In vivo e in vitro de Estudos Adaptor-clathrin Interação

Summary

Clatrina-endocitose mediada depende de proteínas adaptadoras que coordenam a seleção de carga e montagem casaco de clatrina. Aqui nós descrevemos os procedimentos para estudar adaptador clathrin interação física e imagens de células vivas abordagens utilizando como modelo a levedura Sla1p proteína endocítica adaptador.

Abstract

A principal via endocítica inicia com a formação de vesículas revestidas por clatrina (CCVS) que transportam cargas da superfície da célula para endossomos ^1-6. CCVS distinguem-se por uma estrutura poliédrica de clatrina que reveste a vesícula de membrana e serve como um andaime mecânico. Clatrina casacos são montados durante a formação das vesículas de indivíduo triskelia clathrin, a forma solúvel de clatrina composto por três subunidades de pesos leves e três de cadeia ^7,8. Porque o triskelion não tem a capacidade de se ligar à membrana diretamente, clathrin adaptadores de ligação são críticos para ligar a malha formando clatrina para a membrana através da associação com lipídios e / ou proteínas da membrana ^9. Adaptadores também pacote de carga proteína transmembrana, como receptores, e podem interagir entre si e com outros componentes da formação CCV máquinas ^9.

Mais de vinte adaptadores clathrin têm sido descritos, diversos estão envolvidos na endocitose mediada clathrin localizar e outros para o Golgi trans rede ou endossomos ^9. Com a exceção de HIP1R (levedura Sla2p), todos os adaptadores conhecidos clathrin ligar para o domínio N-terminal da hélice da cadeia clathrin pesados ^​​9. Adaptadores são proteínas clatrina modular composta de domínios cruzados conectados por não estruturados linkers flexível. Dentro destas regiões linker, curto motivos de ligação mediar interações com o domínio N-terminal clatrina ou outros componentes da formação de vesículas máquinas ^9. Dois distintos clatrina-binding motivos foram definidos: a caixa de clatrina e do W-box ^9. O consenso seqüência clatrina-box foi inicialmente definido como L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] ^10, mas variantes foram descobertas posteriormente ^11. O W-box está em conformidade com o PWxxW seqüência (onde x é qualquer resíduo).

Sla1p (Lethal sintético com ligação às proteínas actina-1) foi originalmente identificado como uma proteína de actina associados e é necessário para a estrutura normal de actina do citoesqueleto e dinâmicas em locais endocítica em células de levedura ^12. Sla1p também se liga o sinal de triagem NPFxD endocítica e é fundamental para endocitose de carga que transportavam o sinal NPFxD ^13,14. Mais recentemente, foi demonstrado Sla1p para ligar clatrina através de um motivo semelhante à caixa de clatrina, LLDLQ, denominado uma variante caixa-clatrina (VCB), e funcionar como um adaptador endocítica clathrin ^15. Além disso, Sla1p tornou-se um marcador muito utilizado para o revestimento endocítica em células vivas estudos de microscopia de fluorescência ^16. Aqui usamos Sla1p como um modelo para descrever abordagens para estudos adaptador clathrin interação. Nós nos concentramos em microscopia de fluorescência de células vivas, GST-pull down, e co-imunoprecipitação métodos.

Protocol

1. Incorporação de uma tag GFP e marcador selecionável no gene SLA1

Aplicar o método Longtine ^17, a fim de fundir um tag GFP diretamente na extremidade 3 'do gene SLA1 quadro de leitura aberto (Sla1p C-terminal) e, simultaneamente, marcar o gene com a E. coli kan gene ^r que permite a seleção G418.

1. Gerar um fragmento de DNA por PCR usando como modelo o plasmídeo pFA6a-GFP (S65T) ^kanMX6-18 e os seguintes primers: para a frente, 5'-CA AGG AAC AAC GCC ATA AAT GCT TTC ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG ATT ATT AA-3 ', e reverter, 5'-AGC TTG CA TAT TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA GAG CTC TTC GTT TAA AC-3'. A seqüência sublinhada corresponde ao segmento de gene específico SLA1 imediatamente anterior (forward primer) e seguindo o códon de parada (primer reverso). Isolar o produto de PCR por eletroforese em gel de agarose, seguida de purificação do DNA.
2. Prepare a 50 ml cultura S. cerevisiae cepa SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) ¹⁹ em YPD, crescendo a fase logarítmica precoce (OD ₆₀₀ = 0,2-0,6). Giram em temperatura ambiente por 3 min a 2.000 xg, lave duas vezes com água estéril.
3. Transformar o fragmento de PCR obtido na etapa 1 para dentro das células usando o procedimento de acetato de lítio ^20. Lavar as células com 1 ml de água estéril, adicionar 1 ml YPD e incubar por 4 h, a 30 ° C em um agitador.
4. Espalhe a células em YPD-G418 placas selecionar para G418-resistente transformantes, incubar a 30 ° C por 2-3 dias. Escolha colônias e raia-los em YPD-G418 placas.
5. Utilizando-colônia PCR, identificar transformantes em que o módulo GFP-kan foi devidamente integrado com o SLA1 seqüências de genes por recombinação homóloga. Use uma cartilha para a frente que anneals dentro do quadro de leitura SLA1 aberto e um primer reverso que anneals no interior do módulo GFP-kan. Identificar colônias que produtos de PCR tem o tamanho esperado e verificar por seqüenciamento.
6. Tela de colônias por microscopia de fluorescência para confirmar que eles têm de fluorescência da GFP.

2. Mutação da caixa variante clatrina (VCB) no gene SLA1

1. Introduzir um LLDLQ para AAALQ mutação no gene SLA1 (nucleotídeos 2407-2415) após uma abordagem em duas fases ^15.
2. Em primeiro lugar, ampliar SLA1 nucleotídeos 1207-1410 e 2427-2589 pelo PCR e clonar os fragmentos em NotI / BamHI e EcoRI / SalI locais de pBluescriptKS, respectivamente.
3. Subclone para os sites BamHI / EcoRI um fragmento de PCR contendo URA3.
4. Cleave o plasmídeo resultante com NotI / SalI, isolar o fragmento URA3 de purificação gel, e introduzi-la por transformação de lítio de acetato para a cepa Sla1-GFP gerado na parte 1, ou em TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801-suc2 Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) ^21.
5. Espalhe a células em placas SD complementada falta uracil. Confirme colônia-PCR e seqüenciamento que o Ura + colônias conter URA3 devidamente integradas substituindo o fragmento VCB.
6. Em uma segunda etapa, subclone SLA1 nucleotídeos 1207-2589 em NotI / SalI locais de pBluescriptKS. Usando o QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), os resíduos transformam VCB LLDLQ para AAALQ. Verifique por seqüenciamento.
7. Cleave a construção resultante com BSGI / AgeI, e isolar o VCB mutante contendo fragmento de purificação gel. Cotransform o fragmento BSGI / AgeI com pRS313 (HIS3) ²² na tensão obtido na parte 2.3.
8. Espalhe as células na complementada placas SD sem histidina. Réplica da placa-Seu colônias + em meio de agar contendo ácido 5-fluorotic para identificar as células em que as seqüências mutantes substituído URA3, assim, regenerar o gene que contém a sla1 LLDLQ para AAALQ mutação (sla1 ^AAA). Confirme colônia-PCR e seqüenciamento.

3. Microscopia de fluorescência

1. Crescem as cepas de levedura Sla1-GFP e sla1 ^AAA-GFP gerado nas partes 1 e 2 em 4 ml de suplementada SD media a 30 ° C em um rotador no escuro até chegar a um OD ₆₀₀ = 0,1-0,4. Spin-1 ml de cultura em microcentrífuga a 4.000 xg por 1 min em temperatura ambiente. Descartar ~ 950 mL do sobrenadante. Ressuspender as células do líquido restante (~ mL 50).
2. Depósito mL 3 da suspensão de células sobre uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela de vidro. Proteger a amostra da luz.
3. Montagem de slides em uma objetiva de imersão em óleo 100x de um microscópio confocal girando-disco.
4. Localize plano focal correta de células usando brightfield iluminação ou a laser 488 nm com filtros adequados para excitar e detectar fluorescência de GFP.
5. Captura de lapso de tempo imagens de Sla1-GFP e sla1 ^AAA-GFP em células com tempo de exposição de 500 ms (ou o valor apropriado) em umn intervalo de uma imagem por segundo para 150 segundos. Resultado esperado: punctae GFP rotulados irá aparecer na superfície interna de limitar membrana da célula, persistir por vários segundos, e se mover em direção ao centro da célula como o sinal desaparece rapidamente (indicando casaco desmontagem).
6. Selecione uma parte de uma imagem em que pontos são vistos como aparecem, permanecem por vários segundos, e desaparecem. Safra deste seção da imagem para cada quadro das imagens de lapso de tempo.
7. Gerar um quimógrafo representando esta seção da imagem em cada quadro dos 150 imagem lapso de tempo segundo, alinhando os quadros ao longo de um eixo de correspondente ao tempo decorrido.
8. Calcular a duração de cada local com base em quantos segundos (time-lapse frames) os pontos está presente no quimógrafo. Note-se que cada ponto deve "curva" em direção ao interior da célula, uma vez que está desaparecendo, refletindo endocitose e desmontagem da pelagem.
9. Compare tipo selvagem Sla1-GFP com sla1 ^AAA-GFP. Repita o procedimento para determinar se os resultados são estatisticamente significativos. Resultado esperado: sla1 ^AAA-GFP manchas persistem significativamente maior (~ 80 seg) do que do tipo selvagem (~ 30 seg), indicando um defeito na formação da camada ^15.

4. Preparação de extrato de levedura e extracto citosólico total de células

1. Inocular 3 litros de YPD com uma cepa de levedura apropriadas, como TVY614 ^21, e crescer a 30 ° C em uma incubadora shaker até atingir uma OD ₆₀₀ = 1-2.
2. Centrifugar a cultura de levedura em temperatura ambiente por 20 min a 3.700 x g. Desprezar o sobrenadante, adicionar 3-5 ml de água estéril, e pipeta para cima e para baixo até que o chumbinho é completamente ressuspenso.
3. Despeje ~ 150 ml de nitrogênio líquido em um copo plástico de 250 ml. Flash-congelar o fermento, adicionando gotas no nitrogênio líquido em um padrão circular para evitar a aglutinação das pelotas congelados. Não deixe que o degelo pellets, adicione mais nitrogênio líquido, se necessário.
4. Frio um recipiente de aço inox liquidificador, vertendo o nitrogênio líquido. Permitir que o nitrogênio líquido para evaporar quase completamente. Adicione o fermento pellets congelados para o recipiente liquidificador frio. Feche o recipiente liquidificador com uma rolha de borracha frio e moer os pellets de levedura por 10 segundos. Inverter o recipiente 3-4 vezes para misturar o conteúdo e repita a etapa de moagem duas vezes. A levedura solo congelado terá uma aparência como um pó.
5. Frio um funil e um tubo de 50 ml com nitrogênio líquido. Utilizando o funil frio, transfira o fermento solo para o tubo. A levedura solo congelado pode ser armazenar a -80 ° C ou usado imediatamente.
6. Para obter o extrato de citosólica para o ensaio de afinidade GST-proteína de fusão (Parte 5), 3 g de peso do solo congelado TVY614 fermento em um tubo de 15 ml cônico e ressuspender em 3 ml de tampão A temperatura ambiente (10 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma).
7. Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois colocar no gelo.
8. Ultracentrífuga o extrato a 4 ° C por 20 min a 300.000 x g. Transferir cuidadosamente o (extracto citosólico) sobrenadante para um tubo cônico com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Manter o extrato citosólica no gelo.
9. Adicionar 100 l de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A. É conveniente cortar a extremidade da ponta, a fim de facilitar a pipetagem as contas. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferir o (extracto citosólico) sobrenadante para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada.
10. Para obter extratos de células total para co-imunoprecipitação experimentos (parte 6), use tensão TVY614 (WT SLA1), a cepa sla1 ^AAA carregando um LLDLQ para AAALQ mutação gerada em Part 2 em TVY614 fundo, e uma cepa sla1 carregando uma supressão do SLA1 gene, tais como GPY3130 ^23. G peso 2 da levedura terreno correspondente congelados em tubos cônicos e ressuspender-los em 2 ml de tampão A temperatura ambiente, contendo coquetel de inibidores da protease (Sigma) e 2% Triton X-100.
11. Tampa e inverter o tubo várias vezes até que esteja completamente descongelado e depois incubar no gelo durante 10 min, periodicamente, misturando por inversão.
12. Transferir o material para tubos de microcentrífuga e girar a 4 ° C por 15 min a 16.000 xg (velocidade máxima em microcentrífuga). Transferir cuidadosamente o sobrenadante (extrato celular total) para um tubo cônico no gelo utilizando uma pipeta sem perturbar o sedimento.
13. Adicionar 100 ul de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A. Gire a 4 ° C por 15 min, spin-down as contas por centrifugação a 4 ° C por 2 min a 1.000 xg, e transferência o sobrenadante (extrato total) para um novo tubo. Reserve mL 50 de extrato para controle de entrada.

5. GST-fusion ensaio de afinidade de proteínas

1. Amplificar por PCR um fragmento containing a variante Sla1p caixa-clatrina (VCB) (resíduos 803-807), cloná-lo em pGEX-5X para obter pGEX-5X-VCB. Verifique por seqüenciamento.
2. Usando pGEX-5X-VCB como um modelo e os QuickChange-XL-site dirigido mutagênese kit (Stratagene), mutação da VCB resíduos LLDLQ AAALQ para obter pGEX-5X-vCBmut. Verifique por seqüenciamento.
3. Expressar GST e proteínas de fusão GST-VCB e GST-vCBmut em E. coli (BL21 DE3), purificar usando glutationa-Sepharose, saem da contas com glutationa reduzida, diálise contra PBS, e determinar a concentração de proteína.
4. Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: GST, GST-VCB e GST-vCBmut, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de um 50% (v / v) O chorume glutationa-Sepharose em tampão A, e 50 mcg de dialized GST, GST -VCB, ou proteínas GST-vCBmut fusão.
5. Girar em temperatura ambiente por 30 min para permitir a ligação.
6. Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A. Adicionar 1 ml de extrato de levedura citosólica - preparado como descrito na Parte 4 - a cada tubo.
7. Girar os tubos de 1 h, a 4 ° C, rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% de tempo Triton X-100, e 1 com tampão A.
8. Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior.
9. Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g.
10. Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin liga-se a GST-VCB, mas não para GST ou GST-vCBmut. Também analisar as amostras por SDS-PAGE para confirmar o carregamento semelhante das proteínas de fusão GST.

6. Co-imunoprecipitação ensaio

1. Tubos de microcentrífuga etiqueta 3: WT (wild type SLA1), sla1 ^AAA, e sla1Δ, e adicionar 1 ml de PBS, 30 mL de uma proteína de 50% (v / v) A-Sepharose suspensão em tampão A, e 2 mg de um coelho de anticorpos anti-Sla1p.
2. Girar em temperatura ambiente por 30 min.
3. Lave as contas duas vezes com PBS e uma vez com tampão A contendo 1% de Triton X-100.
4. Adicionar 1 ml do correspondente total de extratos de levedura preparada na Parte 4: SLA1, sla1 ^AAA, e sla1Δ. Girar 1 h, a 4 ° C.
5. Rotação de 10 segundos a 5.000 xg para agregar as contas, descartar o sobrenadante e, rapidamente, lave as contas 3 vezes com tampão A contendo 0,1% Triton X-100, e uma vez com tampão A.
6. Spin para baixo as contas mais uma vez e usando uma ponta de carga gel remover o líquido que for possível. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C para continuar em um momento posterior.
7. Adicionar 15 mL de tampão de amostra Laemmli 2x a cada tubo, incubar a 96 ° C por 5 min e 10 seg girar em 5.000 x g.
8. Analisar as amostras por immunoblotting usando um anticorpo para a cadeia clathrin pesado. Resultados esperados: clathrin co-imunoprecipitados com Sla1p tipo selvagem, mas não com sla1 ^AAA, ou na amostra sla1Δ.

7. Resultados representante

Figura 1. Análise de Sla1p adaptador de clatrina em locais endocítica de células vivas por microscopia de fluorescência. Um quadro (esquerda) de um vídeo e kymographs correspondente (direita) de células de levedura expressar Sla1-GFP ou sla1 ^AAA-GFP carregando um LLDLQ à mutação AAALQ. Tanto do tipo selvagem e mutante Sla1-GFP foram expressas a partir do locus SLA1 endógena. Endocítica locais são observadas como pontos brilhantes distribuídos na periferia da célula (imagens à esquerda). A área entre as linhas brancas corresponde à região de onde kymographs foram gerados. Filmes foram tiradas a uma taxa de quadros de 1 frame / sec. Observe a vida útil mais longa da Sla1-GFP na LLDLQ para AAALQ mutante (sla1 ^AAA) em relação ao tipo selvagem (SLA1).

Figura 2. Interação física entre clatrina ea caixa Sla1p variante-clatrina. GST fundido a Sla1p fragmento aa798-813 contendo a seqüência LLDLQ (GST-VCB), o correspondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), ou GST sozinho (GST) eram obrigados a glutationa-Sepharose contas e incubadas com um extrato de wild-citosólica levedura células tipo. As proteínas associadas foram eluídos e analisadas por immunoblotting (IB) para cadeia pesada clatrina.

Discussion

Vesículas revestidas por clatrina (CCV) participar de endocitose e transporte do trans Golgi rede e endossomos, vias conservadas que são fundamentais para a biologia célula eucariótica. As abordagens descritas neste trabalho métodos são úteis para estudar os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela formação CCV, em especial as interações entre proteínas e adaptador de clatrina. GST-fusion afinidade proteínas e co-imunoprecipitação ensaios permitir o teste de associação física entre um adaptador (candidatos) e clatrina. GFP-tagging e imagens de microscopia de fluorescência permitir estudos dinâmicos em células vivas. Células de levedura, em especial oferecem a vantagem de manipulação genética fácil introduzir tags e mutações no gene endógeno adaptador mantendo regulação da expressão normal da proteína tag / mutante. Da mesma forma, os componentes clatrina ou outras do CCV pode ser marcado com RFP ou outras proteínas fluorescentes para facilitar estudos de imagem dupla em células vivas ^16.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit	Stratagene
protease inhibitor cocktail	Sigma