Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

doi: 10.3791/2357 Published: April 14, 2011

Summary

Одновременное инфицирование вирусом гриппа типа А является одним из факторов, обуславливающих индукции инвазивных пневмококковых инфекций во время бессимптомной

Abstract

В 1918 пандемии вируса гриппа, в результате которого погибли около 50 миллионов человек во всем мире, большинство из погибших не были результатом заражения вирусом гриппа в одиночку. Вместо этого, большинство людей, как полагают, поддавшись вторичной бактериальной инфекции, преимущественно вызванной бактерией Streptococcus пневмонии (пневмококк). Синергетические связи между инфекций, вызванных вирусом гриппа и пневмококковой инфекции была впоследствии наблюдалось в 1957 азиатской пандемического вируса гриппа, а также во время сезонных вспышек вируса (см. обзор в 1, 2). Здесь мы опишем протокол, используемый для исследования механизма (ы), которые могут быть вовлечены в повышение заболеваемости в результате одновременного вируса гриппа А и С. пневмонии инфекции. Мы разработали младенческая мышиной модели надежно и воспроизводимо демонстрации последствий вируса гриппа, заражение мышей колонизировали с С. пневмонии. Используя этот протокол, мы предоставили первый понимание кинетики пневмококковой передачи между входящими в жилье, новорожденных мышах в естественных изображений 3.

Protocol

1. Подготовка Инфекционные Запас Биолюминесцентный С. пневмонии

  1. Привить трубки Маккартни содержащих 10 мл Todd-Hewitt бульон дополнена 0,5% (м / о) дрожжевого экстракта и небольшой кусочек кровяной агар с биолюминесцентного С. пневмонии и расти статически при 37 ° С до оптической плотности (600 нм) в 0.40-0.45.
  2. Место культуры на льду в течение 5 мин до ареста клетки в этой фазе роста.
  3. Для 10 мл середине журнала фазы роста S. пневмонии добавляют 1 мл 80% (объем / объем) глицерин и смешайте, аликвоту в нужный объемы и хранить при температуре -70 ° C.
  4. Определите инфекционные дозы биолюминесцентного С. пневмонии акции на жизнеспособные количество серийных разведений на пластинах кровяной агар.

2. Рост и подготовка вируса гриппа А акции

  1. Грипп Вирус выращивается в аллантоисной жидкости из 10-дневных эмбрионов куриных яиц.
  2. Оттепель флакон с вируса гриппа А в 37 ° С водяной бане.
  3. Использование источник света помещен по airsac (просвечивание), отпечаток на яичной скорлупы расположения мешка воздуха в точке свободного от основной вены.
  4. Лечить поверхности яйца, вытирая с 70% этанола и протрите чистой.
  5. Пирс маленькое отверстие в воздухе мешка чуть выше отметки использованием писец ювелира.
  6. С яйца расположены в коробке с верхним воздушным мешком, используйте 13мм 1 мл шприца и иглы 26G привить каждое яйцо через отверстие в оболочке с 0,1 мл должным образом разбавленного гриппа вирус. Направьте иглу прямо вниз, в аллантоисной полости, пирсинг airsac.
  7. Печать отверстие расплавленный воск и инкубировать яйца в течение 2 дней в увлажненной яйцо инкубатор при 35 ° C. Через 2 дня инкубации яйца свечу, чтобы проверить наличие кровеносных сосудов, чтобы подтвердить эмбриона все еще жив. Если яйцо черный внутри, эмбрион умер и яйца должны быть отброшены и не используется для уборки гриппа вирус.
  8. Место яйца при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы убить эмбрионов и сжиматься кровеносные сосуды, чтобы минимизировать разрушение сосудов, а контакт между кровью и вирус может привести к связыванию вируса красных кровяных телец.
  9. На следующий день, дезинфицировать поверхности яйца, вытирая с 70% этанола.
  10. Работа в классе II биобезопасности Кабинета сбора аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А из яйца. Удаление воском и использовать изогнутые ножницы, чтобы вырезать вокруг верхней части яйца, чтобы удалить воздух мешка выше аллантоисную мембраны.
  11. Прокол и отогните аллантоисную мембраны использованием стерильного пинцета.
  12. Аспирируйте аллантоисной жидкости с 10 мл стерильной пипеткой, удерживая эмбриона в одну сторону с другой стерильной пипеткой. Сбор объединенных аллантоисной жидкости в 50 мл пробирки и держать на льду во все времена. Если аллантоисной жидкости кровавый или содержит желток не добавляют к бассейну.
  13. Центрифуга аллантоисной жидкости для 5 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре для удаления мусора.
  14. Алиготе инфекционных аллантоисной жидкости в 1-2 мл cryotubes и хранить при температуре -70 ° C.
  15. Определение вируса гриппа А титр талой аллантоисной жидкости в 3 независимо выполнены бляшкообразующих анализы в Мадина-Дарби собачьи клетки почек (см. ниже). Используйте новую аликвоту вирус для каждого эксперимента. Повторные замораживания-оттаивания позволит снизить титр инфекционности.

3. Интраназальное заражение мышей с биолюминесцентного С. пневмонии и / или вирус гриппа А

  1. Оттепель замороженные запасы биолюминесцентного С. пневмонии и разбавить до желаемой дозы в PBS.
  2. Аккуратно поднять на 5 дней старых мышей между указательным и большим пальцем и удерживать в вертикальном положении. Используйте пипетку отказаться биолюминесцентного С. пневмонии на ноздри в объеме 3μl. Подождите, пока все посевной вдыхается перед размещением мышь обратно в клетку. Используйте 3μl ФСБ для макета инфекции.
  3. От трех до девяти дней после колонизации биолюминесцентного С. пневмонии, оттепель аликвоту аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А и разводят в PBS в нужной концентрации. Infect мышей с гриппом вируса в объеме 3μl PBS, как описано в шаге 3.2. Используйте 3μl разреженного аллантоисной жидкости из незараженных яиц макет вирусной инфекции.
  4. Монитор благосостояния мышей ежедневно, наблюдая за их внешний вид, поведение, состояние тела и, у мышей, которые ≤ 3 дней, присутствие молока пятна. Руководство для гуманных конечных точек и вмешательства критерии должны быть разработаны в консультации с ветеринаром лабораторных животных (табл. 3).

4. Биолюминесцентный визуализации с использованием спектра ИВИС (суппорт науки о жизни)

  1. Приготовить смесь кетамина при 0,75 мг / мл и ксилазина 1.76mg/ml в ампулах воды.
  2. Для анестезировать мышей, вводят 100μl/10 г веса тела в брюшнуюполость.
  3. Место наркозом мыши в окне изображения. Особое внимание должно быть уделено поддержанию анатомической области интереса параллельно камеры при размещении мыши внутри окна изображения / камеры.
  4. Место коробку с мышами в ИВИС и позволяют изофлуран вступления в окно на уровне 0,5 л / мин для поддержания анестезии.
  5. Установить ИВИС машины для исправления платформы визуализации и биннинга и захвата изображений в течение 7 минут.
  6. Разрешить мышей, чтобы оправиться от наркоза в нагревали окне (например, использование тепла клавиатуре), прежде чем вернуться на главную клетку.
  7. Изображения, анализируются и корректируются в том же масштабе использованием живой образ программный пакет версии 3.0 (суппорт Life Sciences).
  8. Биолюминесцентный сигналы в выбранной области интереса могут быть количественно либо как полный поток (фотон / с) или среднем сияние (фотонов / с / см 2 / ср).

5. Обработка тканей, чтобы определить бактериальную нагрузку и титр вируса

  1. Мыши euthanased СО 2 удушья и меха продезинфицировать 70% этанола.
  2. Обездвижить животное на жестком разделочной доской.
  3. Используя стерильный скальпель лезвием, прорезать середину головы животного, начиная с задней, а также подвергать носоглотки изгиба каждой стороны головы наружу.
  4. Сбор носоглотки ткани каждого животного, очищая ткани от каждой половины головки с помощью стерильного пинцета, поместить в 1,5 мл ледяной RPMI. Держите на льду.
  5. Откройте грудной полости с помощью ножниц и удалить легкие стерильные щипцы и ножницы. Промыть легкие три раза в ФБР, чтобы удалить кровь и накапливаться в 1,5 мл ледяной RPMI. Держите на льду.
  6. Используйте гомогенизатор для гомогенизации ткани, вставьте обратно на лед.
  7. Удалить аликвоту гомогенизированных тканей и использовать его для определения бактериальной нагрузки. Подготовка серийные разведения гомогената ткани и пластину на HBA. Культура пластин при 37 ° С в течение 18-24 часов и определить жизнеспособные счет. Бактериальные титры в частности органа может быть связано с числом фотонов наблюдается в этом регионе.
  8. Центрифуга остальной гомогенизированных тканей при 3500 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и передачи для очистки, стерильные пробирки. Магазин супернатант при -70 ° С и определить титр вирусных бляшкой анализа.

6. Зубной налет анализа для определения вируса гриппа А титр в ткани гомогенатах

  1. Титр вируса инфекционной определяются образование бляшек на сливной монослоев Мадина-Дарби собачьей почки (MDCK) клеток. MDCK клетках обычно культивируются в RF10 (табл. 1) в культуре ткани бутылок (Nunc) и пассировать, когда вырожденная.
  2. Отсоедините MDCK клетках тканевой культуры бутылки использованием трипсина. Вымойте клеток в RF10 и сбора клеток путем центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируйте гранулированный клеток в RF10. Граф MDCK клеток с использованием гемоцитометра и жизненно красителя. Семенной каждый 35-мм и 6-ти луночных планшетах (Nunc) с 1.2x10 6 MDCK клеток в 3 мл RF10 и культуры клеток на 37 ° С и 5% СО 2 для достижения слияния (в ~ 24 часов).
  3. Подготовка Лейбовиц dsL15 СМИ и 1,8% (м / о) агарозном наложения средств массовой информации (табл. 1). Алиготе dsL15 СМИ и 1,8% (м / о) агарозы в 50 мл в стерильные бутылки. Держите dsL15 СМИ при 4 ° С до использования и агарозы при 56 ° C до использования.
  4. Убедитесь, что MDCK монослоях ячейки сливной и промыть клетки с + RPMI на аспирационных RF10 и заменить его ~ 1,5 мл RPMI +. Ни на одном этапе в процедуру пластин допускать, чтобы полностью высохнуть. Инкубируйте пластин при 37 ° С до готовности добавить образцов, содержащих вирус.
  5. Подготовка серийных разведений образцов вирусов в RPMI +. Храните образцы на льду до использования.
  6. Аспирируйте RPMI + из монослоев и добавить 135uL RPMI + соответствующих разведений вируса образца в каждую лунку. Испытание каждого образца в двух экземплярах.
  7. Инкубируйте MDCK клеток с образцами вируса в течение 45 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Осторожно встряхните пластин каждые 15 минут, чтобы распространять вирус равномерно и предотвращения высыхания MDCK монослоях клеток.
  8. Перемещение агарозном от 56 ° С до 46 ° С и теплый водяной бане dsL15 средствах массовой информации до 46 ° С на водяной бане.
  9. После 45 мин инкубации вируса на MDCK монослоях, возьмите пластин из 5% СО 2 инкубатора. Удалить агарозы и L15 средств массовой информации от 46 ° С водяной бани. Добавить 0,2 мл 0,1% трипсина в 50 мл dsL15 средства массовой информации, чем добавить 50 мл dsL15 + трипсина в 50 мл 1,8% (м / о) агарозы. Смешайте агарозы и L15 мягко и добавить 3 мл наложения среду в каждую лунку 6-луночных. Аккуратно водоворот обеспечить весь MDCK монослоя клетка покрыта. После наложения установлен инкубировать пластин при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 2-4 дней.
  10. В конце инкубационного периода, подсчитать количество бляшек в качестве меры вирус infectiviти. Если необходимо, бляшки могут быть визуализированы окрашивание монослоев с кристаллическим фиолетовым растворяли в метаноле.

7. Раздел C - Секреты успеха:

1 Все экспериментальные работы с С. пневмонии (например, прививки жидких культур, обработки тканей от мышей, инфицированных С. пневмонии) выполняется в классе II биобезопасности Кабинета министров.

1,1 Мы создаем биолюминесцентного С. пневмонии штаммов путем введения плазмиды pPJTG28 3. Тем не менее, широкий спектр различных биолюминесцентного С. пневмонии штаммов имеются 4-6. Биолюминесцентный С. пневмонии штаммы также могут быть приобретены у Caliper Life Sciences Inc (штат Массачусетс, США).

1,1 Кинетика роста различных С. пневмонии штаммы могут различаться и должны быть определены для каждого штамма. Это может занять от 3 до 4 часов, чтобы достичь OD600nm = 0,4 до 0,45.

1.4 Мы, как правило, ожидают, что запасы инфекционных достичь концентрации 10e8 КОЕ / мл и рекомендовать разведение диапазоне от 10е-4 до 10e-8 для определения концентрации жизнеспособных бактерий.

2,6 соответствующим титром, чтобы использовать для прививки яйца, в зависимости от штамма вируса, используется и может варьироваться от 10e-3 до 10e-5. Грипп штаммов вируса получены из супернатантов культуры тканей могут иногда использоваться аккуратно.

3.2а Мы регулярно использовать 2000 КОЕ С. пневмонии штамм EF3030 колонизировать 5 дней старых мышей 3. Точное инфекционные дозы посевного определяется ретроспективно для каждого эксперимента при посеве серийные разведения посевного материала на лошади пластин кровяной агар. Способность С. пневмонии напрягаться, чтобы колонизировать мышей сначала определяется количество жизнеспособных тканей гомогенатах (например, носоглотки, легких) в нескольких точках времени после прививки мышей.

3.2b Не стоит использовать anaestetics управлять бактерии или вируса животных при вдыхании. Младенческая мышей (а также взрослых мышей) должны быть ограничены от руки и в вертикальном положении на следователя, посевной (3 мкл для детского мышей, до 10 мкл для взрослых мышей), затем упал на ноздри и ингаляций все посевной подтверждается наблюдением.

3.2в Удалить новорожденных мышей по одному из гнезда и прививать с бактериями или вирусом по мере необходимости. Марк хвост животного использованием перманентным маркером, если необходимо и вернуть животное обратно в клетку немедленно. Руб животных с некоторыми подстилки, так что плотина будет принимать щенков обратно в гнездо. Примечание: перманентный маркер стирается животные быстро и должен быть вновь применен в день. Кроме того, татуировки система может быть использована для идентификации отдельных животных.

3.3 Мы используем 20 PFU вируса гриппа А Udorn/307/72 (H3N2) для заражения от 8 до 14 дневных мышей 3. Смертность и заболеваемость наблюдается в животных будет зависеть от штамма S. пневмонии и гриппа вирус используется. Таблица 3 содержит полезный набор гуманного конечных точек и вмешательства критерии использовать мышей в возрасте до 21-дневного возраста. Мы обычно не обнаруживают какой-либо смертности или заболеваемости при использовании S. EF3030 пневмонии и гриппа штамма вируса Udorn/307/72 (H3N2), когда мыши> 10 дней назад.

4,2 Если быть точным, мыши могут быть взвешены перед инъекцией анестетика решение. В качестве ориентира, около 50-75 мкл раствора анестетика используется в течение 20 дней старых мышей. Мышь полностью под наркозом, когда не реагирует на пинч в хвост или задние конечности. Хотя в ИВИС, мышей будут также подвергаться изофлуран которые добавят анестезии. Сроки изображений после заражения мышей зависит от штамма (ы) С. пневмонии и гриппа вирус, используемый, а также о симптомах, представляющих интерес. Выполнение нескольких экспериментов пилоту оптимизировать сроки биолюминесцентного изображения может быть необходимым.

4,3 Мыши могут быть помещены в изоляции коробка (что предотвращает загрязняющих веществ из входе или выходе из коробки) или, наоборот, могут быть размещены непосредственно в инструмент для работы с изображениями. Мы используем изоляции поле для экспериментов с младенцем мышей, с тем чтобы обеспечить мышей остаются анестезии во время процедуры и визуализации, чтобы предотвратить загрязнение ИВИС с С. пневмонии и / или гриппа вирус.

4.3 Использование вентральной образа мышей, чтобы получить изображение дыхательных путей. Боковые образ мышь обеспечивает более чувствительны образ ушей.

4.4 При мышей которые размещаются непосредственно в камере, изофлуран доставляется на мышах с помощью головных частей. Для экспериментов, в которых ребенок мышей используются, изоляция поле является предпочтительным, поскольку головных частей не помещаются на младенческая мышей.

4.5 TОн общее время экспозиции необходимо для захвата изображения может варьироваться от экспериментов по силе биолюминесцентного сигнала, расположение сигнала, бактериального штамма и штамма мыши используется. Что касается последнего, как пигмент и мех может значительно ослаблять общую обнаруженный сигнал. Камера на Спектр ИВИС является резервной разбавленной, назад освещенный ПЗС предлагая широкий динамический диапазон (65536 уровней серого). В идеале, время экспозиции должно быть установлено для захвата от 60 до 60000 пунктам. По нашему опыту с C57BL / 6 мышей, увеличивая изображение времени после 7 минут не заметно улучшить отношение сигнал-шум. Альтернативные варианты повышения биолюминесцентного сигнала включают повышение степени биннинга (т.е. больших) и используя меньшее поле зрения. Важно отметить, что количественное, не должны проводиться на тех областях, в изображение, содержащее насыщенные пикселей, так как это дает заниженное значение для числа фотонов обнаружено. Если вы не знаете, как в оптимальных условиях, автоэкспозиции функция может быть использована в качестве ориентира.

4.5 Если сильный биолюминесцентного сигнала в одной части мыши препятствует обнаружению биолюминесценции в соседнем регионе, выбранных регионах мыши могут быть покрыты черной бумагой и обработки изображений могут протекать как обычно

4.7 Если люминесцентный сигнал количественно фотонов (в отличие от счета) изменения в области обработки изображений условиях (например, время съемки) между опытами не повлияет на измерение биолюминесцентного сигнала.

4,8 При использовании общего потока для измерения фотоны в указанной области, убедитесь, что же «области интереса» форма используется для всех образцов.

5.1а Мыши могут быть умерщвлены в любой момент времени после заражения вирус гриппа А, в зависимости от интереса исследователя. Мы обычно определяют бактериальные и вирусные титры на 6 дней после заражения вирусом гриппа Udorn/307/72 (H3N2) и не наблюдаем смертности / заболеваемости. Тем не менее, заболеваемость и смертность наблюдается в этих экспериментах будут варьироваться в зависимости от S.pneumoniae и гриппа штамма вируса используются и временной точке chosed должны смертности и заболеваемости во внимание, чтобы минимизировать воздействие на животных. Таблица 3 содержит полезную информацию для вмешательства критерии и гуманного конечные точки для использования в этих экспериментах. Как правило, мышей эвтаназии и тканей обрабатывается, как описано в течение 3 часов после того как в естественных условиях биолюминесцентного изображения.

5.1b Мыши моложе 10 дней, устойчивы к гипоксии и умерщвлены путем обезглавливания. В описанной экспериментальной установки, мыши, по крайней мере за 14 дней и может быть умерщвлены СО 2 удушья.

5,7 Кровь-агар пластин могут быть дополнены 5μg/ml гентамицин, чтобы предотвратить рост бактерий синантропных в гомогенатах носовых тканей. Диапазон разведений, будет зависеть от S. пневмонии штамм используется. Для экспериментов в 20-дневных мышей с С. пневмонии штамм EF3030, мы используем аккуратно, 10e-1, 10e-2 и 10e-3.

5,8 Магазин каждого образца гомогенизированных тканей, по крайней мере, две порции, так что резервное копирование образцов доступны в случае анализа вирусов доска не удается! Точное вирусного титра могут быть получены только из образца талой раз после замораживания, но не из образцов неоднократно замораживания-талой.

6,1 При выращивании 90-100% сливающиеся, одного 150см 2 культуре ткани колбу даст достаточно MDCK клетках в течение пяти 6-луночных планшетах.

6,5 оптимального серийного разведения будет зависеть от штамма вируса, используется и время после заражения. Как правило, мы хотели бы использовать аккуратно, 10e-1 и 10e-2 для органа разведения гомогената принято 6 дней после заражения гриппом вируса.

6.6 Использование серийных разведений вируса акций соответствующего положительного контроля для использования в каждой доски анализа. В качестве отрицательного контроля, RPMI + может быть использован.

8. Представитель результаты:

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальная схема эмбрионов куриное яйцо.

Рисунок 2 Отсутствующие
Рисунок 2. BLI С. пневмонии инфицированные мыши на день 3 и 4-й день после макет инфекции вируса гриппа.

Рисунок 3
Рисунок 3. BLI С. пневмонии и гриппа с сочетанной инфекцией мыши на день 3 и 4-й день после заражения вирусом гриппа.

Рисунок 4
Рисунок 4. Бактериальной нагрузки в носовой части одного и со-инфекцииТед мыши.

Рисунок 5
Рисунок 5. Вирусные титры в носу и легкое сочетанной инфекцией мыши.

Средства массовой информации Содержание
1,8% (м / о) агарозном Добавить 0,9 грамма агарозы в 50 мл дистиллированной H 2 O, стерилизовать в автоклаве при 121 ° С в течение 10 минут. Передача до 56 ° С водяной бане, чтобы охладиться.
L15 Двойная сила Лейбовиц в среду (DS L15) 1 ранец из L15 порошок (чтобы до 1 л) растворяют в 450 мл стерильной дистиллированной H 2 O и перемешивают до полного растворения. РН доводят до рН 6,8 с помощью 1М HCl. Затем добавка с 4 мл на 7% (м / о) NaHCO3, 0,4 мл HEPES (0,5 М, рН 6,8), 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 60 мкг / мл гентамицина. Отрегулируйте конечного объема в 500 мл и фильтруют стерилизовать.
Лошадь кровяной агар (HBA) 4% HBA (Oxoid, Basingstoke, Великобритания), DH 2 O, 7% (объем / объем) крови лошади
RF10 RPMI-1640, содержащей 2 мМ глютамина, пируват натрия 2 нм, 24 мкг / мл гентамицина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10% (об. / об) тепловой инактивированной фетальной телячьей сыворотки.
RPMI + RPMI-1640, содержащей 2 мМ глютамина, пируват натрия 2 нм, 24 мкг / мл гентамицина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина
Todd-Hewitt бульон + 0,5% дрожжевой экстракт Тодд Хьюитт Отвар (Oxoid, Basingstoke, Великобритания) в дН 2 O с добавлением 2% (м / о) дрожжевой экстракт

Таблица 1. Конкретные носители, используемые в настоящем протоколе.

Материал Имя Тип Компания Номер по каталогу Комментарий
RPMI среда 1640 Реагент Гибко 21870-076
Трипсин Реагент Уортингтон Биохимические корпорации LS003740 TPCK лечение
L-15 Лейбовиц на среднесрочную Реагент Гибко 41300-039
Агарозы, типа я Реагент Sigma-Aldrich A6013 Используйте низкие температуры плавления агарозы, таких как легкоплавкий агарозном
Мадина-Дарби собак клетки почек Реагент АТСС CCL-34

Таблица 2 специальные реагенты и оборудование.:

Влияние на животных
Легкой и умеренной знаки Тяжелое б знаки
Неспецифические знак (ы):
Внешний вид Незначительное до умеренного пилоэрекции без каких-либо обезвоживание (кожа палаток) Пилоэрекции, с обезвоживанием (кожа палаток)
Тело Условие снижение веса Нет увеличения веса или снижение веса
Поведение Приглушенный, но отзывчивый, снизилась взаимодействия со сверстниками. Нечувствительны к активности и провокаций. Изолированный от других однопометников
Особые условия или ненормальных клинических признаков (ы):
Отсутствие молока месте
(<2-3 дней)
Постарайтесь убедить сосания, если это наблюдается уже <24 часов. Если никаких доказательств молока наповал даже с воодушевлением после 24-48 часов, или, если явно не вскормила, считают эвтаназию.
Другие признаки Обратиться животных фонда Manager / лабораторных животных Ветеринар совет Re: соответствующие действия или euthanise, если животное находится в умеренной или сильной боли или страдания

Таблица 3. Вмешательство критерии для детского мышей (<21 дней):

Когда один или более "легкой до умеренной" признаки наблюдаются увеличение частоты наблюдений в два раза в день и посоветуйтесь с животных офицер где это уместно, так что лечение и уход может быть предоставлена.

б Когда один или более «тяжелых» признаки наблюдаются, euthanise мышахсоответствующий метод. Мыши <10 дней усыпляют путем обезглавливания, мышей> 10 дней усыпляют СО 2 удушья.

Discussion

В естественных изображений с машиной ИВИС это уникальная методика, позволяющая реальном времени визуализации микробного патогенеза 4, 6-9. Здесь мы покажем, применение этой технологии для понимания синергизма между S. пневмонии и гриппа детской мышей. Из неинвазивных характер этой техники, мы были в состоянии контролировать прогрессирование инфекции в каждой отдельной мыши с течением времени. Это позволило нам документ кинетики пневмококковой передачи среди со-размещался детский мышах 3. Неинвазивный характер этой техники позволяет исследователям использовать меньшее количество животных в эксперименте и, следовательно, уменьшить животных использования. Кроме того, можно использовать ИВИС машины для визуализации распространения инфекции на ранее неизвестных очагов инфекции в организме, а также сайты, не легко, отобранных вскрытия (например, среднего уха).

Перед началом визуализации экспериментов мы подтвердили, что колонизация уровней биолюминесцентного EF3030 штамма были сопоставимы с уровнями колонизации родителей EF3030 напряжение путем перечисления жизнеспособные ткани рассчитывать в гомогенатах. Кроме того, мы впервые подтвердили, что заражение вирусом гриппа привела к увеличению нагрузки биолюминесцентных EF3030 в носоглотке колониальных животных, как показано с родителями EF3030 деформации (результаты не показаны).

Хотя технология ИВИС прост в эксплуатации и генерирует воспроизводимые и легкими для понимания данных, эксперименты должны быть тщательно спланированы так, что чувствительность и полезность технологии достигает максимального уровня. Например, чувствительность камеры ИВИС зависит от глубины и прозрачности ткани 8, который по нашему опыту, повышает предел обнаружения сигналов биолюминесцентного, происходящих из легких. Кроме того, темный мех и пигментированной кожи уменьшает светопропускание на целых 10 раза (по сравнению с безволосых мышей) 8. При разработке этого метода, мы оптимизировали этот протокол для использования с 5 до 14 дней старые C57BL / 6 мышей и с тех пор показали, что ИВИС может быть использован для обнаружения колонизации 20 дней старые C57BL / 6 мышей с биолюминесцентного С. EF3030 пневмонии. Тем не менее, обнаружение сигналов может быть увеличена, если эти эксперименты выполняются в обнаженном или BALB / с мышами. Тем не менее, камера ИВИС представляет собой новый подход для мониторинга, характеристики и в конечном итоге понять в естественных условиях развития пневмококковой инфекции следующие гриппа вирусной инфекции.

Disclosures

Производство видео-статья была организована суппорт наук о жизни.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность технических консультаций от Дэвида Briles (Университет штата Алабама в Бирмингеме, Алабама, США). Мы хотели бы поблагодарить Иветт Чэнь, сотрудник животных из Университета Мельбурна, и Дэвид Тейлор, менеджер фонда животных, за полезные советы и обсуждения, касающиеся благополучия животных и этики и развитие вмешательства критерии и гуманного конечных точек для экспериментов, описанных В этой рукописи.

Odilia Wijburg и Патрик Чтение поддерживаются NHMRC РД Райт стипендий, Кирсти Короткий при поддержке ГСК последипломного поддержке гранта и стипендии Пузей.

References

  1. Brundage, J. F., Shanks, G. D. Deaths from bacterial pneumonia during 1918-19 influenza pandemic. Emerg Infect Dis. 14, 1193-1199 (2008).
  2. Petersdorf, R. G., Fusco, J. J., Harter, D. H., Albrink, W. S. Pulmonary infections complicating Asian influenza. AMA Arch Intern Med. 103, 262-272 (1959).
  3. Diavatopoulos, D. A. Influenza A virus facilitates Streptococcus pneumoniae transmission and disease. Faseb J. (2010).
  4. Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J Infect Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  5. Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive monitoring of pneumococcal meningitis and evaluation of treatment efficacy in an experimental mouse model. Mol Imaging. 4, 137-142 (2005).
  6. Smith, M. W., Schmidt, J. E., Rehg, J. E., Orihuela, C. J., McCullers, J. A. Induction of pro- and anti-inflammatory molecules in a mouse model of pneumococcal pneumonia after influenza. Comp Med. 57, 82-89 (2007).
  7. Owen, S. J. Nasal-associated lymphoid tissue and olfactory epithelium as portals of entry for Burkholderia pseudomallei in murine melioidosis. J Infect Dis. 199, 1761-1770 (2009).
  8. Luker, G. D., Leib, D. A. Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis. Methods Mol Biol. 292, 285-296 (2005).
  9. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между<em> Пневмококк</em> И вируса гриппа А в младенческой Мыши
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., Wijburg, O. L. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).More

Short, K. R., Diavatopoulos, D. A., Reading, P. C., Brown, L. E., Rogers, K. L., Strugnell, R. A., Wijburg, O. L. Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice. J. Vis. Exp. (50), e2357, doi:10.3791/2357 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter