באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

Summary

במקביל זיהום בנגיף שפעת היא אחד הגורמים המעורבים אינדוקציה של המחלה pneumococcal פולשנית במהלך אסימפטומטיים

Abstract

במהלך מגיפת שפעת וירוס 1918, בו נהרגו כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם, רוב ההרוגים לא היו תוצאה של זיהום בנגיף שפעת לבד. במקום זאת, רוב האנשים הם חשבו נכנעו זיהום חיידקי משני, שנגרם ברובה על ידי חיידק סטרפטוקוקוס pneumoniae (pneumococcus). יחסים סינרגטיים בין זיהומים הנגרמים על ידי וירוס שפעת ואת pneumococcus יש לאחר מכן נצפתה במהלך מגיפת שפעת אסיאתית וירוס 1957, וכן במהלך התפרצות עונתית של הנגיף (הנסקרת ב ^{1, 2).} כאן אנו מתארים פרוטוקול המשמש לחקור את המנגנון (ים) שעשויים להיות מעורבים תחלואה מוגברת כתוצאה משפעת במקביל וירוס וס דלקת ריאות. פיתחנו מודל Murine התינוק אמין reproducibly להדגים את ההשפעות של זיהום בנגיף שפעת של עכברים יישבו עם ס ' דלקת ריאות. שימוש בפרוטוקול זה, סיפק לנו את התובנה הראשונה לתוך קינטיקה של שידור pneumococcal בין שיתוף שוכנו, עכברים הילוד באמצעות in vivo הדמיה ^3.

Protocol

1. הכנת מאגר זיהומיות של Bioluminescent ס דלקת ריאות

1. לחסן צינור מקרטני המכיל 10 מ"ל Todd-יואיט מרק בתוספת 0.5% (w / v) תמצית שמרים פיסה קטנה של אגר דם עם bioluminescent ס pneumoniae ולגדול באופן סטטי על 37 ° C עד צפיפות אופטית (600nm) של 0.40-0.45.
2. הנח את הקרח על תרבות רטוב עבור 5 דקות כדי לעצור את התאים בשלב זה צמיחה.
3. כדי מ"ל 10 של אמצע יומן שלב הצמיחה ס pneumoniae להוסיף 1 מ"ל של 80% (v / v) גליצרול ומערבבים, aliquot לתוך כרכים הרצוי החנות ב -70 ° C.
4. לקבוע את המינון זיהומיות של ס bioluminescent pneumoniae המניות על ידי ספירת קיימא של דילולים סדרתי על צלחות אגר דם.

2. צמיחה הכנת מלאי וירוס שפעת

1. שפעת וירוס הוא גדל נוזל allantoic של 10 יום ביצים הישן עוף embryonated.
2. הפשירי בקבוקון עם וירוס שפעת 37 ° C אמבט מים.
3. בעזרת מקור אור ממוקם מעל (ליקטה את הביצים) airsac, לסמן על הקליפה ביצה את מיקומו של שק האוויר בנקודה ללא ורידים הבסיסית.
4. לחטא את פני השטח של הביצים על ידי מנגב עם אתנול 70% ולנגב נקי.
5. פירס חור קטן שק האוויר מעל לסמן באמצעות הסופר של צורף.
6. עם הביצים ממוקם בתוך קרטון עם העליון האוויר שק, יש להשתמש במזרק 1mL 13mm ומחט 26G לחסן כל ביצה דרך חור במעטפת עם 0.1mL של שפעת מדולל כראוי וירוס. נקודת ישירות כלפי מטה מחט לחלל allantoic, פירסינג airsac.
7. חותם את החור עם שעווה מותכת לדגור על הביצים במשך 2 ימים humidified ביצה החממה ב 35 ° C. אחרי 2 ימים נר הדגירה, ביצים כדי לבדוק נוכחות של כלי דם כדי לאשר את העובר עדיין חי. אם הביצה הוא שחור בפנים, העובר מת וגם את הביצה צריך להיות מושלך ולא משמש קצירת של וירוס שפעת.
8. מניחים את הביצים על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להרוג את העוברים כדי להצר כלי דם על מנת למזער הפרעה של כלי, כמו מגע בין דם וירוס תביא מחייב של הנגיף לתאי דם אדומים.
9. למחרת, לחטא את פני השטח של הביצים על ידי מנגב עם אתנול 70%.
10. עבודה בכיתה השנייה biosafety הממשלה כדי לאסוף את הנוזלים allantoic המכילים את נגיף שפעת A מן הביצים. הסרת שעווה להשתמש במספריים מעוגלים לחתוך סביב החלק העליון של הביצה כדי להסיר את שק האוויר מעל הממברנה allantoic.
11. לנקב לקלף בחזרה את הממברנה allantoic באמצעות מלקחיים סטרילית.
12. לשאוב את הנוזל allantoic עם פיפטה 10 מ"ל סטרילי תוך החזקת העובר לצד אחד עם פיפטה אחרת סטרילית. איסוף הנוזלים allantoic נקווה 50 מ"ל צינורות לשמור על הקרח בכל עת. אם הנוזל הוא allantoic דם או חלמון לא להוסיף לבריכה.
13. צנטריפוגה נוזל allantoic עבור 5min ב 2000 סל"ד בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות.
14. Aliquot הנוזל allantoic זיהומיות 1-2 cryotubes מ"ל ולאחסן ב -70 ° C.
15. קבע את שפעת A titre וירוס של נוזל allantoic מופשר ב 3 מבחני פלאק ביצעה באופן עצמאי להרכיב מדין ב-דארבי תאים כליות בכלבים (ראה להלן). השתמש aliquot חדש של וירוס עבור כל ניסוי. חוזרות ונשנות להקפיא הפשרת תפחית את titre infectivity.

3. זיהום Intranasal של עכברים עם bioluminescent ס דלקת ריאות ו / או וירוס שפעת A

1. הפשירי מניות קפוא של bioluminescent ס דלקת ריאות ו לדלל את המינון הרצוי PBS.
2. בעדינות להרים 5 עכברים הישן יום בין האצבע לאגודל להחזיק זקוף. השתמש פיפטה לירידה bioluminescent ס דלקת ריאות על nares בנפח של 3μl. חכו עד שכל inoculum הוא בשאיפה לפני הצבת העכבר בחזרה בכלוב. השתמש 3μl של PBS על זיהום מדומה.
3. שלושה עד תשעה ימים לאחר קולוניזציה עם bioluminescent ס דלקת ריאות, להפשיר aliquot של נוזל המכיל allantoic שפעת וירוס לדלל ב PBS לריכוז הרצוי. להדביק עכברים בווירוס שפעת בהיקף של 3μl PBS כמתואר בשלב 3.2. השתמש 3μl של נוזל allantoic בדילול מן הביצים נגוע לזיהום מדומה וירוס.
4. צג את רווחתם של עכברים היומית על ידי התבוננות במראה, התנהגות, מצב הגוף, בעכברים, כי הם ≤ 3 ימים, הנוכחות של כתמי חלב. מדריך עבור נקודות הקצה אנושית קריטריונים התערבות יש לפתח בהתייעצות עם הרופא הוטרינר בעלי חיים מעבדה (לוח 3).

4. Bioluminescent הדמיה באמצעות ספקטרום IVIS (Caliper מדעי החיים)

1. הכינו תערובת של קטמין בשעה 0.75 מ"ג / מ"ל ​​ו xylazine 1.76mg/ml מים להזרקה.
2. כדי לטשטש את העכברים, להזריק 100μl/10 גרם משקל גוף לתוך הצפקחלל.
3. המקום בעכברים מורדמים לתוך תיבת הדמיה. תשומת לב צריך להיות משולם כדי לשמור את האזור האנטומי של עניין מקבילים למצלמה כאשר הצבת העכבר בתוך תיבת הדמיה / קאמרית.
4. מקום בתיבה עם עכברים IVIS ולאפשר כניסה isoflurane לתוך התיבה בבית L 0.5 / min לשמור על הרדמה.
5. הגדר המכונה IVIS לתקן פלטפורמת הדמיה binning ו לכידת תמונה במשך 7 דקות.
6. אפשר עכברים להתאושש מן ההרדמה בקופסה התחמם (למשל באמצעות כרית חום) לפני החזרה הביתה כלוב.
7. תמונות מנותחים ומותאמים לאותו סולם באמצעות תמונה Living חבילת תוכנה גרסה 3.0 (Caliper מדעי החיים).
8. אותות Bioluminescent באזור נבחר של עניין ניתן לכמת כמו גם השטף הכולל (פוטון / s) או זוהר הממוצע (פוטונים / s / ס"מ ² / sr).

5. עיבוד של רקמות כדי לקבוע עומס חיידקים titer וירוס

1. עכברים הם euthanased בחנק CO ₂ ו הפרווה חיטוי באמצעות אתנול 70%.
2. לשתק את החיה על קרש חיתוך קשה.
3. בעזרת להב אזמל סטרילי, לחתוך באמצע הראש של החיה, החל האחורי, ולחשוף את לוע האף על ידי כיפוף בכל צד של הראש החוצה.
4. אסוף את רקמות האף והלוע של כל חיה על ידי גירוד הרקמה מהמחצית כל הראש באמצעות מלקחיים סטריליות ומניחים 1.5mL קר כקרח RPMI. שמור על הקרח.
5. פתח את בית החזה באמצעות מספריים להסיר את הריאות בעזרת מלקחיים סטריליות ומספריים. שוטפים את הריאות שלוש פעמים PBS להסיר כל הדם לאסוף 1.5mL קר כקרח RPMI. שמור על הקרח.
6. השתמש homogeniser homogenize אל הרקמות, במקום לחזור על הקרח.
7. הסרת aliquot של הרקמה הומוגני ושימוש זה על מנת לקבוע את עומס חיידקי. הכן דילולים הסידורי של homogenate רקמות הצלחת על HBA. צלחות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-24 שעות ולקבוע לספור קיימא. Titers חיידקים באיבר מסוים אז יכול להיות בקורלציה עם מספר של פוטונים נצפו באזור זה.
8. צנטריפוגה שאר הרקמות הומוגני ב 3500 סל"ד במשך 10 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant והעברה, צינורות נקי סטרילי. חנות supernatant ב -70 ° C ו לקבוע titer ויראלי ידי assay פלאק.

6. רובד assay כדי לקבוע שפעת A titer וירוס homogenates רקמה

1. Infectivity titers וירוס נקבעים על ידי היווצרות הפלאק על monolayers ומחוברות של הכליה מדין-דארבי כלבים (MDCK) תאים. תאים בתרבית הם MDCK שגרתי RF10 (טבלה 1) בתרבות בקבוקי רקמות (Nunc) ו passaged כאשר ומחוברות.
2. ניתוק התאים MDCK מתרבות בקבוקי רקמות באמצעות טריפסין. לשטוף את התאים RF10 לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1200 דקות 5. בטל supernatant ו resuspend התאים pelleted ב RF10. ספירת התאים MDCK באמצעות hemocytometer וצבע חיוני. Seed כל 35mm היטב 6-היטב צלחות (Nunc) עם 1.2x10 ⁶ תאים MDCK ב 3ml RF10 והתרבות התאים ב 37 ° C ו 5% CO ₂ כדי להשיג confluency (ב ~ 24 שעות).
3. הכן ליבוביץ dsL15 מדיה 1.8% (w / v) agarose כיסוי התקשורת (טבלה 1). DsL15 Aliquot מדיה 1.8% (w / v) agarose ב 50 מ"ל בבקבוק סטרילי. שמור dsL15 המדיה 4 ° C עד השימוש agarose ב 56 ° C עד השימוש.
4. בדוק כי תא monolayers MDCK הם ומחוברות לשטוף את התאים + RPMI ידי aspirating RF10 והחלפתו ~ 1.5ml RPMI +. בשום שלב בהליך הצלחות צריך להיות מותר לחלוטין להתייבש. דגירה צלחות ב 37 ° C עד מוכן להוסיף את דגימות המכיל וירוס.
5. הכן דילולים סדרתי של דגימות הווירוס RPMI +. שמור על דגימות קרח עד לשימוש.
6. לשאוב RPMI + מ monolayers ומוסיפים 135uL RPMI + של דילולים המתאים מדגם וירוס טוב כל אחד. בדיקת כל דגימה בשני עותקים.
7. דגירה התאים MDCK עם דגימות נגיף 45 דקות ב 37 ° C ו 5% CO _2. נער בעדינות את הצלחות כל 15 דקות כדי להפיץ את הווירוס באופן שווה למנוע התייבשות של monolayers תא MDCK.
8. הזז את agarose מ 56 ° C עד 46 ° C waterbath וחם dsL15 מדיה 46 מעלות צלזיוס waterbath.
9. לאחר 45min הדגירה של הנגיף על monolayers MDCK, לקחת את הצלחות של 5% CO ₂ באינקובטור. הסר agarose ו L15 מדיה 46 ° C waterbath. הוסף 0.2mL טריפסין של 0.1% ל 50 מ"ל של dsL15 התקשורת, מאשר להוסיף 50 מ"ל של dsL15 + טריפסין עד 50 מ"ל של 1.8% (w / v) agarose. מערבבים את agarose ו L15 בעדינות ולהוסיף 3mL של כיסוי בינוני עד טוב כל אחד 6-גם הצלחות. מערבולת בעדינות כדי להבטיח את שלמות התא monolayer MDCK מכוסה. לאחר כיסוי מוגדר צלחות לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ עבור 2-4 ימים.
10. בתום תקופת הדגירה, לספור את מספר הפלאק כאמצעי של הנגיף infectivity. אם יש צורך, הפלאק יכול להיות דמיינו ידי מכתים של monolayers עם סגול קריסטל מומס מתנול.

7. חלק ג'- סודות ההצלחה:

1 כל עבודה ניסויית עם ס ' דלקת ריאות (חיסון למשל תרבויות נוזלי, עיבוד של רקמות מעכברים נגוע S. pneumoniae) מבוצעת השנייה בכיתה biosafety הממשלה.

1.1 אנו יוצרים bioluminescent ס pneumoniae זנים ידי החדרת פלסמיד pPJTG28 ^3. עם זאת, מגוון רחב של שונות bioluminescent ס זנים pneumoniae זמינים 4-6. Bioluminescent ס זנים pneumoniae ניתן גם לרכוש Caliper מדעי החיים Inc (מסצ'וסטס, ארה"ב).

1.1 קינטיקה של גידול ס שונים זנים pneumoniae עשויים להיות שונים ואת צריך להיקבע עבור כל זן. זה עלול לקחת בין 3 עד 4 שעות כדי להגיע OD600nm = 0.4-0.45.

1.4 בדרך כלל היינו מצפים מניות זיהומיות להגיע ריכוז 10e8 CFU / ml ולהמליץ ​​מגוון דילול מ 10E-10E-4 עד 8 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים קיימא.

2.6 titre מתאים לשימוש inoculating את הביצים, תלוי זן הנגיף בשימוש, עשויים לנוע בין 10E-10E-3 עד 5. זני וירוס שפעת המתקבל supernatants בתרבית רקמה לעתים לשמש מסודר.

3.2a אנו משתמשים באופן שגרתי 2000 CFU ש pneumoniae זן EF3030 ליישב 5 עכברים בן יום ^3. המינון המדויק של inoculum זיהומיות נקבע בדיעבד על ידי ציפוי דילולים הסידורי של inoculum על סוס דם צלחות אגר עבור כל ניסוי. היכולת של ס זן pneumoniae ליישב עכברים נקבע לראשונה על ידי ספירה של קיימא homogenates רקמות (למשל לוע האף, הריאות) במספר נקודות זמן לאחר חיסון של העכברים.

3.2b אין צורך להשתמש anaestetics לנהל את החיידק או הנגיף החיות באמצעות אינהלציה. עכברים תינוקות (כמו גם עכברים בוגרים) צריך להיות מרוסנת על ידי יד ונתמכו החוקר, inoculum (3 microliter לעכברים התינוק, עד microliter 10 עבור עכברים בוגרים) אז הוא ירד אל nares ועל שאיפה של כל inoculum זוכה לאישור באמצעות עיון.

3.2c הסר עכברים בילוד אחד אחד מן הקן לחסן עם חיידקים או וירוסים כנדרש. סמן את הזנב של החיה באמצעות סמן קבע אם החיה הכרחי ולחזור חזרה לכלוב מיד. רוב החיות עם חומר מצעים כך הסכר יקבלו את הגורים בחזרה לתוך הקן. הערה: סמן קבע משפשף את החיות במהירות צריך להיות מיושם מחדש מדי יום. לחלופין, מערכת קעקוע יכול לשמש כדי לזהות בעלי חיים בודדים.

3.3 אנו משתמשים 20 PFU שפעת וירוס Udorn/307/72 (H3N2) להדביק 8-14 עכברים היום בן 3. תמותה ותחלואה שנצפתה החיות יהיה תלוי זן ש ' דלקת ריאות ושפעת וירוס בשימוש. לוח 3 מספק ערכה שימושית של נקודות קצה אנושית קריטריונים התערבות להשתמש בעכברים צעיר מכפי 21 ימים של גיל. אנחנו בדרך כלל אינם מזהים כל תחלואה או תמותה כאשר באמצעות ס דלקת ריאות ושפעת EF3030 זן הנגיף Udorn/307/72 (H3N2) כאשר העכברים הם> 10 ימים.

4.2 ליתר דיוק, עכברים יכולים להישקל לפני הזריקה של הפתרון הרדמה. כמדריך, כ 50-75 מיקרוליטר של ההרדמה משמש 20 עכברים ישנים ביום. העכבר הוא בהרדמה מלאה, כאשר לא להגיב קמצוץ בזנב או איבר האחוריות. בעוד IVIS, העכברים יהיה גם חשוף isoflurane אשר יוסיף הרדמה. העיתוי של הדמיה הבאים זיהום של עכברים תלוי המתח (ים) ש דלקת ריאות ושפעת וירוס השתמשו כמו גם על התסמינים של עניין. ביצוע ניסויי פיילוט כמה לייעל את העיתוי של bioluminescent הדמיה עשוי להיות נחוץ.

4.3 עכברים יכול להיות ממוקם בתוך תיבת בידוד (מה שמונע מזהמים להיכנס או לצאת את התיבה) או לחילופין, יכול להיות ממוקם ישירות לתוך מכשיר הדמיה. אנו משתמשים בתיבת בידוד עבור ניסויים עם עכברים התינוק, על מנת להבטיח את העכברים להישאר מורדם במהלך ההליך הדמיה על מנת למנוע זיהום של IVIS עם ס ' דלקת ריאות ו / או וירוס שפעת.

4.3 השתמש תמונת הגחון של עכברים כדי להשיג תמונה של דרכי הנשימה. התמונה לרוחב של העכבר מספק תמונה רגישה יותר של האוזניים.

4.4 כאשר עכברים ממוקמים ישירות לתוך החדר, isoflurane מועבר העכברים באמצעות קונוסים האף. עבור ניסויים בעכברים שבהם התינוק משמשים, תיבת הבידוד הוא העדיף מאז את הקונוסים האף לא מתאימים על עכברים התינוק.

4.5 Tזמן החשיפה הכולל הוא צריך ללכוד תמונה עשויה להשתנות בין ניסויים על פי חוזק האות bioluminescent, מיקום של מתח האות, חיידקים את המתח העכבר בשימוש. לגבי האחרון, הן פיגמנט פרווה יכול להחליש באופן משמעותי את האות לזיהוי מוחלט. המצלמה על הספקטרום IVIS היא גב דליל, בחזרה מואר CCD מציעה טווח דינמי רחב (65,536 רמות אפור). באופן אידיאלי, זמן החשיפה צריך להיות מוגדר ללכוד בין 60 ל 60,000 שחשוב. מניסיוננו עם C57BL / 6 עכברים, להגדיל את זמן מעבר הדמיה 7 דקות לא ניכר לשפר את יחס אות לרעש. אפשרויות חלופיות להגברת האות bioluminescent כוללים הגדלת מידת binning (כלומר גדולים) ושימוש שדה קטן יותר של התצוגה. חשוב לציין, כימות לא צריך להיות מבוצע על אזורים בתוך התמונה המכילה פיקסלים רווי, כמו זה מספק ערך העריכו נכונה את מספר הפוטונים זוהה. אם אינך בטוח באשר תנאים אופטימליים, התכונה Auto-חשיפה יכול לשמש כקו מנחה.

4.5 אם אות bioluminescent חזק בחלק אחד של העכבר הוא ולהקשות על איתור של פליטת אור באזור סמוך, אזורים נבחרים של העכבר יכול להיות מכוסה בנייר הדמיה שחור יכול להמשיך כרגיל

4.7 אם ​​האות זורח הוא לכמת של פוטונים (להבדיל ספירות) וריאציות בתנאים הדמיה (זמן הדמיה למשל) בין הניסויים לא ישפיעו על מדידה של האות bioluminescent.

4.8 אם באמצעות השטף הכולל למדוד את הפוטונים באזור מסוים, להבטיח כי "אזור עניין" באותה צורה משמש עבור כל הדגימות.

עכברים 5.1a יכול להיות מורדמים בכל נקודת זמן לאחר ההדבקה בנגיף שפעת, תלוי עניין של החוקר. אנו בדרך כלל קובעים titre חיידקים ווירוסים ב 6 ימים לאחר ההדבקה עם שפעת וירוס Udorn/307/72 (H3N2), ואינם רואים כל תמותה / תחלואה. עם זאת, התחלואה והתמותה שנצפו בניסויים אלו ישתנו בהתאם S.pneumoniae לבין שפעת זן הנגיף בשימוש נקודת זמן chosed צריך לקחת שיעורי תמותה ותחלואה בחשבון כדי למזער את ההשפעה על רווחת בעלי החיים. לוח 3 מספק מדריך שימושי קריטריונים ונקודות קצה התערבות אנושית לשימוש בניסויים אלו. באופן כללי, עכברים מומתים ורקמות מעובד כמתואר בתוך 3 שעות לאחר in vivo bioluminescent הדמיה.

5.1b עכברים מתחת לגיל 10 ימים עמידים היפוקסיה ו - מומתים על ידי עריפת ראש. בהגדרת הניסוי המתואר, עכברים לפחות 14 ימים ועלול להיות מורדמים בחנק CO _2.

5.7 דם צלחות אגר ניתן להשלים עם 5μg/ml גנטמיצין כדי למנוע התפתחותם של חיידקים commensal ב homogenates של רקמות האף. טווח דילולים שימוש יהיה תלוי ס pneumoniae זן בשימוש. עבור ניסויים בעכברים בן 20 יום עם ס ' pneumoniae זן EF3030, אנו משתמשים מסודר, 10E-1, 2 ו-10E 10E-3.

5.8 חנות כל דגימת רקמה הומוגני בלפחות שני aliquots, כך מדגם גיבוי זמין במקרה assay פלאק וירוס נכשלת! Titer ויראלי מדויק יכולה להיות מושגת רק ממדגם מופשר פעם אחרי הקפאה אבל לא ממדגמים שוב ושוב להקפיא מופשר.

6.1 כאשר גדל ומחוברות 90-100%, תרבות אחת 150cm ² בקבוק תניב רקמות תאים MDCK מספיק במשך חמש 6-גם הצלחות.

6.5 דילול סדרתי האופטימלי יהיה תלוי זן הנגיף בשימוש ואת הזמן לאחר ההדבקה. בדרך כלל, היינו להשתמש מסודר, 10E-1 ו-10E-2 דילולים עבור איבר homogenates לקח 6 ימים לאחר ההדבקה בנגיף שפעת.

6.6 שימוש דילולים הסידורי של המניות וירוס הוא פקד חיובי מתאים לשימוש assay כל פלאק. כביקורת שלילית, RPMI + ניתן להשתמש.

8. נציג התוצאות:

באיור 1. תרשים סכמטי של ביצת תרנגולת embryonated.

איור 2. BLI ש דלקת ריאות נגוע העכבר על יום 3 יום 4 לאחר ההדבקה בנגיף שפעת מדומה.

איור 3. BLI ש דלקת ריאות ושפעת שיתוף הנגועים בווירוס העכבר על יום 3 יום 4 לאחר ההדבקה בנגיף שפעת.

איור 4. עומס בקטריאלי באף של יחיד שותף infecטד העכבר.

איור 5. Titres ויראלי באף הריאות של העכבר שיתוף נגועים.

מדיה	תוכן
1.8% (w / v) agarose	הוסף 0.9 גרם של agarose כדי מזוקקים 50 מ"ל H 2 O, לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C עבור 10min. העברה 56 ° C waterbath להתקרר.
פעמיים כוח ליבוביץ של L15 בינוני (DS L15)	1 ילקוט של אבקת L15 (כדי לפצות על 1 ליטר) הוא מומס 450 מ"ל סטרילי מזוקקים H 2 O ובחש עד שהיא נמסה. ה-pH מותאם pH 6.8 עם 1M HCl. אז עם תוספת של 7% 4mL (w / v) NaHCO3, 0.4mL HEPES (pH 0.5m, 6.8), 200 U / ml פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 60 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. התאם את נפח הסופי 500ml ולסנן לעקר.
דם על סוסים אגר (HBA)	4% HBA (Oxoid, Basingstoke, בריטניה), ד"ה 2 O, 7% (v / v) דם על סוסים
RF10	RPMI-1640 המכיל 2mm גלוטמין, pyruvate 2nM נתרן, 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 10% (v / v) חום מומת סרום עגל עוברית.
RPMI +	RPMI-1640 המכיל 2mm גלוטמין, pyruvate 2nM נתרן, 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין
טוד-יואיט מרק + 0.5% תמצית שמרים	טוד יואיט מרק (Oxoid, Basingstoke, בריטניה) ב DH 2 O בתוספת 2% (w / v) תמצית שמרים

טבלה 1. בתקשורת ספציפיות בשימוש בפרוטוקול זה.

חומר שם	סוג	חברה	מספר קטלוגי	הערה
RPMI בינוני 1640	מגיב	Gibco	21870-076
טריפסין	מגיב	וורטינגטון ביוכימיים Corporation	LS003740	TPCK מטופלים
ליבוביץ של L-15 בינוני	מגיב	Gibco	41300-039
Agarose, סוג אני	מגיב	סיגמא אולדריץ	A6013	השתמש נמוכה טמפרטורת ההתכה agarose, כגון SeaPlaque agarose
מדין-דארבי כליה תאים כלב	מגיב	ATCC	CCL-34

טבלה 2 ריאגנטים ספציפיים וציוד.:

השפעה על רווחת בעלי החיים
	קלה עד מתונה סימנים	ב סימנים חמור
ללא סימן ספציפי (ים):
הופעה	קלה עד בינונית piloerection עם התייבשות לא (האהלה העור)	Piloerection, עם התייבשות (האהלה העור)
מצב הגוף	משקל מופחת רווח	אין עליה במשקל או ירידה במשקל
התנהגות	תגובה מאופקת אך, ירידה אינטראקציה עם בני גילם.	מגיב פעילות פרובוקציה. מבודדת מן להמלטה אחרים
תנאים ספציפיים או סימן קליני חריג (ים):
העדר נקודה חלב (<2-3 ימים)	נסו לעודד יונק אם זו נצפתה עבור <24 שעות.	אם אין עדות במקום חלב אפילו בעידוד לאחר 24-48h, או אם כמובן לא היניקה, לשקול המתת חסד.
סימנים אחרים	מתקן חתירה בעלי חיים מנהל / מעבדה בבעלי חיים וטרינר עצה מחדש: בפעולה המתאימה או euthanise אם החיה היא כאב מתון או חמור או מצוקה

לוח 3. התערבות קריטריונים עכברים תינוק (<21 ימים):

כאשר אחד או יותר "קלה עד בינונית" הסימנים הם נצפו להגדיל את תדירות התצפיות פעמיים ביום להתייעץ קצין חיה הרווחה במידת הצורך, כך הטיפול והטיפול יכול להינתן.

^ב כאשר אחד או יותר "חמור" הסימנים הם נצפו, euthanise העכברים באמצעותשיטה המתאימה. עכברים <10 ימים מומתים על ידי עריפת ראש, עכברים> 10 ימים מומתים בחנק CO _2.

Discussion

בשנת vivo הדמיה עם המכונה IVIS היא מתודולוגיה ייחודית המאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת בפתוגנזה של חיידקים ^{4, 6-9.} כאן, אנו מציגים את היישום של טכנולוגיה זו להבנת סינרגיזם בין ס דלקת ריאות ושפעת הנגיף בעכברים התינוק. בשל האופי הלא פולשנית של טכניקה זו, הצלחנו לעקוב אחר ההתקדמות של זיהום עכבר בנפרד במשך הזמן. זו אפשרה לנו לתעד את קינטיקה של שידור pneumococcal בין שיתוף שוכנו עכברים התינוק ^3. אופי פולשני של טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשתמש פחות לכל ניסוי בבעלי חיים, ולכן להפחית את השימוש בבעלי חיים. אפשר גם להשתמש במכונה IVIS לדמיין את הפצת הזיהום לאתרים ידועים קודם לכן של זיהום בגוף, כמו גם באתרים לא שנדגמו בקלות על ידי דיסקציה (כגון באוזן התיכונה).

לפני תחילת הניסויים הדמיה, אנו מאשרים כי רמות קולוניזציה של המתח EF3030 bioluminescent היו דומים לרמות קולוניזציה של זן ההורה EF3030 על ידי ספירת מספר קיימא homogenates רקמות. בנוסף, אנחנו הראשונים אישר כי זיהום בנגיף שפעת הביא עומס מוגבר bioluminescent EF3030 בתוך לוע האף של קולוניזציה חיות הפגינו עם זן ההורה EF3030 (תוצאות לא מוצג).

בעוד הטכנולוגיה IVIS קל לפעול ומייצר לשחזור וקל להבנה נתונים, ניסויים חייב להיות מתוכנן בקפידה כך רגישות השירות של הטכנולוגיה מוגדל. לדוגמה, הרגישות של המצלמה IVIS מושפע לעומק האטימות של הרקמה ^8, אשר מניסיוננו, מגביר את גבול הגילוי של אותות שמקורם bioluminescent הריאות. בנוסף, פרווה כהה עור פיגמנטציה מקטינה העברת אור על ידי ככל 10 פי (לעומת עכברים חסרי שיער) ^8. בעוד בפיתוח בשיטה זו, יש לנו אופטימיזציה בפרוטוקול זה לשימוש עם C57BL 5-14 יום הישן / 6 עכברים הראו כי מאז IVIS יכול לשמש כדי לזהות קולוניזציה של C57BL בן 20 יום / 6 עכברים עם bioluminescent ס pneumoniae EF3030. עם זאת, זיהוי האות ניתן להעלות כאשר אלה מבוצעים ניסויים בעכברים בעירום או BALB / ג. עם זאת, המצלמה IVIS מייצג גישה חדשנית לפקח, לאפיין, ובסופו של דבר להבין את התפתחות vivo של מחלת ריאות בעקבות זיהום בנגיף שפעת A.