Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

В естественных условиях и в пробирке исследования Адаптер-клатрин Взаимодействие

doi: 10.3791/2352 Published: January 26, 2011

Summary

Клатрин эндоцитоза зависит от адаптера белков, которые координируют отбор грузов и клатрин сборки пальто. Здесь мы описываем процедуры для изучения адаптера клатрин физического взаимодействия и живые изображения ячейки подходов, используя в качестве модели дрожжей endocytic Sla1p белка адаптера.

Abstract

Основные endocytic пути инициирует с образованием клатриновых везикулы (CCVS), которые перевозят грузы из клеточной поверхности, чтобы эндосомы 1-6. CCVS отличаются многогранным решетки клатрин, что пальто пузырьков мембраны и служит в качестве механического эшафот. Клатрин пальто собраны во время образования пузырьков из отдельных клатрин triskelia, растворимой формы клатрин состоит из трех тяжелых и три легких цепей субъединиц 7,8. Потому что трискелион не обладают способностью связываться с мембранной напрямую, клатрин-связывающий адаптеры имеют решающее значение для формирования ссылки клатрин решетки мембраны через ассоциацию с липидами и / или мембранных белков 9. Адаптеры также пакет трансмембранный белок грузов, таких как рецепторы, и могут взаимодействовать друг с другом и с другими компонентами образование ССГ техники 9.

Более двадцати клатрин адаптеры были описаны, некоторые из них участвуют в клатрин эндоцитоза и другие локализации в транс Гольджи сеть или эндосомы 9. За исключением HIP1R (дрожжи Sla2p), все известные клатрин адаптеры связываются с N-терминал-рулевых области клатрин тяжелой цепи 9. Клатрин адаптеры являются модульными белки, состоящие из сложенных области, связанные по неструктурированной гибкие линкеры. В рамках этих компоновщик регионах, короткие связывающие мотивы посредником взаимодействий с клатрин N-концевого домена или других компонентов везикул формирование техники 9. Два различных клатрин-связывающие мотивы были определены: клатрин ящик и W-поле 9. Консенсус клатрин коробки последовательность была первоначально определена как L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, но варианты были впоследствии обнаружены 11. W-поле соответствует последовательности PWxxW (где х означает каких-либо остатков).

Sla1p (Синтетический Смертельное с актином связывающий белок-1) был первоначально идентифицирован как актин связанных белков и необходим для нормальной структуры цитоскелета актина и динамика на endocytic сайтов в клетках дрожжей 12. Sla1p также связывает NPFxD endocytic сигнал сортировки и имеет решающее значение для эндоцитоза грузов подшипников NPFxD сигнал 13,14. Совсем недавно была продемонстрирована Sla1p связывать клатрин через мотив похож на клатрин окна LLDLQ, называемый вариант клатрин-бокс (VCB), и функционировать как endocytic клатрин адаптера 15. Кроме того, Sla1p стало широко используется маркер endocytic пальто в живой клетки флуоресцентной микроскопии исследования 16. Здесь мы используем Sla1p как модель для описания подходов для адаптера клатрин исследования взаимодействия. Мы ориентируемся на живой микроскопии флуоресценции клетки, GST-кадра, и ко-иммунопреципитации методами.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Включение теги GFP и селективного маркера в SLA1 гена

Применение метода Longtine 17, чтобы предохранитель GFP теги непосредственно на конец 3 'SLA1 гена открытой рамки считывания (Sla1p С-конца) и одновременно знак ген с E. кишечной кан т ген, который обеспечивает выбор G418.

  1. Создание фрагмента ДНК с помощью ПЦР, используя в качестве шаблона плазмиды pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 и следующие грунты: вперед, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC ААТ GCT ACT GCA TCA ААТ CCG ТТТ GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT АА-3 ', а наоборот, 5'-CA ТАТ AGC ТТГ ТТТ TAG TTA TTA TCC TAT AAA УВД, TTA AAA TAC ATT ААТ GAA TTC GAG СТС GTT ТАА AC-3'. Подчеркнул последовательность соответствует SLA1 генов конкретного сегмента, непосредственно предшествующих (прямого праймера) и после стоп-кодона (обратного праймера). Изолировать продукта ПЦР методом электрофореза в агарозном геле последующей очистки ДНК.
  2. Подготовка 50 мл культуры С. CEREVISIAE SEY6210 деформации (MAΤα URA3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, TRP1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) 19 в YPD, растущие на ранней логарифмической фазы (OD 600 = 0,2-0,6). Спиновые при комнатной температуре в течение 3 мин при 2000 мкг, мыть два раза стерильной водой.
  3. Преобразование ПЦР фрагмент, полученный на шаге 1 в клетки с помощью процедуры ацетат лития 20. Вымойте клеток с 1 мл стерильной воды, добавить 1 мл YPD и инкубировать в течение 4 часов при температуре 30 ° С в шейкере.
  4. Распространение клеток на YPD-G418 пластины, чтобы выбрать для G418-устойчивых трансформантов, инкубировать при температуре 30 ° С в течение 2-3 дней. Выберите колоний и полоса их на YPD-G418 пластин.
  5. Использование колонии-ПЦР, выявление трансформантов, в которых GFP-кан модуль был надлежащим образом интегрированы в SLA1 последовательностей генов путем гомологичной рекомбинации. Использование прямого праймера, что отжигов в SLA1 открытые рамки считывания и обратного праймера, что отжигов внутри GFP-кан модуля. Определить колонии, которые ПЦР продукты ожидаемого размера и проверки путем секвенирования.
  6. Экран колоний флуоресцентной микроскопии для подтверждения они GFP флуоресценции.

2. Мутация вариант клатрин окне (VCB) в SLA1 гена

  1. Ввести LLDLQ к AAALQ мутации в гене SLA1 (нуклеотиды 2407-2415) после двухэтапный подход 15.
  2. Во-первых, усилить SLA1 нуклеотиды 1207-1410 и 2427-2589 с помощью ПЦР и клонирование фрагментов в NotI / BamHI и EcoRI / SalI сайтах pBluescriptKS, соответственно.
  3. Субклон в BamHI / EcoRI сайтах фрагмента ПЦР содержащие URA3.
  4. Клив результате плазмида с NotI / SalI, изолировать URA3 фрагмента геля очистки, и ввести его ацетат лития превращение в Sla1-GFP напряжение генерируется в части 1, или в TVY614 (МАТА URA3-52-3112 leu2 his3-Δ200 TRP1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21.
  5. Распространение клеток на дополнена SD пластин хватает урацил. Подтвердите колонии-ПЦР и секвенирования, что Ura + колониях содержатся должным образом интегрированы URA3 замену VCB фрагмента.
  6. На втором этапе, субклон SLA1 нуклеотидов в 1207-2589 NotI / SalI сайтах pBluescriptKS. Использование QuickChange-XL сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene), мутировать VCB остатков LLDLQ к AAALQ. Проверка с помощью секвенирования.
  7. Клив в результате построить с BsgI / AgeI и изолировать мутантов VCB содержащие фрагмента геля очистки. Cotransform BsgI / AgeI фрагмент с pRS313 (HIS3) 22 в штамм получен в части 2.3.
  8. Распространение клеток на дополнена SD пластин хватает гистидина. Реплика пластины Его + колоний на агар, содержащий 5-fluorotic кислоты для идентификации клеток, в которых мутантных последовательностей заменено URA3, таким образом, регенерирующим sla1 генов содержащих LLDLQ к AAALQ мутации (sla1 ААА). Подтвердите колонии-ПЦР и секвенирования.

3. Люминесцентной микроскопии

  1. Рост штаммов дрожжей Sla1-GFP и sla1 AAA-GFP генерируется в частях 1 и 2 в 4 мл дополнена SD средах при 30 ° С в ротатор в темноте до достижения OD 600 = 0,1-0,4. Спиновые 1 мл культуры в микроцентрифужных при 4000 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре. Отменить ~ 950 мкл надосадочной жидкости. Ресуспендируют клеток в оставшейся жидкости (~ 50 мкл).
  2. Депозит 3 мкл суспензии клеток на микроскопию слайдов и накройте покровным стеклом. Защита образца от света месте.
  3. Горы скользить по 100x нефтью погружения цель прядильно-диск конфокальной микроскопии.
  4. Найдите правильный фокальной плоскости клетки с использованием светлого освещения или 488 нм лазер с соответствующими фильтрами для возбуждения и обнаружения флуоресценции GFP.
  5. Захват покадровой образы Sla1-GFP и sla1 AAA-GFP в клетках с временем экспозиции 500 мс (или соответствующее значение) прин интервалом в один образ в секунду в течение 150 секунд. Ожидаемый результат: GFP помечены punctae появится на внутренней поверхности пограничная мембрана клетки, сохраняться в течение нескольких секунд, и двигаться по направлению к центру клетки как сигнал быстро исчезает (с указанием пальто разборки).
  6. Выберите часть изображения, в котором видны пятна появляются, оставаться в течение нескольких секунд, и исчезают. Crop этот раздел на изображение для каждого кадра покадровой изображений.
  7. Создание кимограф представляющих этот раздел изображения в каждом кадре 150 второй покадровой изображение, выравнивая кадры вдоль оси, соответствующей времени прошло.
  8. Рассчитать продолжительность каждого пятна в зависимости от количества секунд (покадровой кадров) пятна присутствует в кимографе. Обратите внимание, что каждое пятно должно "кривой" вглубь клетки как она исчезает, отражающие эндоцитоза и разборки покрытия.
  9. Сравните дикого типа Sla1-GFP с sla1 AAA-GFP. Повторите, чтобы определить, статистически значимые результаты. Ожидаемый результат: sla1 AAA-GFP пятна сохраняться значительно дольше (~ 80 сек), чем дикого типа (~ 30 сек) с указанием дефекта в пальто образование 15.

4. Подготовка дрожжей цитозольного экстракта и общего экстракта ячейки

  1. Привить 3 литра YPD с соответствующим штамм дрожжей, таких как TVY614 21, и расти при температуре 30 ° С в шейкере инкубаторе до достижения OD 600 = 1-2.
  2. Центрифуга культуры дрожжей при комнатной температуре в течение 20 мин при 3700 х г. Удалите надосадочную, добавить 3-5 мл стерильной воды и пипеткой вверх и вниз, пока осадок полностью ресуспендировали.
  3. Налейте ~ 150 мл жидкого азота в 250 мл стакан пластиковый. Flash-замораживания дрожжей, добавляя по каплям в жидком азоте в круговой схеме, чтобы избежать склеивания замороженных гранул. Не позволяйте гранулы оттепели, добавьте еще жидкий азот, если необходимо.
  4. Холод нержавеющей стали блендер контейнер при заливке жидкого азота в ней. Разрешить жидкий азот, чтобы почти полностью испариться. Добавить замороженных гранул дрожжей холодном контейнере блендера. Закрыть контейнер блендере с холодной резиновой пробкой и растереть дрожжи гранул в течение 10 секунд. Обратить контейнер в 3-4 раза, чтобы перемешать содержимое и повторите шаг шлифовальные дважды. Земли замороженных дрожжей придется порошок вид.
  5. Холод воронку и 50 мл коническую трубку с жидким азотом. Использование холодной воронки, передача земли дрожжей до трубы. Замороженных дрожжей землю можно хранить при температуре -80 ° С или использовать немедленно.
  6. Для получения цитозольного экстракт для GST-синтез белка сродством анализа (Часть 5), весом 3 г мерзлота TVY614 дрожжи в 15 мл коническую трубку и ресуспендируют в 3 мл буфера комнате температура (10 мМ HEPES, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT), содержащий ингибитор протеазы коктейль (Sigma).
  7. Кап, и инвертировать трубку несколько раз, пока полностью оттаять, а затем положить на лед.
  8. Ультрацентрифуге экстракта при температуре 4 ° С в течение 20 мин при 300 000 х г. Тщательно передачи супернатант (цитозольного экстракта) для конической трубе с помощью пипетки, не нарушая гранул. Держите цитозольного экстракта на льду.
  9. Добавить 100 мкл 50% (объем / объем) глутатион-сефарозой суспензии в буфере А. Это удобно резать конце наконечник для облегчения pipeting бисером. Поворот при 4 ° С в течение 15 мин, спин-вниз бисером центрифугированием при 4 ° С в течение 2 мин при 1000 мкг, а также передачу супернатант (цитозольного экстракта) в новую пробирку. Резервный 50 мкл экстракта для управления вводом.
  10. Для получения общего экстракты ячейки для совместной иммунопреципитации эксперименты (часть 6), используйте напряжение TVY614 (WT SLA1), sla1 AAA штамм, несущий LLDLQ к AAALQ мутации генерируется в части 2 в TVY614 фон, и sla1 штамм, несущий удаление SLA1 генов, таких как GPY3130 23. Вес 2 г соответствующего замороженных дрожжей землю в конических труб и ресуспендирования них в 2 мл буфера комнате температуру, содержащий ингибитор протеазы коктейль (Sigma) и 2% Тритон Х-100.
  11. Кап, и инвертировать трубку несколько раз, пока полностью оттаять, а затем инкубируют на льду в течение 10 мин, периодически перемешивания инверсии.
  12. Передача материала микроцентрифужных труб и спина при температуре 4 ° С в течение 15 мин при 16 000 мкг (максимальная скорость в микроцентрифужных). Тщательно передачи супернатант (всего извлекать ячейки) для конической трубе на льду с помощью пипетки, не нарушая гранул.
  13. Добавить 100 мкл 50% (объем / объем) белка-сефарозой суспензии в буфере А. Поворот при 4 ° С в течение 15 мин, спин-вниз бисером центрифугированием при 4 ° С в течение 2 мин при 1000 мкг, а также передачу супернатант (всего экстракт), чтобы свежие трубки. Резервный 50 мкл экстракта для управления вводом.

5. GST-синтез белка сродством анализа

  1. Amplify методом ПЦР фрагмент containiнг вариант Sla1p клатрин-бокс (VCB) (остатки 803-807), клонировать ее в pGEX-5X для получения pGEX-5X-VCB. Проверка с помощью секвенирования.
  2. Использование pGEX-5X-VCB в качестве шаблона и QuickChange-XL сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene), мутировать VCB остатков LLDLQ к AAALQ получить pGEX-5X-vCBmut. Проверка с помощью секвенирования.
  3. Экспресс GST и слитых белков GST-VCB и GST-vCBmut в E. палочка (BL21 DE3), очищают использованием глутатион-сефарозой, вымывается из бисера с восстановленный глутатион, диализировать против PBS, и определить концентрации белка.
  4. Этикетка 3 микроцентрифужных труб: GST, GST-VCB и GST-vCBmut, и добавьте 1 мл PBS, 30 мкл 50% (объем / объем) глутатион-сефарозой суспензии в буфер, и 50 мкг dialized GST, GST -VCB или GST-vCBmut слитых белков.
  5. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы обеспечить обязательную силу.
  6. Вымойте бисером 2 раза PBS и 1 раз с буфером А. Добавьте 1 мл экстракта дрожжей цитозольного - получают, как описано в Части 4 - в каждую пробирку.
  7. Поворот трубы 1 ч при 4 ° С, спин 10 сек при 5000 мкг в гранулах бусы, отбросить супернатант, и быстро вымыть бисером 3 раза буфером, содержащим 0,1% Тритон Х-100, и 1 раз в буфере А.
  8. Спином вниз бисером еще раз и с помощью кончика гель загрузки удалить как можно больше жидкости, как это возможно. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 ° C продолжить на более позднее время.
  9. Добавить 15 мкл 2х буфера образца Laemmli в каждую пробирку, инкубировать при 96 ° С в течение 5 мин, а спина 10 сек при 5000 х г.
  10. Анализ образцов иммуноблоттинга использованием антител к клатрин тяжелой цепи. Ожидаемые результаты: клатрин связывается с GST-VCB но не GST или GST-vCBmut. Кроме того, анализ образцов SDS-PAGE, чтобы подтвердить подобный загрузки белков GST синтеза.

6. Сотрудничество иммунопреципитации анализа

  1. Этикетка 3 микроцентрифужных труб: WT (дикого типа SLA1), sla1 AAA, и sla1Δ, и добавьте 1 мл PBS, 30 мкл 50% (объем / объем) белка-сефарозой суспензии в буфер, и 2 мкг кролика против Sla1p антител.
  2. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Вымойте бисером два раза PBS и 1 раз с буфером, содержащим 1% Тритон Х-100.
  4. Добавить 1 мл соответствующего общего экстракта дрожжей, подготовленный в Часть 4: SLA1, sla1 AAA, и sla1Δ. Поворот 1 ч при 4 ° C.
  5. Спиновые 10 сек при 5000 мкг в гранулах бусы, отбросить супернатант, и быстро вымыть бисером 3 раза буфером, содержащим 0,1% Тритон Х-100, и 1 раз в буфере А.
  6. Спином вниз бисером еще раз и с помощью кончика гель загрузки удалить как можно больше жидкости, как это возможно. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 ° C продолжить на более позднее время.
  7. Добавить 15 мкл 2х буфера образца Laemmli в каждую пробирку, инкубировать при 96 ° С в течение 5 мин, а спина 10 сек при 5000 х г.
  8. Анализ образцов иммуноблоттинга использованием антител к клатрин тяжелой цепи. Ожидаемые результаты: клатрин совместно иммунопреципитатах с дикими Sla1p типа, но не с sla1 ААА, или в образце sla1Δ.

7. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ Sla1p клатрин адаптера endocytic сайтов жить микроскопии флуоресценции клеток. Один кадр (слева) из видео и соответствующие kymographs (справа) дрожжевых клеток, экспрессирующих Sla1-GFP или sla1 AAA-GFP проведения LLDLQ к мутации AAALQ. Оба дикого типа и мутантных Sla1-GFP были выражены с эндогенными SLA1 локуса. Endocytic сайтов наблюдаются как яркие пятна распространяются в периферии клетки (слева изображений). Область между белыми линиями соответствует области, из которой kymographs были получены. Фильмы были приняты на частоту кадров 1 кадр / сек. Обратите внимание, больше жизни Sla1-GFP в LLDLQ к AAALQ мутант (sla1 ААА) по сравнению с диким типом (SLA1).

Рисунок 2
Рисунок 2. Физические взаимодействия между клатрин и Sla1p-вариант клатрин коробки. GST слит с Sla1p фрагмент aa798-813, содержащий последовательность LLDLQ (GST-VCB), соответствующие AAALQ мутант (GST-vCBmut), или только GST (GST) были связаны с глутатион-сефарозой бисером и инкубировали с цитозольного выписка из дикого клетки типа дрожжей. Белков, связанных с элюировали и проанализированы с помощью метода иммуноблоттинга (ИБ) для клатрин тяжелой цепи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Клатриновых везикулы (ССГ) участвовать в эндоцитоза и транспорта из транс-Гольджи сеть и эндосомы, сохраняется путей, которые являются основополагающими для эукариотических клеточной биологии. Подходов, описанных в этой статье методы полезны для изучения молекулярных механизмов, ответственных за формирование CCV, в частности, взаимодействия между белками и адаптер клатрин. GST-фьюжн сродство белков и со-иммунопреципитации анализы позволяют тестирование на физическую связь между адаптером (кандидата) и клатрин. GFP-теги и флуоресцентной микроскопии изображений разрешение динамических исследований в живых клетках. Дрожжевые клетки, в частности, предлагают преимущество легкого генетических манипуляций ввести теги и мутации в адаптер эндогенного гена позволяет поддерживать нормальную регуляции экспрессии меченых / мутировал белка. Точно так же клатрин или другим компонентам CCV могут быть помечены ППП или другие флуоресцентные белки для облегчения двойного исследования изображений в живых клетках 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

DF поддерживается NSF Мосты в доктора общения. Микроскоп используется в этой работе при частичной поддержке микроскоп изображений сети основной инфраструктуры грант Университета штата Колорадо. Работа над клатрин адаптеров в лаборатории автора с поддерживается ХСС стартовый капитал и американские награды ассоциации сердца 09SDG2280525 для SD

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit Stratagene
protease inhibitor cocktail Sigma

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
  2. Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
  3. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  4. Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
  5. Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
  6. Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
  7. Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
  8. Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
  9. Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
  10. Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
  11. Dell'Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network! Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
  12. Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
  13. Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
  14. Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
  15. Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
  16. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
  17. Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
  18. Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
  19. Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
  20. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
  21. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
  22. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  23. Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
<em>В естественных условиях</em> и <em>в пробирке</em> исследования Адаптер-клатрин Взаимодействие
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).More

Feliciano, D., Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Di Pietro, S. M. In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction. J. Vis. Exp. (47), e2352, doi:10.3791/2352 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter