Summary
Oligonucléotides peuvent être utilisés pour le site spécifiquement le remplacer par un seul nucléotide des gènes cibles transfectées dans les deux
Abstract
Parasites du genre Plasmodium, l'agent causal de la malaria, sont transmis par les piqûres de moustiques anophèles infectés résultant dans plus de 250 millions de nouvelles infections chaque année. Malgré des décennies de recherche, il n'ya toujours pas de vaccin contre le paludisme, en soulignant la nécessité de stratégies de contrôle roman. Une approche novatrice est l'utilisation de moustiques génétiquement modifiés pour lutter efficacement contre la transmission du parasite du paludisme. Altérations délibérées des voies de signalisation cellulaire chez le moustique, en passant par mutagenèse ciblée, ont été trouvés pour réguler le développement du parasite 1. De ces études, nous pouvons commencer à identifier les gènes cibles potentiels pour la transformation. Mutagenèse ciblée a toujours compté sur la recombinaison homologue entre un gène cible et une molécule d'ADN à grande. Cependant, la construction et l'utilisation de ces molécules d'ADN complexes pour la production de lignées de cellules transformées de façon stable est coûteux, fastidieux et souvent inefficace. Par conséquent, une stratégie utilisant des acides nucléiques verrouillés-oligonucleotides modifiés (LNA-ons) fournit une alternative utile pour l'introduction artificielle seule substitutions nucléotidiques dans épisomiques et chromosomiques cibles gène d'ADN (revue en 2). LNA-SUR-médiée mutagenèse ciblée a été utilisée pour introduire des mutations ponctuelles dans des gènes d'intérêt dans les cellules cultivées à la fois de la levure et de souris 3,4. Nous montrons ici que LNA-Ons peut être utilisé pour introduire un changement d'un seul nucléotide dans une cible transfectées épisomique qui se traduit par un interrupteur du bleu de protéines (BFP) l'expression fluorescentes pour la protéine verte (GFP) l'expression fluorescentes dans les deux Anopheles gambiae et Anopheles stephensi cellules . Cette conversion démontre pour la première fois que la mutagenèse efficace de gènes cibles dans les cellules de moustique peut être médiée par LNA-ons et suggère que cette technique peut être applicable à la mutagenèse des cibles chromosomiques in vitro et in vivo.
Protocol
- Avant de commencer le protocole, il est important de déterminer que les cellules de moustiques utilisés dans l'expérience sont en bonne santé et au confluent ~ 80% si adhérentes (Figure 1). Cellules envahies ou insalubres se traduira par une efficacité de transfection faible et donnera des résultats inconsistants.
- Warm up ensemble des médias avant d'utiliser dans un bain 28 ° C eau pendant 30 mn.
- A. stephensi MSQ43 cellules ont besoin de E5 moyennes: MEM, w Earle / glutamine, la chaleur de 5% FCS inactivé, 0,2% de D-glucose, 1% de pénicilline-antibiotique streptomycine et 1% non-acides aminés essentiels.
- A. gambiae cellules SUA5B nécessitent moyennes S2: Schneider drosophile moyenne, chauffer 5% de FCS inactivé, et 1% de pénicilline-streptomycine antibiotiques
- Décongeler et stocker tous les matériaux réactifs de transfection, les plasmides, et des oligonucléotides sur la glace.
- Toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
- Pour les cellules adhérentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) Aspirer vieux médias sans perturber les cellules, ajouter un volume équivalent de milieux frais qui a été chauffé à 28 ° C, puis rincer les cellules du bas de la flacon à l'aide d'une pipette.
- La concentration des cellules devraient être déterminés et ajustés à une concentration finale de 1x10 6 cellules / ml. Les cellules peuvent être conservés à température ambiante pendant la préparation de matériaux réactifs de transfection.
- Ajouter 1 mL de cellules de moustique (1x10 6 cellules / ml) dans chaque puits d'une plaque de 6 puits. Mettre en place une plaque pour chaque condition expérimentale (voir ci-dessous).
Tableau I est un schéma de pipetage pour un transfection général. Tableau II énonce cinq conditions à tester pour la mutagénèse réussie d'un seul nucléotide à l'aide spécifique au BFP LNA-ons. Les deux premiers, et pGFP pBFP, sont des contrôles positifs et négatifs, respectivement. Le reste sont des conditions expérimentales de pBFPs avec des concentrations croissantes de BFP spécifiques LNA-ons. Dans les étapes 8 à 12, ajouter des volumes appropriés de réactif en conséquence pour chaque état. - Transfert d'ADN plasmidique à un stérile de 1,5 ml microtube et ajouter le volume approprié de tampon CE.
- Pour 1 uL d'ADN plasmidique (1 ug / uL), ajouter 99 ul de tampon CE.
- Pour une pGFP ul (1 pg / uL), ajouter 99 ul de tampon CE.
- Pour une pBFP ul (1 pg / uL), ajouter 99 ul de tampon CE.
- Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 1 ul ON (pg / pl), ajouter 98 ul de tampon CE.
- Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 5 pi ON (1 pg / uL), ajouter 94 ul de tampon CE.
- Pour une pBFP ul (1 pg / uL) et 10 uL ON (1 pg / uL), ajouter 89 ul de tampon CE.
- Ajouter ensuite lentement Enhancer pour 1 pg d'ADN utilisés.
- Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter 8 uL Enhancer.
- Pour une pGFP ul, ajouter 8 uL Enhancer.
- Pour une pBFP ul, ajouter 8 uL Enhancer.
- Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajouter 16 uL Enhancer.
- Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajouter 48 uL Enhancer.
- Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajoutez 88 uL Enhancer.
- Vortex ADN / tampon / Enhancer mélange pendant 1 sec et assurez-vous que toute la solution est au fond du tube. Puis incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter le réactif Effectene par 1 ug d'ADN plasmidique et le vortex pendant 10 sec. Vérifiez que toute la solution se trouve au fond du tube et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter 10 uL Effectene (tableau I).
- Pour une pGFP ul, ajouter 10 uL Effectene (tableau II).
- Pour une pBFP ul, ajouter 10 uL Effectene (tableau II).
- Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajouter 20 uL Effectene (tableau II).
- Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajouter 60 uL Effectene (tableau II).
- Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajouter 110 uL Effectene (tableau II).
- Apportez chaque tube pour un volume final de 1000 en ajoutant les médias uL réchauffé goutte à goutte au mélange ADN / tampon / Enhancer / Effectene. L'ADN peut précipiter à ce point si le support est ajouté trop rapidement. Mélanger doucement par aspiration et refoulement 3-4 fois.
- Pour 1 uL d'ADN plasmidique, ajouter des médias 882 uL (tableau I).
- Pour une pGFP ul, ajoutez les médias uL 882 (tableau II).
- Pour une pBFP ul, ajoutez les médias uL 882 (tableau II).
- Pour une pBFP ul et 1 ul ON, ajoutez 864 uL des médias (tableau II).
- Pour une pBFP uL et 5 pi ON, ajoutez 792 uL des médias (tableau II).
- Pour une pBFP uL et 10 uL ON, ajoutez les médias 702 uL (tableau II).
- Suivant ajouter lentement 1 ml de l'ADN appropriée / Enhancer / Effectene mélange à chaque puits une goutte à la fois.
- Swirl doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules et le mélange de transfection. Incubate cellules dans des conditions normales de croissance.
- Un jour après transfection, doucement aspirer à des médias et lentement le remplacer par un volume équivalent de médias fraîchement réchauffé. Il est important de ne pas perturber les couches de cellules au fond du puits quand vous le faites.
- Deux jours après transfection examiner les cellules transfectées avec contrôle positif pGFP sous microscope à fluorescence pour déterminer l'efficacité de transfection (figure 2).
- Cellules SUA5B se développent très rapidement et seront envahies par la végétation. Quatre jours après la transfection de ces cellules minces en aspirant le vieux médias et en ajoutant lentement un volume équivalent de médias fraîchement réchauffé.
- Après l'ajout de nouveaux médias pour les puits, détachez toutes les cellules du fond de chaque puits par pipetage de haut en bas, jetez la moitié du volume (1 ml) du mélange de cellules et ajouter 1 mL de Fresh Media réchauffé à porter le volume final de 2 mL.
- Vérifiez cellules quotidiennement pour s'assurer qu'ils sont sains et ne pas envahis, mince comme nécessaire.
- Permettre aux cellules de se développer dans des conditions normales pendant cinq à sept jours après la transfection, avant de les recueillir pour l'analyse.
- Moins cinq à sept jours après la transfection, de recueillir les cellules par aspiration hors du vieux médias dans tous les puits et en ajoutant 1 ml de solution stérile température ambiante PBS dans chaque puits.
- Détachez les cellules du fond du puits par aspiration et refoulement et le transfert mélange de cellules à 5 mL tubes pression casquette et analyser immédiatement les cellules par cytométrie en flux.
Les résultats représentatifs
Figure 1. A. sains non transfectées stephensi MSQ43 (A) et A. gambiae SUA5B (B) des cellules à environ 80% de confluence.
Figure 2. A. stephensi MSQ43 (A) et A. gambiae SUA5B (B) des cellules transfectées avec le contrôle positif GFP plasmide exprimant.
Figure 3. Cytométrie en flux de données confirmant la conversion du BFP à la GFP par mutagénèse d'une transfection unique à la suite de nucléotides avec BFP spécifique verrouillé acides nucléiques oligonucleotides modifiés (LNA-ons). Cellules SUA5B été transfectées avec un plasmide exprimant la GFP (pGFP) comme contrôle positif, avec un plasmide exprimant BFP (pBFP) comme contrôle négatif, ou avec pBFP et des concentrations croissantes de BFP spécifiques LNA-ons. Stratégie de Gating (A) pour les données de cytométrie en flux montrant de gauche à droite: diffusion vers l'avant par rapport secondaires de cellules vivantes, iodure de propidium (PI) des cellules négatives et cellules GFP-positives cinq jours après la transfection. (B) Graphique du pourcentage de cellules GFP-positives montré dans (A) la transfection suivants avec pBFP et des concentrations croissantes de LNA-ons.
Tableau I. conditions de transfection.
Tableau II. Conditions de transfection utilisé dans la figure 1.
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Discussion
Nous présentons ici une méthode in vitro et des preuves pour la conversion ciblée d'un seul nucléotide dans un gène cible épisomique après transfection de LNA-Ons dans A. stephensi et A. cellules gambiae. Conversion génique LNA-SUR-médiation nécessite l'induction d'un site spécifique de réponse réparation de l'ADN; nos données indiquent que les cellules de moustique peut soutenir ce mécanisme de mutagenèse dirigée. Bien que la méthode présentée ici est basée sur la conversion d'une cible épisomale, nos données suggèrent que LNA-SUR-médiatisée de conversion peut être optimisé pour cibles chromosomiques dans les cellules de moustique comme il l'a été dans d'autres systèmes. Conversion génique, par conséquent, faciliter la génération de lignées cellulaires transformées de façon stable, sans moustiques protocoles complexes et longs régimes de sélection des médicaments. En outre, la technologie existante basée sur l'utilisation de l'ARNm spécifique marqueurs fluorescents dans les cellules vivantes peuvent être mises à profit pour trier et d'enrichir les cellules de moustique avec des convertis gènes chromosomiques cibles pour des études biologiques 5-7.
Le succès de cette méthode dépend de façon critique sur l'utilisation de cellules saines à une densité de 70-80%. En outre, à toutes les étapes lors du processus de transfection, il est important de déterminer que ni le plasmide, ni LNA-Ons ont précipité dans la solution en cochant la solution visuellement pour précipiter. Une éventuelle modification de ce protocole est de la plaque les cellules 24 heures avant le début du processus de transfection. Ceci est suggéré pour ralentir les lignées de cellules en croissance ou sensibles. Nous avons constaté que le ratio optimal de l'ADN plasmidique à la LNA-Ons a 01h05 mais il sera important de déterminer le rapport idéal pour chaque nouveau gène et une lignée cellulaire d'intérêt.
Une série d'études ont identifié des loci des moustiques et des gènes qui confèrent une résistance à 8-10 parasite du paludisme infection. Si ces objectifs se prêtent à la manipulation - par l'amélioration de la synchronisation ou la réorientation des expression - ils peuvent fournir une base pour le génie génétique comme une stratégie pour contrôler la transmission du parasite du paludisme dans les populations de vecteur naturel. La méthodologie est question ici est une nouvelle technique et efficace pour introduire des mutations dans les gènes de résistance contre le paludisme dans le laboratoire. Grâce à ces manipulations de gènes d'intérêt, nous pouvons déterminer précisément comment les produits des gènes cellulaires modifient les réponses anti-parasitaire in vitro, une étape essentielle pour contrôler la compréhension du développement du parasite du paludisme in vivo.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Abbie Spinner au Centre National Primate Research en Californie, pour son aide à la cytométrie de flux. Cette étude a été soutenue par un financement de l'Institut national des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 et AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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