Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

Summary

Een gelijktijdige infectie met influenza A-virus is een van de factoren betrokken bij de inductie van invasieve pneumokokkeninfecties bij asymptomatische

Abstract

Tijdens de 1918 influenza virus-pandemie, waarvan ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd gedood, het merendeel van de dodelijke slachtoffers waren niet het gevolg van besmetting met influenza virus alleen. In plaats daarvan worden de meeste mensen denken te hebben bezweken aan een secundaire bacteriële infectie, voornamelijk veroorzaakt door de bacterie Streptococcus pneumoniae (de pneumococcus). De synergetische relatie tussen infecties veroorzaakt door het influenza virus en de pneumokokken is vervolgens waargenomen tijdens de 1957 Asian influenza-virus-pandemie, evenals tijdens de seizoensgebonden uitbraken van het virus (beoordeeld in ^{1, 2).} We beschrijven hier een protocol dat wordt gebruikt om het mechanisme (s) die betrokken kan zijn bij een verhoogde morbiditeit als gevolg van samenlopende influenza A-virus en S. te onderzoeken pneumoniae infectie. We hebben een baby muis model om betrouwbaar en reproduceerbaar tonen de effecten van het influenza virus infectie van muizen gekoloniseerd met S. pneumoniae. Met behulp van dit protocol, hebben we de eerste inzicht in de kinetiek van pneumokokken transmissie tussen co-gehuisvest, neonatale muizen met behulp van in vivo beeldvorming ^3.

Protocol

1. De voorbereiding van infectieuze Stock van Bioluminescent S. pneumoniae

1. Inoculeren een McCartney buis die 10ml Todd-Hewitt bouillon aangevuld met 0,5% (w / v) gistextract en een klein stukje van bloed agar met lichtgevende S. pneumoniae en groeien statisch bij 37 ° C tot optische dichtheid (600 nm) van 0.40-0.45.
2. Plaats de cultuur op nat ijs gedurende 5 minuten om de cellen arrestatie in deze groeifase.
3. Aan de 10 ml van de mid-log groeifase S. pneumoniae voeg 1 ml van 80% (v / v) glycerol en meng, aliquot in de gewenste volumes en bewaar bij -70 ° C.
4. Bepaal de infectueuze dosis van het lichtgevende S. pneumoniae voorraad door levensvatbare telling van seriële verdunningen op bloed agar platen.

2. Groei en voorbereiding van influenza A-virus voorraad

1. Influenza A-virus wordt gekweekt in allantoïsvocht van 10-dagen oude bevruchte kippeneieren.
2. Dooi een flacon met influenza A-virus in 37 ° C waterbad.
3. Met behulp van een lichtbron geplaatst over de airsac (schouwen), teken op de eierschaal de locatie van de luchtzak op een punt zonder onderliggende aderen.
4. Ontsmet het oppervlak van de eieren door bestrijken met 70% ethanol en veeg schoon.
5. Pierce een klein gat in de lucht zak net boven de markering met behulp van een juwelier schrijver.
6. Met de eieren gepositioneerd in een doos met het luchtzak bovenste, gebruik dan een 13mm 1 ml spuit en een 26G naald om elk ei enten door het gat in de schaal met 0,1 ml van de juiste verdund influenza A-virus. Punt van de naald direct naar beneden in de allantoïsholte, piercing de airsac.
7. Dicht het gat met gesmolten was en incubeer de eieren voor 2 dagen in een bevochtigde ei incubator bij 35 ° C. Na 2 dagen incubatie, kaars de eieren om te controleren op de aanwezigheid van bloedvaten te bevestigen dat het embryo is nog in leven. Als het ei is zwart van binnen, heeft het embryo overleden en het ei moet worden weggegooid en niet gebruikt voor het oogsten van het influenza A-virus.
8. Leg de eieren bij 4 ° C gedurende de nacht aan de embryo's te doden en te vernauwen de bloedvaten in om verstoring van de schepen te minimaliseren, zoals het contact tussen het bloed en virus zou in het binden van het virus leiden tot rode bloedcellen.
9. De volgende dag, ontsmet het oppervlak van de eieren door bestrijken met 70% ethanol.
10. Werk in een klasse II bioveiligheid kabinet om de allantoïsvocht met het influenza A-virus uit de eieren te verzamelen. Verwijder de wax en het gebruik van gebogen schaar te knippen rond de top van het ei om de luchtzak te verwijderen boven het allantoïs membraan.
11. Punctie en schil de rug van de allantoïs membraan met steriele pincet.
12. Zuig het allantoïsvocht met een 10 ml steriele pipet terwijl het embryo aan de ene kant met een andere steriele pipet. Verzamel gepoolde allantoïsvocht in 50 ml buizen en te houden op het ijs te allen tijde. Als de allantoïsvocht is bloederig of bevat eigeel niet toe te voegen aan het zwembad.
13. Centrifuge allantoïsvocht voor 5 min bij 2.000 tpm bij kamertemperatuur om vuil te verwijderen.
14. Aliquot de infectieuze allantoïsvocht in 1-2 ml cryotubes en bewaar bij -70 ° C.
15. Bepaal de influenza A-virus titer van de ontdooide allantoïsvocht in 3 onafhankelijk uitgevoerd plaque-vormende assays in Madin Darby Canine Kidney-cellen (zie hieronder). Gebruik een nieuwe hoeveelheid van het virus voor elk experiment. Herhaald invriezen en ontdooien vermindert de besmettelijkheid titer.

3. Intranasale infectie van muizen met bioluminescente S. pneumoniae en / of het influenza A-virus

1. Ontdooi ingevroren voorraad van bioluminescente S. pneumoniae en vul aan tot de gewenste dosis in PBS.
2. Voorzichtig pick-up vijf dagen oude muizen tussen duim en wijsvinger en houd deze rechtop. Gebruik een pipet om bioluminescente S. laten vallen pneumoniae op neusgaten in een volume van 3μl. Wacht tot alle van het inoculum wordt geïnhaleerd voordat de muis terug in de kooi. Gebruik 3μl van PBS voor de mock-infectie.
3. Drie tot negen dagen na de kolonisatie met lichtgevende S. pneumoniae, dooi een hoeveelheid van allantoïsvocht dat influenza A-virus en verdund in PBS tot de gewenste concentratie. Infecteren muizen met influenza A-virus in een volume van 3μl PBS zoals beschreven in stap 3.2. Gebruik 3μl verdund allantoïsvocht van niet-geïnfecteerde eieren voor mock-virus infectie.
4. Dagelijks te controleren op het welzijn van de muizen door observatie van hun uiterlijk, gedrag, conditie en in muizen die zijn ≤ 3 dagen oud, de aanwezigheid van melk vlekken. Een gids voor humane eindpunten en interventie criteria moeten worden ontwikkeld in overleg met de Laboratory Animal Dierenarts (tabel 3).

4. Bioluminescente beeldvorming met behulp van de IVIS Spectrum (Remklauw Life Sciences)

1. Maak een mengsel van ketamine bij 0,75 mg / ml en xylazine 1.76mg/ml in injecteerbare water.
2. Om verdoven muizen, injecteren 100μl/10 g lichaamsgewicht in de peritonealeholte.
3. Plaats verdoofd muizen in de beeldvorming box. Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan het houden van de anatomische regio van belang parallel aan de camera bij het plaatsen van de muis binnenkant van de beeldvorming box / kamer.
4. Plaats doos met muizen in IVIS en laat isofluraan binnenkomst in de box bij 0,5 L / min om de anesthesie te onderhouden.
5. Stel IVIS machine imaging platform en binning correct en beeld vast te leggen voor de 7 minuten.
6. Laat muizen van anesthesie herstellen in een voorverwarmde doos (bijvoorbeeld met behulp van een warmte-pad), voordat hij terugkeerde naar huis kooi.
7. Beelden worden geanalyseerd en aangepast aan de dezelfde schaal met behulp van het levende beeld software pakket versie 3.0 (Remklauw Life Sciences).
8. Bioluminescente signalen in een geselecteerde regio van belang kan worden gekwantificeerd als ofwel de totale flux (foton / s) of de gemiddelde straling (fotonen / s / cm ² / sr).

5. Verwerking van weefsels om bacteriële laden en virus titer te bepalen

1. Muizen worden geëuthanaseerd door de CO ₂ stikken en de vacht gedesinfecteerd met 70% ethanol.
2. Immobiliseren het dier op een harde snijplank.
3. Met behulp van een steriel scalpel, dwars door het midden van de kop van het dier, te beginnen posterior, en bloot de nasofarynx door het buigen elke kant van het hoofd naar buiten.
4. Verzamel de nasofaryngeale weefsel van elk dier door het afschrapen van het weefsel van elk de helft van het hoofd met behulp van steriele pincet en plaats in 1,5 ml ijskoude RPMI. Te houden op het ijs.
5. Open de borstholte met een schaar en verwijder de longen met steriele pincet en een schaar. Spoel de longen drie keer in PBS om geen bloed te verwijderen en verzamelen in 1,5 ml ijskoude RPMI. Te houden op het ijs.
6. Gebruik een homogenisator naar de weefsels te homogeniseren, plaats terug op het ijs.
7. Verwijder een aliquot van het gehomogeniseerde weefsel en dit gebruiken om de bacteriële verontreiniging te bepalen. Bereid seriële verdunningen van het weefsel homogenaat en de plaat op de HBA. Cultuur platen bij 37 ° C gedurende 18 tot 24 uur en bepaling van levende tellen. De bacteriële titers in een bepaald orgaan kan dan worden gecorreleerd met het aantal fotonen waargenomen in die regio.
8. Centrifugeer de rest van het gehomogeniseerde weefsel bij 3.500 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de supernatant en transfer naar schone, steriele buizen. Bewaar supernatant bij -70 ° C en bepaal virale titer door plaque assay.

6. Plaque assay om influenza A-virus titer in weefsel homogenaten bepalen

1. Infectievermogen van het virus titers worden bepaald door de vorming van tandplak op de samenvloeiing monolagen van Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen. MDCK cellen worden routinematig gekweekt in RF10 (tabel 1) in weefselkweek flessen (Nunc) en gepasseerd bij de samenvloeiing.
2. Los MDCK cellen uit weefselkweek flessen met behulp van trypsine. Was de cellen in RF10 en het verzamelen van cellen door centrifugeren bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de gepelleteerde cellen in RF10. Tel de MDCK cellen met behulp van een hemocytometer en vitale kleurstof. Seed elk 35mm goed van 6-well platen (Nunc) met 1.2x10 ⁶ MDCK cellen in 3 ml RF10 en de cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO ₂ te bereiken confluentie (in ~ 24 uur).
3. Bereid Leibovitz dsL15 media en 1,8% (w / v) agarose overlay media (tabel 1). Aliquot dsL15 media en 1,8% (w / v) agarose in 50 ml in een steriele flessen. Houden dsL15 media bij 4 ° C tot gebruik en agarose bij 56 ° C tot gebruik.
4. Controleer of de MDCK celmonolagen samenvloeiende zijn en dat de cellen met RPMI + door opzuigen van de RF10 en te vervangen door wassen ~ 1,5 ml RPMI +. Op geen enkel stadium van de procedure moeten de platen worden toegestaan ​​om volledig laten drogen. Incubeer de platen bij 37 ° C tot het moment van de monsters met virus toe te voegen.
5. Bereid seriële verdunningen van het virus monsters in RPMI +. Houden monsters op ijs tot gebruik.
6. Aspireren RPMI + van de monolagen en voeg 135uL RPMI + van geschikte verdunningen van het virus monster aan elk putje. Test elk monster in duplo.
7. Incubeer de MDCK cellen met het virus monsters gedurende 45 min bij 37 ° C en 5% CO _2. Schud de platen om de 15 minuten naar het virus gelijkmatig te verdelen en te voorkomen dat het drogen van de MDCK cel monolagen.
8. Verplaats de agarose van 56 ° C tot 46 ° C waterbad en warm dsL15 media tot 46 ° C in waterbad.
9. Na 45min incubatie van het virus op de MDCK monolagen, nemen platen van 5% CO ₂ incubator. Verwijder de agarose en L15 media van 46 ° C waterbad. Voeg 0,2 ml van 0,1% trypsine tot 50 ml van dsL15 media, dan 50 ml dsL15 + trypsine toe te voegen aan 50 ml van 1,8% (w / v) agarose. Meng de agarose en L15 zachtjes en voeg 3 ml van de overlay medium aan elk putje van de 6-well platen. Zwenk om de hele MDCK celmonolaag verzekeren is gedekt. Zodra de overlay is ingesteld Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor 2-4 dagen.
10. Aan het einde van de incubatieperiode, tellen het aantal plaques als maat van het virus infectivity. Indien nodig kunnen de plaques worden gevisualiseerd door kleuring van de monolagen met kristalviolet opgelost in methanol.

7. Sectie C - Geheimen van het succes:

1 Alle experimenteel werk met S. pneumoniae (bijv. enten van vloeibare culturen, verwerking van weefsel van muizen geïnfecteerd met S. pneumoniae) wordt uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid kabinet.

1.1 Wij creëren lichtgevende S. pneumoniae stammen door de invoering van plasmide pPJTG28 ^3. Echter, een breed scala van verschillende bioluminescente S. pneumoniae stammen zijn beschikbaar 4-6. Bioluminescente S. pneumoniae stammen kunnen ook worden gekocht bij Remklauw Life Sciences Inc (MA, USA).

1.1 Groei kinetiek van de verschillende S. pneumoniae stammen kunnen verschillen en moet worden vastgesteld voor elke stam. Het kan tussen de 3 tot 4 uur te bereiken OD600nm = 0,4-0.45.

1.4 We zouden normaal gesproken verwachten dat de besmettelijke voorraden tot concentratie van 10e8 CFU / ml te bereiken en een verdunningsreeks raden van 10e-4 tot en met 10e-8 om de concentratie van levensvatbare bacteriën te bepalen.

2.6 De juiste titer moet worden gebruikt voor inoculatie van de eieren, afhankelijk van de gebruikte virusstam en kan variëren van 3 tot en met 10e-10e-5. Influenza A-virus stammen verkregen uit weefsel kweeksupernatanten kunnen soms worden gebruikt netjes.

3.2a Wij routinematig gebruik 2000 CFU van S. pneumoniae stam EF3030 tot 5 dagen oude muizen ³ koloniseren. De precieze infectueuze dosis van het inoculum wordt achteraf bepaald voor elk experiment door uitplating seriële verdunningen van het inoculum te paard bloed agar platen. Het vermogen van de S. pneumoniae stam aan muizen koloniseren wordt eerst bepaald door levensvatbare telling van weefsel homogenaten (bijv. nasopharynx, longen) op verschillende tijdstippen na inoculatie van de muizen.

3.2b Het is niet nodig om anaestetics te gebruiken om de bacterie of het virus toe te dienen aan de dieren via inademing. Jonge muizen (en ook volwassen muizen) moeten aan banden worden gelegd met de hand en hield rechtop door de onderzoeker, is het inoculum (3 microliter voor jonge muizen, tot 10 microliter voor volwassen muizen), dan vallen op de neusgaten en inhalatie alle van het inoculum wordt bevestigd door waarnemingen.

3.2c Verwijder de neonatale muizen een voor een uit het nest en enten met bacteriën of een virus als dat nodig is. Markeer de staart van het dier met behulp van een permanent marker, indien nodig en terug te keren dier terug naar kooi meteen. Wrijf het dier met wat strooisel, zodat de dam weer terug ga akkoord met de pups in het nest. Let op: permanent marker afgewreven de dieren snel en moet dagelijks opnieuw worden aangebracht. Als alternatief kan een tatoeage systeem worden gebruikt om individuele dieren te identificeren.

3.3 We maken gebruik van 20 PFU influenza A-virus Udorn/307/72 (H3N2) te infecteren 8 tot 14 dagen oude muizen 3. Mortaliteit en morbiditeit waargenomen in de dieren, zal afhangen van de stam van S. pneumoniae en influenza A-virus gebruikt. Tabel 3 geeft een nuttige set van humane eindpunten en criteria voor steunverlening om te gebruiken in muizen jonger dan 21 dagen oud. We meestal detecteren geen mortaliteit of morbiditeit bij het ​​gebruik van S. pneumoniae EF3030 en influenza A-virus stam Udorn/307/72 (H3N2) bij muizen> 10 dagen oud.

4.2 Om accuraat zijn, maar muizen worden gewogen voordat injectie van het verdovingsmiddel oplossing. Als een gids, is ongeveer 50-75 microliter van verdoving-oplossing voor de 20 dagen oude muizen. De muis is volledig verdoofd toen niet reageren op een snuifje in de staart of achterpoten ledematen. Terwijl in de IVIS, zal de muizen worden blootgesteld aan isofluraan, die zal toevoegen anesthesie. De timing van beeldvorming na infectie van de muizen is afhankelijk van de stam (stammen) van S. pneumoniae en influenza A-virus en gebruikt op de symptomen van belang. Het uitvoeren van een aantal proefprojecten om de timing van bioluminescent beeldvorming te optimaliseren kan noodzakelijk zijn.

4.3 Muizen kunnen worden geplaatst in een isolement box (die voorkomt dat verontreinigingen binnenkomen of verlaten van de doos) of als alternatief, kunnen direct worden geplaatst in het instrument voor de beeldvorming. We maken gebruik van de isolatie box voor experimenten met jonge muizen, met het oog op de muizen verdoofd blijven tijdens de beeldvorming procedure en om verontreiniging van het IVIS te voorkomen dat met S. pneumoniae en / of het influenza A-virus.

4.3 Gebruik een ventrale beeld van de muizen om een ​​beeld van de luchtwegen te verkrijgen. Een laterale opname van de muis zorgt voor een meer gevoelige beeld van de oren.

4.4 Als muizen rechtstreeks zijn geplaatst in de kamer, is isofluraan geleverd aan de muizen via de neus kegels. Voor experimenten waarin de jonge muizen worden gebruikt, wordt de isolatie box voorkeur, omdat de neus kegels passen niet op jonge muizen.

4.5 Thij totale belichtingstijd die nodig is om een ​​beeld vast te leggen kan variëren tussen de experimenten op basis van de sterkte van het signaal bioluminescent, de locatie van het signaal, bacteriële stam en de muis stam gebruikt. Wat dit laatste betreft, kan zowel pigment-en vacht aanzienlijk verminderen de totale detecteerbaar signaal. De camera op de IVIS Spectrum is een back-uitgedund, terug verlichte CCD en biedt een breed dynamisch bereik (65.536 grijstinten). Idealiter moet de belichtingstijd worden ingesteld tussen de 60 en 60.000 telt vast te leggen. In onze ervaring met C57BL / 6 muizen, het verhogen van de beeldvorming tijd voorbij zeven minuten niet sterk verbeteren van de signaal-ruisverhouding. Alternatieve opties voor het verhogen van de lichtgevende signaal omvatten het verhogen van de mate van binning (dwz tot groot) en het gebruik van een kleiner gezichtsveld. Belangrijk is, moet kwantificering niet worden uitgevoerd op gebieden binnen het beeld met verzadigde pixels, aangezien dit een onderschatte waarde voor het aantal gedetecteerde fotonen. Als u niet zeker met betrekking tot de optimale omstandigheden, kan de automatische belichting functie worden gebruikt als een leidraad.

4.5 Indien een sterke bioluminescente signaal in een deel van de muis is het belemmeren van de opsporing van bioluminescentie in een nabijgelegen regio, bepaalde regio's van de muis kan worden afgedekt met zwart papier en beeldvorming kan gaan als normaal

4.7 Indien het luminescerende signaal wordt gekwantificeerd in fotonen (in tegenstelling tot counts) variaties in de beeldvorming omstandigheden (bijv. beeldvorming tijd) tussen de experimenten heeft geen invloed op de meting van de lichtgevende signaal.

4.8 Bij gebruik van het totale flux naar de fotonen te meten in een bepaald gebied, dat dezelfde 'region of interest' vorm is gebruikt voor alle monsters.

5.1a Muizen kunnen worden gedood op elk tijdstip na infectie met influenza A-virus, afhankelijk van de interesse van de onderzoeker. We meestal vast te stellen bacteriële en virale titer op 6 dagen na de infectie met influenza A-virus Udorn/307/72 (H3N2) en niet in acht te nemen sterfte / morbiditeit. Echter, morbiditeit en mortaliteit waargenomen in deze experimenten variëren afhankelijk van de S.pneumoniae en de influenza A-virus stam gebruikt en de chosed tijdstip moeten sterfte-en ziektecijfers rekening met de impact op het welzijn van dieren te minimaliseren. Tabel 3 geeft een nuttige gids voor criteria voor steunverlening en humane eindpunten voor gebruik in deze experimenten. Over het algemeen muizen zijn gedood en weefsel verwerkt zoals beschreven binnen 3 uur na in vivo bioluminescente beeldvorming.

5.1b Muizen jonger dan 10 dagen oud zijn bestand tegen hypoxie en worden gedood door onthoofding. In de beschreven experimentele opstelling, muizen zijn minstens 14 dagen oud en kan worden gedood door CO ₂ stikken.

5.7 Bloed-agar platen kan worden aangevuld met 5μg/ml gentamicine om de groei van commensale bacteriën te voorkomen in homogenaten van nasale weefsels. Het bereik van de gebruikte verdunningen zal afhangen van de S. pneumoniae stam gebruikt. Voor experimenten in 20 dagen oude muizen met S. pneumoniae stam EF3030 maken we gebruik van nette, 10e-1, 10e-10e-2 en 3.

5,8 Store elk monster van gehomogeniseerd weefsel in ten minste twee porties, zodat een back-up monster is beschikbaar voor het geval het virus plaque assay mislukt! Een nauwkeurige virale titer kan alleen worden verkregen uit een monster eenmaal ontdooid na het bevriezen, maar niet van stalen herhaaldelijk bevroren en ontdooid.

6.1 Wanneer gegroeid 90-100% confluent, zal een enkele 150 cm ² weefselkweek fles opbrengst genoeg MDCK cellen voor vijf 6-well platen.

6.5 De ​​optimale seriële verdunning zal afhangen van de gebruikte virusstam en de tijd na de infectie. Normaal gesproken zouden we gebruik van nette, 10e-10e-1 en 2 verdunningen voor orgel homogenaten die 6 dagen na infectie met influenza A-virus.

6.6 Het gebruik van seriële verdunningen van het virus voorraad is een geschikte positieve controle voor gebruik in elk plaque assay. Als een negatieve controle, kan RPMI + worden gebruikt.

8. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Schematische weergave van bevruchte kippenei.

Figuur 2. BLI van S. pneumoniae besmette muis op dag 3 en dag 4 na mock infectie met influenza virus.

Figuur 3. BLI van S. pneumoniae en influenza virus geïnfecteerd muis op dag 3 en dag 4 na infectie met influenza virus.

Figuur 4. Bacteriële belasting in de neus van een single en een co-infectieted muis.

Figuur 5. Virale titers in de neus en de longen van een co-infectie muis.

Media	Inhoud
1,8% (w / v) Agarose	Voeg 0,9 gram agarose tot 50 ml gedestilleerd H 2 O, steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C gedurende 10min. Transfer naar 56 ° C waterbad om af te koelen.
Dubbele sterkte Leibovitz's L15 medium (ds L15)	Een tas van de L15 poeder (om make-up 1L) wordt opgelost in 450 ml steriel gedistilleerd H 2 O en geroerd totdat het is opgelost. De pH is ingesteld op pH 6,8 met 1M HCl. Vervolgens te vullen met 4 ml van 7% (w / v) NaHCO3, 0,4 ml HEPES (0,5 M, pH 6,8), 200 U / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, 60 ug / ml gentamicine. Stel uiteindelijke volume tot 500 ml en filter steriliseren.
Paard Blood Agar (HBA)	4% HBA (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk), dH 2 O, 7% (v / v) Horse Blood
RF10	RPMI-1640 met 2 mM glutamine, 2nm natriumpyruvaat, 24 ug / ml gentamycine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10% (v / v) door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum.
RPMI +	RPMI-1640 met 2 mM glutamine, 2nm natriumpyruvaat, 24 ug / ml gentamycine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine
Todd-Hewitt bouillon + 0,5% gistextract	Todd Hewitt bouillon (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk) in dH 2 O aangevuld met 2% (w / v) gistextract

Tabel 1. Specifieke media gebruikt in dit protocol.

Materiaal Naam	Type	Vennootschap	Catalogus Nummer	Commentaar
RPMI-medium 1640	Reagens	Gibco	21870-076
Trypsine	Reagens	Worthington Biochemische Corporation	LS003740	TPCK behandeld
Leibovitz's L-15-medium	Reagens	Gibco	41300-039
Agarose, type I	Reagens	Sigma-Aldrich	A6013	Gebruik lage smelttemperatuur agarose, zoals SeaPlaque agarose
Madin-Darby Canine Kidney cellen	Reagens	ATCC	CCL-34

Tabel 2 Specifieke reagentia en apparatuur.:

Effect op dierenwelzijn
	Lichte tot matige tekenen een	Ernstige tekenen b
Niet-specifieke teken (s):
Uiterlijk	Lichte tot matige piloerectie zonder uitdroging (huid tenting)	Piloerectie, met uitdroging (huid tenting)
Body Condition	verminderde gewichtstoename	Geen gewichtstoename of afname van gewicht
Gedrag	Gedempte doch reagerende, verminderde interactie met leeftijdsgenoten.	Niet reageren op activiteit en provocatie. Geïsoleerd van de andere nestgenoten
Specifieke voorwaarden of abnormale klinische teken (s):
Afwezigheid van melk spot (<2-3 dagen oud)	Probeer aan te moedigen zuigen als dit is waargenomen voor <24 uur.	Als er geen bewijs van melk spot zelfs met aanmoediging na 24-48u, of als er duidelijk niet heeft gezoogd, overweeg dan euthanasie.
Andere tekenen	Zoeken Animal Facility Manager / Laboratory Animal dierenarts advies re: passende maatregelen of euthanise als dier in een matige of ernstige pijn of angst

Tabel 3. Criteria voor steunverlening voor de jonge muizen (<21 dagen oud):

^een Wanneer een of meer 'lichte tot matige' tekens zijn waargenomen toename frequentie van de waarnemingen tot tweemaal daags en ​​advies inwinnen van dierenwelzijn in voorkomend geval, zodat behandeling en zorg kan worden gegeven.

^b Wanneer een of meer 'ernstige' symptomen worden waargenomen, euthanise de muizen met behulp vanjuiste methode. Muizen <10 dagen oud zijn gedood door onthoofding, muizen> zijn 10 dagen oud gedood door CO ₂ stikken.

Discussion

In vivo beeldvorming met de IVIS machine is een unieke methode die de real-time visualisatie van de microbiële pathogenese ^{4, 6-9} maakt. Hier laten we de toepassing van deze technologie het begrijpen van de synergie tussen S. pneumoniae en influenza virus bij jonge muizen. Als gevolg van de niet-invasieve karakter van deze techniek, zijn we in staat geweest om de progressie van de infectie in elke individuele muis over tijd te volgen. Dit heeft ons in staat om de kinetiek van pneumokokken transmissie document onder de co-gehuisvest jonge muizen ^3. De niet-invasieve karakter van deze techniek stelt onderzoekers in staat om te gebruiken minder dieren per experiment en daarmee verminderen van dieren gebruik. Het is ook mogelijk om de IVIS machine te gebruiken om de verspreiding van de infectie te visualiseren om voorheen onbekende sites van infectie in het lichaam, als websites niet gemakkelijk bemonsterd door dissectie (zoals het middenoor).

Voor het begin van de imaging experimenten hebben we bevestigd dat kolonisatie niveaus van de lichtgevende EF3030 stam waren vergelijkbaar met kolonisatie niveau van de moedermaatschappij EF3030 stam door te bepalen levensvatbaar tellen in weefsel homogenaten. Daarnaast hebben we eerste bevestigde dat besmetting met het influenzavirus resulteerde in een verhoogde belasting van bioluminescente EF3030 in de nasofarynx van gekoloniseerde dieren, zoals blijkt met de ouder EF3030 stam (resultaten niet getoond).

Terwijl de IVIS technologie is eenvoudig te bedienen en genereert reproduceerbaar en gemakkelijk om gegevens te begrijpen, moeten experimenten zorgvuldig worden ontworpen dat de gevoeligheid en het nut van de technologie is gemaximaliseerd. Bijvoorbeeld, is de gevoeligheid van de camera IVIS beïnvloed door de diepte en de ondoorzichtigheid van het weefsel ^8, die in onze ervaring, verhoogt de detectiegrens voor bioluminescente signalen afkomstig van de longen. Daarnaast, donkere vacht en gepigmenteerde huid vermindert de lichttransmissie met maar liefst 10-voudige (in vergelijking met haarloze muizen) ^8. Bij de ontwikkeling van deze methode, hebben wij dit protocol geoptimaliseerd voor gebruik met 5 tot 14 dagen oud C57BL / 6 muizen en hebben sindsdien aangetoond dat IVIS kan worden gebruikt om de kolonisatie van 20 dagen oud C57BL / 6 muizen te detecteren met lichtgevende S. pneumoniae EF3030. Kan echter signaaldetectie worden verhoogd wanneer deze experimenten worden uitgevoerd in naakt of BALB / c muizen. Toch is de IVIS camera vertegenwoordigt een nieuwe benadering te monitoren, te karakteriseren en uiteindelijk de in vivo ontwikkeling van pneumokokkeninfecties te begrijpen na influenza A-virus infectie.