبه المسحوق.
  5. البرد قمعا وأنبوب 50 مل المخروطية مع النيتروجين السائل. باستخدام القمع الباردة ، ونقل خميرة الأرض إلى أنبوب. يمكن أن تكون خميرة الأرض المتجمدة في تخزين -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
  6. للحصول على استخراج عصاري خلوي لفحص البروتين تقارب GST الانصهار (الجزء 5) ، 3 غرام من وزن الأرض المتجمدة TVY614 الخميرة في أنبوب مخروطي 15 مل وresuspend في 3 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة A (HEPES 10 مم ، ودرجة الحموضة 7.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 1 ملم DTT) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني مانع الكوكتيل (سيغما).
  7. الغطاء ويقلب الأنبوب عدة مرات حتى تحسنت تماما ثم وضعت على الجليد.
  8. نابذة فائقة السرعة في استخراج عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على 300000 س ز نقل بعناية طاف (استخراج عصاري خلوي) إلى أنبوب مخروطي باستخدام ماصة دون الإخلال بيليه. الحفاظ على استخراج عصاري خلوي على الجليد.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من الطين 50 ٪ الجلوتاثيون - Sepharose (V / V) في ألف العازلة ومن المريح لخفض نهاية غيض من أجل تسهيل pipeting الخرز. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتدور إلى أسفل حبات بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في XG 1000 ، ونقل (استخراج عصاري خلوي) طاف لأنبوب جديد. الاحتياطي 50 ميكرولتر انتزاع السيطرة على المدخلات.
  10. للحصول على مقتطفات الخلية مجموع التجارب المشتركة مناعي (الجزء 6) ، واستخدام الضغط TVY614 (WT SLA1) ، وسلالة sla1 AAA يحمل LLDLQ إلى الطفرة AAALQ ولدت في الجزء 2 في TVY614 الخلفية ، وسلالة sla1 يحمل حذف SLA1 الجينات مثل GPY3130 23. وزن 2 غرام من خميرة الأرض المتجمدة المقابلة في أنابيب مخروطية وresuspend منهم في 2 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة A ، التي تحتوي على الأنزيم البروتيني مانع الكوكتيل (سيغما) وتريتون 2 ٪ X - 100.
  11. الغطاء ويقلب الأنبوب عدة مرات حتى تحسنت تماما واحتضان ثم على الثلج لمدة 10 دقيقة ، والخلط دوريا بواسطة انقلاب.
  12. نقل المواد لأنابيب microcentrifuge وتدور في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في XG 16000 (السرعة القصوى في microcentrifuge). نقل بعناية طاف (استخراج الخلايا الكل) إلى أنبوب مخروطي على الجليد باستخدام ماصة دون الإخلال بيليه.
  13. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين 50 ٪ (V / V) A - Sepharose الطين في استدارة ألف العازلة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتدور إلى أسفل حبات بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في XG 1000 ، ونقل وطاف (استخراج الكل) إلى أنبوب جديد. الاحتياطي 50 ميكرولتر انتزاع السيطرة على المدخلات.

5. GST الانصهار فحص البروتين تقارب

  1. تضخيم شظية من قبل PCR containi aنانوغرام المتغير Sla1p clathrin علبة (VCB) (بقايا 803-807) ، فإنه في استنساخ - 5X pGEX للحصول على pGEX - 5X - VCB. تحقق عن طريق التسلسل.
  2. باستخدام pGEX - 5X - VCB كقالب وQuickChange - XL موقع الموجه الطفرات مجموعة (Stratagene) ، أن تتحول إلى مخلفات VCB LLDLQ AAALQ إلى الحصول على pGEX - 5X - vCBmut. تحقق عن طريق التسلسل.
  3. أعرب عن ضريبة السلع والخدمات والبروتينات الانصهار GST - VCB وضريبة السلع والخدمات ، في vCBmut E. القولونية (BL21 DE3) ، باستخدام تنقية الجلوتاثيون - Sepharose ، أزل من الخرز مع الجلوتاثيون مخفضة ، dialyze ضد برنامج تلفزيوني ، وتحديد تركيز البروتين.
  4. تسمية أنابيب microcentrifuge 3 : ضريبة السلع والخدمات ، GST - VCB ، وضريبة السلع والخدمات vCBmut ، وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ، 30 ميكرولتر من الطين الجلوتاثيون - Sepharose 50 ٪ (V / V) في المخزن ألف ، و 50 ميكروغرام من GST dialized ، GST - VCB ، أو البروتينات الانصهار GST - vCBmut.
  5. تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للربط.
  6. تغسل حبات 2 مرات مع برنامج تلفزيوني والوقت 1 مع ألف العازلة أضف 1 مل من مستخلص الخميرة عصاري خلوي -- استعد كما هو موضح في الجزء 4 -- على كل أنبوب.
  7. تدوير أنابيب ح 1 في 4 درجات مئوية ، وتدور 10 ثانية في 5000 لXG الخرز وبيليه ، ونبذ طاف ، وتغسل حبات بسرعة 3 مرات مع العازلة التي تحتوي على ألف مرة تريتون X - 100 ، و 1 ٪ مع 0.1 ألف العازلة
  8. تدور باستمرار حبات مرة أخرى واستخدام غيض تحميل الجل السائل وإزالة أكبر قدر ممكن. عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية إلى تواصل في وقت لاحق.
  9. إضافة ميكرولتر من 15 عينة العازلة 2X Laemmli لكل أنبوب ، واحتضان في 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتدور 10 ثانية في 5000 س غ.
  10. تحليل العينات التي immunoblotting استخدام أجسام مضادة لسلسلة الثقيلة clathrin. النتائج المتوقعة : clathrin بربط GST - VCB ولكن ليس لضريبة المبيعات أو ضريبة السلع والخدمات vCBmut. تحليل العينات أيضا بواسطة SDS - PAGE لتأكيد التحميل مماثلة من البروتينات الانصهار ضريبة السلع والخدمات.

6. شارك في فحص مناعي

  1. تسمية أنابيب microcentrifuge 3 : WT (نوع البرية SLA1) ، sla1 AAA ، وsla1Δ وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني ، 30 ميكرولتر من البروتين 50 ٪ (V / V) A - Sepharose الطين في المخزن ألف ، و 2 ميكروغرام من أرنب المضادة للSla1p الأضداد.
  2. تدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. تغسل حبات مرتين مع برنامج تلفزيوني والوقت 1 مع العازلة والتي تحتوي على 1 ٪ تريتون X - 100.
  4. إضافة 1 مل من مستخلصات الخميرة مجموع المقابلة أعدت في الجزء 4 : SLA1 ، sla1 AAA ، وsla1Δ. تدوير ح 1 في 4 درجات مئوية.
  5. تدور 10 ثانية في 5000 لXG الخرز وبيليه ، ونبذ طاف ، وتغسل حبات بسرعة 3 مرات مع العازلة والتي تحتوي على 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، و 1 ألف مرة مع العازلة
  6. تدور باستمرار حبات مرة أخرى واستخدام غيض تحميل الجل السائل وإزالة أكبر قدر ممكن. عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية إلى تواصل في وقت لاحق.
  7. إضافة ميكرولتر من 15 عينة العازلة 2X Laemmli لكل أنبوب ، واحتضان في 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتدور 10 ثانية في 5000 س غ.
  8. تحليل العينات التي immunoblotting استخدام أجسام مضادة لسلسلة الثقيلة clathrin. النتائج المتوقعة : clathrin التعاون مع immunoprecipitates Sla1p نوع البرية ولكن ليس مع sla1 AAA ، أو في العينة sla1Δ.

7. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. تحليل محول Sla1p clathrin في المواقع التي تعيش التقامي الخلية المجهري مضان. إطار واحد (يسار) من شريط فيديو وkymographs المقابلة (اليمين) من خلايا الخميرة ، معربا عن Sla1 GFP أو sla1 AAA - GFP يحمل LLDLQ إلى الطفرة AAALQ. وأعرب كل من نوع البرية ومتحولة Sla1 - GFP من موضع SLA1 الذاتية. ويلاحظ التقامي المواقع والنقاط المضيئة التي توزع في محيط الخلية (الصور اليسرى). المنطقة الواقعة بين خطوط بيضاء يتوافق مع المنطقة التي تم إنشاؤها kymographs. وقد اتخذت الأفلام بمعدل الإطار الإطار من 1 / ثانية. لاحظ أطول عمرا من GFP - Sla1 في LLDLQ متحولة إلى AAALQ (sla1 AAA) بالمقارنة مع الانواع البرية (SLA1).

الشكل 2
الشكل 2. التفاعل بين المادية وclathrin مربع Sla1p clathrin المتغير. لتنصهر GST Sla1p جزء aa798 - 813 التي تحتوي على تسلسل LLDLQ (GST - VCB) ، والمقابلة AAALQ متحولة (GST - vCBmut) ، أو ضريبة السلع والخدمات وحدها (GST) كانت متجهة إلى الجلوتاثيون - Sepharose الخرز وحضنت مع استخراج عصاري خلوي من البرية نوع خلايا الخميرة. وeluted البروتينات المرتبطة بها وتحليلها بواسطة immunoblotting (IB) لclathrin السلسلة الثقيلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Clathrin الحويصلات المغلفة (CCV) المشاركة في الإلتقام والنقل من الشبكة عبر وغولجي الإندوسومات ، مسارات الحفظ التي تعتبر أساسية في بيولوجيا الخلية حقيقية النواة. النهج المبينة في هذه الورقة أساليب مفيدة لدراسة الآليات الجزيئية المسؤولة عن تشكيل لجنة تنسيق المفردات ، ولا سيما في التفاعلات بين البروتينات ومحول clathrin. GST الانصهار تقارب البروتين والمقايسات المشترك مناعي تسمح لاختبار الارتباط المادي بين محول (مرشح) وclathrin. GFP العنونة ومضان التصوير المجهري تصريح دراسات حيوية في الخلايا الحية. خلايا الخميرة في عرض خاص في الاستفادة من السهل التلاعب الجيني لإدخال العلامات والطفرات في جين محول المحلية وبالتالي الحفاظ على النظام الطبيعي التعبير عن بروتين الموسومة / تحور. وبالمثل ، يمكن الموسومة مكونات clathrin أو غيرها من CCV مع طلب تقديم العروض أو البروتينات الفلورية الأخرى لتسهيل الدراسات التصوير المزدوج في الخلايا الحية 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

معتمد من قبل مدافع الجسور جبهة الخلاص الوطني للزمالة الدكتوراة. ويدعم المجهر المستخدمة في هذا العمل في جزء من شبكة التصوير منح مجهر البنية التحتية الأساسية من جامعة ولاية كولورادو. ويدعم العمل على محولات clathrin في المختبر من قبل المؤلف ليالي CSU البدء الصناديق وجائزة جمعية القلب الاميركية 09SDG2280525 إلى SD

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit Stratagene
protease inhibitor cocktail Sigma

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
  2. Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
  3. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  4. Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
  5. Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
  6. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
  7. Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
  8. Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
  9. Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
  10. Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
  11. Dell'Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network! Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
  12. Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
  13. Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
  14. Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
  15. Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
  16. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
  17. Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
  18. Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
  19. Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
  20. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
  21. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
  22. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  23. Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
<em>في الجسم الحي</em> والدراسات <em>في المختبر</em> من محول - clathrin التفاعل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).More

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter