In vivo et in vitro de l'adaptateur-clathrine Interaction

Summary

Clathrine endocytose dépend de protéines adaptatrices qui coordonnent la sélection de fret et de l'assemblage manteau de clathrine. Nous décrivons ici les procédures pour étudier l'adaptateur clathrine interaction physique et imagerie des cellules vivantes approches utilisant comme modèle la levure Sla1p endocytose protéine adaptatrice.

Abstract

Une importante voie endocytaire initie avec la formation de vésicules recouvertes de clathrine (CCV) que les cargaisons de transport de la surface de la cellule vers les endosomes ^1-6. CCVS sont distingués par un treillis polyédriques de la clathrine qui recouvre la membrane de la vésicule et sert mécaniques échafaud. Manteaux de clathrine sont assemblés lors de la formation des vésicules de clathrine triskelia individuelles, la forme soluble de la clathrine composée de trois lourdes et trois sous-unités de la chaîne légère ^7,8. Parce que le triskelion n'a pas la capacité de se lier à la membrane directement, la clathrine contraignante adaptateurs sont indispensables pour relier le réseau formant la clathrine à la membrane par l'association avec les lipides et / ou protéines de la membrane ^9. Adaptateurs également des marchandises protéines transmembranaires emballage, tels que des récepteurs, et peuvent interagir les uns avec les autres et avec les autres composantes de la formation CCV machines ^9.

Plus de vingt adaptateurs de clathrine ont été décrites, plusieurs sont impliqués dans l'endocytose médiée clathrine et d'autres localiser dans le réseau trans de Golgi ou les endosomes ^9. À l'exception de HIP1R (levure Sla2p), toutes les cartes connues clathrine se lier au domaine N-terminal-hélice de la chaîne lourde clathrine ^9. Adaptateurs de clathrine sont des protéines modulaires constitués de domaines reliés par replié non structurées lieurs. Dans ces régions linker, courts motifs de liaison avec la médiation des interactions clathrine domaine N-terminal ou d'autres composantes de la formation des vésicules machines ^9. Deux distinctes clathrine motifs de liaison ont été définis: la boîte clathrine et le W-box ^9. Le consensus de clathrine boîte de séquence a été initialement défini comme L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] ^10, mais des variantes ont été découvert par la suite ^11. Le W-box est conforme à la séquence PWxxW (où x est un résidu).

Sla1p (synthétique létale avec l'actine binding protein-1) a été initialement identifié comme une protéine actine associé et est nécessaire pour la structure normale cytosquelette d'actine et la dynamique des sites endocytose dans les cellules de levure ^12. Sla1p lie également le signal de tri NPFxD endocytose et est essentielle pour l'endocytose des marchandises portant le signal de NPFxD ^13,14. Plus récemment, Sla1p a été démontré pour lier la clathrine par un motif similaire à la boîte de clathrine, LLDLQ, appelée variante de la clathrine boîte (VCB), et de fonctionner comme un adaptateur endocytose clathrine ^15. En outre, Sla1p est devenu un marqueur couramment utilisé pour la couche endocytose dans les études de cellules vivantes de microscopie par fluorescence ^16. Ici, nous utilisons Sla1p comme un modèle pour décrire les approches pour les études d'interaction adaptateur clathrine. Nous nous concentrons sur la microscopie à fluorescence des cellules vivantes, GST-pull down, et co-immunoprécipitation méthodes.

Protocol

1. L'incorporation d'une balise de la GFP et marqueur de sélection dans le gène SLA1

Appliquer la méthode Longtine ¹⁷ afin de fusionner une étiquette GFP directement à l'extrémité 3 'du cadre ouvert de lecture du gène SLA1 (Sla1p C-terminale) et simultanément marquer le gène avec les E. coli ^Kanr gène qui permet la sélection G418.

1. Générer un fragment d'ADN par PCR en utilisant comme modèle le plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 ¹⁸ et les amorces suivantes: avant, 5'-CA AGG CAA CCG AAC ATA TTC AAT GCT LOI GCA ACT AAT GCC TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', et renverser, 5'-CA TAT AGC TTG TTT GCT TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CCT GTT TAA AC-3'. La séquence soulignée correspond au segment SLA1 gène spécifique qui précède immédiatement (Amorce) et en suivant le codon stop (amorce reverse). Isoler le produit de PCR par électrophorèse sur gel agarose suivie d'une purification d'ADN.
2. Préparer une culture de 50 ml S. cerevisiae SEY6210 souche (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, SUC2-Δ9 GAL-MEL) ¹⁹ au YPD, de plus en plus à la phase logarithmique précoce _(DO600 = 0,2-0,6). Spin à température ambiante pendant 3 min à 2000 xg, laver deux fois avec de l'eau stérile.
3. Transformer le fragment de PCR obtenu à l'étape 1 dans les cellules en utilisant la procédure d'acétate de lithium ^20. Laver les cellules avec 1 ml d'eau stérile, ajouter 1 ml YPD et incuber pendant 4 h à 30 ° C dans un shaker.
4. Fais les cellules sur YPD-G418 plaques de sélectionner pour le G418 transformants résistants, incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. Prélever des colonies et la strie eux sur YPD-G418 plaques.
5. En utilisant la colonie-PCR, d'identifier les transformants dans lequel le module GFP-kan a été bien intégré au SLA1 séquences du gène par recombinaison homologue. Utilisez une amorce sens que recuits dans le cadre de lecture ouvert SLA1 et une amorce inverse qui s'apparie à l'intérieur du module de la GFP-kan. Identifier les colonies qui ont des produits de PCR de la taille attendue et vérifier par séquençage.
6. Ecran des colonies par microscopie à fluorescence pour confirmer qu'ils ont fluorescence de la GFP.

2. Mutation de la boîte de variante de la clathrine (VCB) dans le gène SLA1

1. Introduire un LLDLQ à la mutation dans le gène de AAALQ SLA1 (nucléotides 2407-2415), après une approche en deux étapes ^15.
2. Tout d'abord, d'amplifier SLA1 nucléotides 1207-1410 et de 2427-2589 par PCR et clone les fragments dans les sites Notl / BamHI et EcoRI / Sall de pBluescriptKS, respectivement.
3. Sous-clone dans les sites BamHI / EcoRI contenant un fragment de PCR URA3.
4. Enchaînement avec le plasmide résultant Notl / Sall, isoler le fragment URA3 par purification sur gel, et l'introduire par transformation d'acétate de lithium dans la souche SLA1-GFP générées dans la partie 1, ou dans TVY614 (MATa ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 pep4:: LEU2 PRB1:: hisG PRC1:: HIS3) ^21.
5. Fais les cellules sur des plaques complétées SD dépourvu d'uracile. Confirmez en colonie PCR et séquençage que les colonies Ura + contiennent URA3 correctement intégré remplaçant le fragment VCB.
6. Dans une seconde étape, sous-clone SLA1 nucléotides 1207-2589 en Notl / Sall sites de pBluescriptKS. Utilisation de la QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit (Stratagene), muter les résidus VCB LLDLQ d'AAALQ. Vérifiez par séquençage.
7. Enchaînement avec la construction résultante BSGI / Agel, et d'isoler le VCB mutant contenant le fragment d'une purification sur gel. Cotransformée le fragment BSGI / Agel avec pRS313 (HIS3) ²² dans la souche obtenue dans la partie 2.3.
8. Fais les cellules sur des plaques complétées SD manque histidine. Réplique plaque ses colonies + sur un milieu gélosé contenant l'acide 5-fluorotique pour identifier les cellules où les séquences mutantes remplacé URA3, régénérant ainsi le gène SLA1 contenant les LLDLQ à la mutation AAALQ (SLA1 ^AAA). Confirmez en colonie PCR et séquençage.

3. La microscopie à fluorescence

1. Cultivez les souches de levure SLA1-GFP et SLA1 ^AAA-GFP générées dans les parties 1 et 2 dans 4 ml de médias SD complété à 30 ° C dans un agitateur dans l'obscurité jusqu'à atteindre une DO ₆₀₀ = 0,1 à 0,4. Spin 1 ml de culture dans microcentrifugation à 4000 xg pendant 1 min à température ambiante. Jeter ~ 950 pi de surnageant. Resuspendre les cellules dans le liquide restant (~ 50 pi).
2. Dépôt 3 ul de la suspension cellulaire sur une lame de microscope et couvrir avec une lamelle de verre. Protéger l'échantillon de la lumière.
3. Mont glisser sur un 100x immersion dans l'huile l'objectif d'un microscope confocal à filer le disque.
4. Localisez correcte plan focal de cellules en utilisant un éclairage fond clair ou 488 nm laser avec des filtres appropriés pour exciter et détecter la fluorescence de la GFP.
5. Capturez des images en accéléré du SLA1-GFP et SLA1 ^AAA-GFP dans les cellules avec des temps d'exposition de 500 ms (ou valeur appropriée) à unintervalle de n d'une image par seconde pendant 150 secondes. Résultat attendu: punctae GFP étiqueté apparaîtra sur la surface intérieure de limiter la membrane de la cellule, persister pendant plusieurs secondes, et se déplacer vers le centre de la cellule comme le signal disparaît rapidement (indiquant manteau de démontage).
6. Sélectionnez une partie d'une image dans laquelle des taches on voit apparaître, restent pendant plusieurs secondes, et disparaissent. Recadrer cette section de l'image à chaque trame des images en accéléré.
7. Générer un représentant kymographe cette section de l'image dans chaque image de la 150 secondes time-lapse d'image en alignant les cadres le long d'un axe correspondant au temps écoulé.
8. Calculer la durée de chaque spot sur la base de combien de secondes (time-lapse cadres), les taches sont présentes dans le kymographe. Notez que chaque spot devrait "courbe" vers l'intérieur de la cellule car elle tend à disparaître, ce qui reflète l'endocytose et le démontage de la robe.
9. Comparez type sauvage SLA1-GFP avec SLA1 ^AAA-GFP. Répétez cette opération pour déterminer si les résultats sont statistiquement significatifs. Résultat attendu: SLA1 ^AAA-GFP taches persistent significativement plus longue (~ 80 sec) que de type sauvage (~ 30 sec), indiquant un défaut dans la formation de ¹⁵ manteau.

4. Préparation d'extrait de levure cytosoliques et extrait cellulaire total

1. Inoculer 3 litres de YPD avec une souche de levure appropriée, comme TVY614 ^21, et de croître à 30 ° C dans un incubateur agitateur jusqu'à atteindre une DO ₆₀₀ = 1-2.
2. Centrifuger la culture de levure à la température ambiante pendant 20 min à 3700 x g. Jeter le surnageant, ajouter 3-5 ml d'eau stérile, et la pipette de haut en bas jusqu'à ce que le culot est resuspendu complètement.
3. Verser ~ 150 ml d'azote liquide dans un bécher de 250 ml en plastique. Flash-geler la levure en ajoutant goutte à goutte dans l'azote liquide dans un modèle circulaire pour éviter l'agglutination des granules congelés. Ne laissez pas le dégel boulettes, ajouter de l'azote liquide au besoin.
4. Réfrigérer une en acier inoxydable récipient du mélangeur en versant l'azote liquide en elle. Permettre à l'azote liquide à près de s'évaporer complètement. Ajouter les boulettes levure surgelée dans le récipient froid mélangeur. Fermez le récipient du mélangeur avec un bouchon de caoutchouc à froid et à broyer les pastilles de la levure pendant 10 secondes. Inverser le temps de conteneurs 3-4 à mélanger le contenu et répétez l'étape de broyage à deux reprises. La levure sol gelé aura une apparence comme de la poudre.
5. Réfrigérer un entonnoir et d'un tube conique de 50 ml avec de l'azote liquide. Aide de l'entonnoir à froid, le transfert des levures du sol dans le tube. La levure sol gelé peut être conserver à -80 ° C ou utilisé immédiatement.
6. Pour obtenir un extrait cytosolique pour le dosage de la protéine de fusion GST-affinité (partie 5), le poids de 3 g de sol gelé TVY614 levure dans un tube de 15 ml conique et remettre en suspension dans 3 ml de tampon A température ambiante (10 mM HEPES, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) contenant un cocktail d'inhibiteur de protéase (Sigma).
7. Cap et inverser le tube plusieurs fois jusqu'à ce que complètement décongelés puis mis sur la glace.
8. Ultracentrifuger l'extrait à 4 ° C pendant 20 min à 300 000 x g. Soigneusement transférer le surnageant (extrait cytosolique) à un tube conique en utilisant une pipette sans perturber le culot. Gardez l'extrait cytosolique sur la glace.
9. Ajouter 100 ul d'un 50% (v / v) de glutathione-Sépharose boue dans le tampon A. Il est commode de couper l'extrémité de la pointe, afin de faciliter pipetage des perles. Tournez à 4 ° C pendant 15 min, spin-down des billes par centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 1000 xg, et le transfert du (extrait cytosolique) surnageant dans un nouveau tube. Réserve 50 ul d'extrait pour le contrôle d'entrée.
10. Pour obtenir des extraits cellulaires totaux pour les expériences de co-immunoprécipitation (Partie 6), l'utilisation de contrainte TVY614 (WT SLA1), la souche SLA1 ^AAA portant un LLDLQ à la mutation AAALQ généré dans la partie 2 de TVY614 fond, et une souche portant une délétion SLA1 de l' SLA1 gènes tels que GPY3130 ^23. Poids 2 g de levure sol gelé correspondant dans des tubes coniques et les remettre en suspension dans 2 ml de tampon A température ambiante, contenant un cocktail d'inhibiteur de protéase (Sigma) et 2% de Triton X-100.
11. Cap et inverser le tube plusieurs fois jusqu'à ce que complètement décongelés puis incuber sur de la glace pendant 10 min, périodiquement mélanger par inversion.
12. Transfert de la matière à microtubes et de spin à 4 ° C pendant 15 min à 16000 xg (vitesse de pointe de microcentrifugeuse). Soigneusement transférer le surnageant (extrait cellulaire total) à un tube conique sur la glace à l'aide d'une pipette, sans perturber le culot.
13. Ajouter 100 ul d'une protéine de 50% (v / v) A-Sépharose boue dans le tampon A. Tournez à 4 ° C pendant 15 min, spin-down des billes par centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 1000 xg, et le transfert le surnageant (extrait total) dans un nouveau tube. Réserve 50 ul d'extrait pour le contrôle d'entrée.

5. TPS-fusion de dosage de protéines par affinité

1. Amplifier par PCR une containi fragmentng la variante Sla1p clathrine-box (VCB) (résidus 803-807), il clone dans pGEX-5X pour obtenir pGEX-5X-VCB. Vérifiez par séquençage.
2. En utilisant pGEX-5X-VCB comme un modèle et le QuickChange-XL mutagenèse dirigée kit (Stratagene), muter les résidus VCB LLDLQ d'AAALQ pour obtenir pGEX-5X-vCBmut. Vérifiez par séquençage.
3. Exprès de la TPS et les protéines de fusion GST-VCB et GST-vCBmut dans E. coli (BL21 DE3), purifier à l'aide de glutathione-Sépharose, éluer des billes avec le glutathion réduit, dialyser contre du PBS, et de déterminer la concentration de protéines.
4. Identifier les tubes à centrifuger 3: TPS, TPS-VCB, et GST-vCBmut, et ajouter 1 ml de PBS, 30 pl d'un 50% (v / v) de glutathione-Sépharose boue dans le tampon A, et 50 ug d'dialized TPS, TPS -VCB, ou des protéines de fusion GST-vCBmut.
5. Tournez à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à la liaison.
6. Laver les billes deux fois avec du PBS et 1 fois avec le tampon A. Ajouter 1 ml d'extrait de levure cytosolique - préparé comme décrit dans la Partie 4 - à chaque tube.
7. Tournez les tubes 1 h à 4 ° C, spin 10 sec à 5000 xg pour culotter les perles, éliminer le surnageant et laver rapidement les billes de 3 fois avec le tampon A contenant 0,1% de Triton X-100, et 1 fois avec le tampon A.
8. Isoler les perles une fois de plus et en utilisant une pointe de chargement de gel retirer autant de liquide que possible. A ce stade les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pour continuer à une date ultérieure.
9. Ajouter 15 ul de tampon d'échantillon de Laemmli 2x à chaque tube, incuber à 96 ° C pendant 5 min, et de spin 10 sec à 5000 x g.
10. Analyser les échantillons par immunoblot en utilisant un anticorps dirigé contre la chaîne lourde de clathrine. Résultats attendus: clathrine se lie à la TPS-VCB, mais pas à la TPS ou GST-vCBmut. Également analyser les échantillons par SDS-PAGE pour confirmer le chargement similaire de protéines de fusion de TPS.

6. Co-immunoprécipitation de dosage

1. Identifier les tubes à centrifuger 3: WT (type sauvage SLA1), SLA1 ^AAA, et sla1Δ, et ajouter 1 ml de PBS, 30 pl d'une protéine de 50% (v / v) A-Sépharose boue dans le tampon A, et 2 pg d'un lapin anti-Sla1p anticorps.
2. Tournez à température ambiante pendant 30 min.
3. Laver les billes deux fois avec du PBS et une fois avec le tampon A contenant 1% de Triton X-100.
4. Ajouter 1 ml de l'extrait correspondant de la levure total préparé dans la partie 4: SLA1, SLA1 ^AAA, et sla1Δ. Rotation 1 h à 4 ° C.
5. Spin 10 sec à 5000 xg pour culotter les perles, éliminer le surnageant et laver rapidement les billes de 3 fois avec le tampon A contenant 0,1% de Triton X-100, et 1 fois avec le tampon A.
6. Isoler les perles une fois de plus et en utilisant une pointe de chargement de gel retirer autant de liquide que possible. A ce stade les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pour continuer à une date ultérieure.
7. Ajouter 15 ul de tampon d'échantillon de Laemmli 2x à chaque tube, incuber à 96 ° C pendant 5 min, et de spin 10 sec à 5000 x g.
8. Analyser les échantillons par immunoblot en utilisant un anticorps dirigé contre la chaîne lourde de clathrine. Résultats attendus: clathrine co-immunoprécipite avec Sla1p type sauvage mais pas à des SLA1 ^AAA, ou dans l'échantillon sla1Δ.

7. Les résultats représentatifs

Figure 1. Analyse des Sla1p adaptateur clathrine sur les sites de l'endocytose par microscopie à fluorescence des cellules vivantes. Une trame (à gauche) à partir d'une vidéo et kymographs correspondante (à droite) de cellules de levure exprimant la GFP ou SLA1-SLA1 ^AAA-GFP transportant une LLDLQ à la mutation AAALQ. Tant de type sauvage et mutant SLA1-GFP ont été exprimés de la endogènes SLA1 locus. Les sites endocytaire sont observées comme des points lumineux répartis dans la périphérie de la cellule (images de gauche). La zone entre les lignes blanches correspond à la région d'où kymographs ont été générés. Films ont été prises à une cadence de 1 image / sec. Notez la durée de vie des SLA1-GFP dans les LLDLQ d'AAALQ mutant (SLA1 ^AAA) par rapport au type sauvage (SLA1).

Figure 2. Interaction physique entre la clathrine et la boîte Sla1p variante clathrine. TPS fusionnée à Sla1p fragment aa798-813 contenant la séquence (TPS-VCB) LLDLQ, correspondant AAALQ mutant (TPS-vCBmut), ou GST seule (TPS) étaient liés au glutathion-Sépharose perles et incubés avec un extrait cytosolique du sauvage Type de cellules de levure. Les protéines associées ont été élues et analysées par immunoblot (IB) pour la chaîne lourde de clathrine.

Discussion

Clathrine vésicules (CCV) de participer à l'endocytose et le transport à partir du réseau trans de Golgi et les endosomes, les voies qui sont conservés à la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. Les approches décrites dans cet article les méthodes sont utiles pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de la formation CCV, dans les interactions entre les protéines notamment adaptateur et la clathrine. L'affinité des protéines de fusion GST et de co-immunoprécipitation permettent de tester pour l'association physique entre un adaptateur (candidat) et la clathrine. GFP-tagging et l'imagerie par microscopie par fluorescence permet les études dynamiques dans des cellules vivantes. Les cellules de levure, en particulier offrent l'avantage d'une manipulation génétique facile d'introduire des balises et des mutations dans le gène endogène de l'adaptateur maintenant ainsi régulation de l'expression normale de la protéine marquée / muté. De même, les composants clathrine ou l'autre des CCV peut être étiqueté avec DP ou d'autres protéines fluorescentes pour faciliter les études d'imagerie double en ¹⁶ cellules vivantes.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit	Stratagene
protease inhibitor cocktail	Sigma