の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

Summary

インフルエンザウイルスとの同時感染は無症候性の中に侵襲性肺炎球菌疾患の誘導に関与する要因の一つです。

Abstract

全世界で約50万人を殺した1918年のインフルエンザウイルスのパンデミック、中に、死者の大半は、インフルエンザウイルス単独感染の結果ではなかった。代わりに、ほとんどの個体は主に細菌肺炎球菌 （肺炎球菌）によって引き起こされる、二次的細菌感染に屈していると考えられている。インフルエンザウイルスや肺炎球菌によって引き起こされる感染症との間の相乗関係が続いて^（1、2のレビュー）だけでなく、ウイルスの季節的流行時など、1957年アジアインフルエンザウイルスのパンデミックの間に観察されている。ここでは、同時インフルエンザウイルスとS.の結果として増加する罹患率に関与することができる機構（s）を調査するために使用されるプロトコルについて説明肺炎の感染症。我々は、確実にかつ再現性S.を保菌してマウスのインフルエンザウイルス感染の効果を実証するために乳児マウスモデルを開発している肺炎 。このプロトコルを使用して、我々 は 、in vivoイメージング³ で使用して共同収容、新生マウスの間に肺炎球菌感染の動態に最初の洞察を提供している。

Protocol

1。生物発光S.の感染株式の調製肺炎

1. 0.5％（w / v）酵母エキスおよび生物発光S.と血液寒天培地の小片を添加した10ミリリットルトッド-ヒューイットブロスを含むマッカートニーのチューブを接種する肺炎と37℃静的に成長° C 0.40から0.45の光学密度（600nmの）へ。
2. この増殖期に細胞を逮捕するために5分間氷上に文化を置きます。
3. 中期対数増殖期S. 10mlに肺炎は、1 80％の液（v / v）のグリセロールと混合、目的のボリュームに分注し、-70℃で保存を追加
4. 生物発光S.の感染用量を決定する血液寒天プレート上で系列希釈の菌数による肺炎の株式。

2。インフルエンザウイルスの株の成長と準備

1. インフルエンザウイルスは、10日齢発育鶏卵の尿膜液で栽培されています。
2. 37℃の水浴中でインフルエンザウイルスとのバイアルを融解。
3. マークは、卵の殻で、基盤となる静脈の自由な点での空気の嚢の位置をairsac（キャンドル）の上に配置する光源を使用する。
4. 70％エタノールで拭いて卵の表面を消毒して拭いてください。
5. ピアースだけで宝石商のスクライブを使用してマーク上記の気​​嚢に小さな穴。
6. 気嚢の最上位とカートンに位置付け卵で、適切に希釈したインフルエンザウイルスの0.1mlを持つシェルの穴を介して各卵に接種する13ミリメートル1mLのシリンジと26G針を使用してください。 airsacを刺し、尿膜腔に針を直接下方を指す。
7. 溶けたワックスと穴をシールし、35℃加湿卵インキュベーターで2日間、卵をインキュベート℃を2日間のインキュベーションの後、ろうそく卵は胚を確認するために血管の存在を確認するには、まだ生きている。卵が内部に黒の場合、胚が死亡していると卵は廃棄されるべきであるとインフルエンザウイルスの収穫には使用されません。
8. 胚を殺すために℃で一晩4℃で卵を置き、血とウイルスとの間の接触は、赤血球にウイルスの結合の結果になるように、血管の混乱を最小限にするために、血管を収縮する。
9. 翌日、70％エタノールで拭いて卵の表面を消毒する。
10. 卵からインフルエンザウイルスを含む尿膜腔液を収集するためのクラスIIバイオセーフティキャビネットで動作する。ワックスを削除し、尿膜上に気嚢を削除するには、卵の上部の周囲にカットする湾曲したハサミを使う。
11. 穿刺およびバックピール滅菌ピンセットを用いて尿膜を。
12. 別の滅菌ピペットを用いて片側に胚を保持しながら10mLの滅菌ピペットで尿膜液を吸引除去する。 50mLのチューブにプールされた尿膜液を収集し、常に氷上に置きます。尿膜液は血性であるか、または含まれている場合、卵黄は、プールに追加しないでください。
13. 残渣を除去するために、室温で2,000 rpmで5分間尿膜液を遠心分離します。
14. -70 1〜2ミリリットルクリオチューブとストア内の一定分量感染尿膜腔液を℃に
15. インフルエンザのMadin - Darbyイヌ腎細胞の3独立して行うプラーク形成アッセイ（下記参照）で解凍した尿膜腔液のウイルスの力価を決定する。各実験のためのウイルスの新しいアリコートを使用してください。凍結融解は、感染力価が低下します。

3。生物発光S.とマウスの鼻腔内感染肺炎および/ ​​またはインフルエンザウイルス

1. 生物発光S.の凍結ストックを解凍肺炎とPBSで所望の投与量に希釈する。
2. ゆっくりと人差し指と親指の間の5日齢のマウスを拾うと直立ホールド。生物発光S.を削除するには、ピペットを使用して、 3μlの体積の鼻孔の上に肺炎 。接種のすべてがケージに戻ってマウスを置く前に吸入されるまで待ちます。モック感染のためにPBSの3μlを使用してください。
3. 生物発光S.による植民地化後の3〜9日肺炎は 、インフルエンザウイルスを含む尿膜腔液のアリコートを解凍し、所望の濃度にPBSで希釈する。ステップ3.2で説明したように3μlPBSの量のインフルエンザウイルスをマウスに感染する。モックウイルス感染に感染していない卵から希釈尿膜腔液の3μlを使用してください。
4. ミルクのスポットの存在を、≤3日経過しているマウスで、その外観、行動、身体の状態を観察し、毎日マウスの福祉を監視します。人道的エンドポイントと介入の基準のためのガイドは、実験動物の獣医（表3）と協議して開発する必要があります。

4。 IVISスペクトラム（キャリパーライフサイエンス）を用いて生物発光イメージング

1. 注射水に0.75 mg / mlのとキシラジン1.76mg/mlでケタミンの混合物を準備します。
2. マウスをanaesthetizeに、腹膜に100μl/10gの体重を注入する空洞。
3. イメージングボックスに麻酔したマウスを置きます。細心の注意をイメージングボックス/室のマウスの内部を配置するときにカメラに平行に関心の解剖学的領域を維持するために支払われるべきである。
4. 場所のIVISのマウスとボックスと0.5 L / minのボックスにイソフルランエントリは、麻酔を維持することができます。
5. イメージングプラットフォームとビニングを修正し、7分間のイメージをキャプチャするIVISのマシンを設定します。
6. マウスがホームケージに戻る前に温めておいたボックス（例えば、ヒートパッドを使用して）で麻酔から回復することができます。
7. 画像を分析し、リビングイメージのソフトウェアパッケージのバージョン3.0（キャリパーライフサイエンス）を使用して、同じスケールに調整されます。
8. 興味のある選択された領域の生物発光シグナルは、全光束（光子/秒）または平均輝度（光子/秒/ cm ^2で / SR）のいずれかとして定量することができる。

5。細菌負荷とウイルス力価を決定するために組織の処理

1. マウスをCO ₂窒息により安楽死と毛皮は70％エタノールを使用して消毒している。
2. ハードカッティングボード上の動物を固定化する。
3. 滅菌外科用メスの刃を使用して、後部開始、動物の頭部の中央を通るカット、と頭を外側の両側を折り曲げて鼻咽頭を公開。
4. 1.5mlの氷冷RPMIで滅菌ピンセットと場所を使用して頭部の半分ずつから組織を取ることによって、各動物の鼻咽頭組織を収集する。氷上に置きます。
5. はさみを使用して胸腔を開き、滅菌ピンセットやハサミを使って肺を削除します。肺に任意の血液を除去し、1.5mlの氷冷RPMIで収集するPBSで3回リンス。氷上に置きます。
6. 組織を均質化するホモジナイザーを使用し、氷上に戻って置きます。
7. ホモジナイズした組織液の一部を削除し、細菌の負荷を判断するために、これを使用してください。 HBA上の組織ホモジネートとプレートの連続希釈液を準備します。 37℃培養プレートは、° C 18から24まで時間のためにと生菌数を決定する。特定の器官の細菌力価は、その地域で観測された光子の数と相関することができます。
8. 4℃で10分間3,500 rpmでホモジナイズした組織の残りの部分を遠心上清を収集し、きれいな、滅菌チューブに移す。ストア上清-70 ° Cとプラークアッセイによるウイルス力価を決定する。

6。組織ホモジネートにおけるインフルエンザウイルスの力価を決定するためにプラークアッセイ

1. ウイルスの感染力価は、Madin - Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞のコンフルエントな単層上でプラーク形成によって決定されます。 MDCK細胞は、日常的に組織培養ボトル（ヌンク）のRF10（表1）で培養し、コンフルエント時に継代されています。
2. トリプシンを用いて組織培養ボトルからMDCK細胞を剥離する。 RF10で細胞を洗浄し、5分間1200rpmで遠心分離により細胞を収集する。上清を捨て、RF10でペレット化した細胞を懸濁します。血球計算板と生体染色色素を用いてMDCK細胞を数える。 37 3ミリリットルRF10と文化の細胞に1.2x10 ⁶ MDCK細胞を6ウェルプレートの各ウェルに35ミリメートルシード（Nunc社製）（〜24時間で）コンフルエント達成するために℃、5％CO _2。
3. リーボビッツdsL15メディアと1.8％（w / v）アガロースオーバーレイメディア（表1）を準備します。分注しdsL15メディアと滅菌ボトルに50mLの1.8％（w / v）をアガロース。 4時dsL15メディアを保管° C 56で使用してアガロース° Cまでは使用するまで。
4. MDCK細胞単層がコンフルエントであることを確認し、RF10を吸引し、それを置き換えることにより、RPMIの+で細胞を洗浄〜1.5ミリリットルRPMI +。手順のどの段階でプレートが完全に乾燥させる必要があります。 37プレートをインキュベート° Cウイルスを含むサンプルを追加する準備が整うまで。
5. RPMI +でのウイルスサンプルの連続希釈液を調製する。使用するまで氷上で保管してください。
6. 吸引単層からRPMI +と+はウイルスのサンプルの適切な希釈液を各ウェルに135uL RPMIを追加。重複して各サンプルをテストします。
7. ℃、5％CO _2は、37℃で45分間ウイルスのサンプルをMDCK細胞をインキュベートする。やさしく均等にウイルスを配布し、MDCK細胞単層の乾燥を防ぐためにプレートを15分ごとに振る。
8. 水浴の° Cは56から46℃まで° Cの水浴と暖かいdsL15メディア46にアガロースを移動します。
9. MDCK単層上のウイルスを45分インキュベーション後、5％CO ₂インキュベーターからプレートを取り出す。 46 ° Cの水浴からアガロースとL15メディアを取り出します。 50mLの1.8％（w / v）アガロースにdsL15 50mLに対して+トリプシンを追加するよりも、dsL15メディアの50mLのために0.1％トリプシンの0.2mlのを追加。アガロースと静かにL15を混合し、6ウェルプレートの各ウェルにオーバーレイ媒体の3MLを追加。ゆっくりと全体のMDCK細胞単層を確保するために渦が覆われている。一度オーバーレイを37℃で2〜4日間5％CO _2を培養するプレートが設定されています。
10. 潜伏期間の終了時に、ウイルスinfectiviの尺度としてプラークの数を数えるTY。必要であれば、プラークはメタノールに溶解し、クリスタルバイオレットで単分子膜の染色により可視化することができます。

7。セクションC - 成功への秘密：

1秒ですべての実験研究肺炎は、（液体培養の例：接種、 肺炎球菌に感染したマウスから採取した組織の処理）クラスIIバイオセーフティーキャビネットで行われます。

1.1我々は生物発光S.を作成するプラスミドpPJTG28 ^3を導入することにより、 肺炎球菌の菌株。しかし、別の生物発光S.の、多種多様な肺炎菌は4-6利用可能です。生物発光S.肺炎の株はまたキャリパーライフサイエンス社（マサチューセッツ州、米国）から購入することができます。

様々なS. 1.1成長カイネティクス肺炎の菌株が異なることがありますし、各系統ごとに決定されるべきである。それは、0.45にOD600nm = 0.4に達するまでに4〜3の間に時間がかかることがあります。

1.4我々は通常、10e8 CFU / mlの濃度に到達する感染株式を期待しており、生菌の濃度を決定するために10E - 4から10E - 8に希釈範囲をお勧めします。

卵を接種するために使用する2.6適切な力価は、使用されるウイルス株に依存し、10E - 3から10E - 5の範囲とすることができます。組織培養上清から得られたインフルエンザウイルス株は時々きちんと使用することができます。

3.2A我々は日常的にS. 2,000 CFUを使用肺炎ひずみEF3030は、5日齢のマウス^3を植民地化する。接種材料の正確な感染量は、ウマ血液寒天平板上で接種の連続希釈液をめっきすることにより、各実験のために遡及的に決定されます。 S.の能力マウスを植民地化する肺炎の菌株は、最初にマウスの接種後にいくつかの時点で組織ホモジネートの生菌数（例えば、鼻咽頭、肺）によって決定されます。

3.2bこれは、吸入による動物に、細菌やウイルスを管理するanaesteticsを使用する必要はありません。乳児マウス（だけでなく、成体マウスは）手で拘束し、捜査官が直立開催、接種（乳児マウスは3マイクロリットル、成体マウスのための最大10マイクロリットル）は、すべての接種の鼻孔と吸入にドロップされるべき観察によって確認されている。

3.2cは、新生マウス、必要に応じて細菌やウイルスと巣と接種から一つずつ削除します。必要とリターン動物なら、すぐにケージに戻って永久的なマーカーを使って動物の尾をマーク。ダムが巣に戻って子犬を受け入れるように、一部の寝具の素材で動物をこする。注：永久的なマーカーは、すぐに動物をはがれ、毎日再適用する必要があります。また、タトゥーのシステムは、個々の動物を識別するために使用されることがあります。

3.3私たちは3 8〜14日齢のマウスに感染し、20 PFUのインフルエンザウイルスUdorn/307/72（H3N2）を使用してください。動物で観察された死亡率と罹患率は、S.の菌株に依存します。 肺炎とインフルエンザはウイルスが使用。表3は、年齢の21日間未満のマウスで使用するために人道的エンドポイントと介入の基準の有用なセットを提供します。 S.を使用しているとき私達は通常、任意の死亡率や罹患率を検出しないマウスが> 10日間経過している肺炎 EF3030とインフルエンザウイルス株Udorn/307/72（H3N2）。

正確には4.2、マウスに麻酔液の注入前に重量を測定することができます。ガイドとして、麻酔液の約50から75マイクロリットルを20日齢のマウスに使用されます。マウスは、尾や後肢でピンチに応答していないときに完全に麻酔です。 IVISでいる間、マウスも麻酔を追加するとなるイソフルランに公開されます。マウスの感染後の画像のタイミングは、S.のひずみ（S）に依存肺炎とインフルエンザの関心の症状だけでなく、使用されるウイルス。生物発光イメージングのタイミングを最適化するためにいくつかのパイロット実験を実行する必要がある場合があります。

4.3マウスは、どちらかの隔離ボックス（ボックスを出入りするから汚染を防止する）に配置することができますあるいは​​、イメージングのための測定器に直接配置することができます。我々は、マウスが画像処理手順の実行中に麻酔を維持確保するためとS.とIVISの汚染を防ぐために、乳児のマウスを用いた実験のために隔離ボックスを使用肺炎および/ ​​またはインフルエンザウイルス。

4.3気道の画像を取得するためにマウスの腹側の画像を使用してください。マウスの横方向の画像は、耳のより敏感なイメージを提供します。

マウスをチャンバー内に直接配置されている4.4、イソフルランは、ノーズコーンを介してマウスに配信されます。ノーズコーンは、乳児マウスに適合しないので、乳児のマウスが使用される実験については、隔離ボックスが好ましい。

4.5 T彼は、イメージをキャプチャするために必要な総露光時間は、生物発光シグナルの強さに応じて実験の間で変化する信号、細菌株の位置とマウス系統は、使用することがあります。後者に関しては、顔料と毛皮の両方が大幅に合計検出可能な信号を減衰させることができます。 IVISスペクトラム上にカメラが裏面入射され、戻って広いダイナミックレンジを（65536階調グレーレベル）提供CCDを点灯。理想的には、露光時間は60〜6万カウントをキャプチャするために設定する必要があります。 C57BL / 6マウスとの我々の経験では、7分を超えて撮像時間を増加させることは著しく信号対雑音比を改善していません。生物発光シグナルを増加させるための代替オプションは、ビニングの度合いを増加させる（大にすなわち）とビューの小さなフィールドを使用して含まれています。これが検出された光子の数の過小評価して値を提供するので、重要なことは、定量化は、飽和画素を含む画像の内側の領域で実行されるべきではない。最適な条件のように不明な場合は、自動露出機能は、ガイドラインとして使用できます。

マウスのある部分で強い生物発光シグナルは、近隣の地域での生物発光の検出を妨害している場合、マウスの選択された領域を黒い紙と画像で覆うことができる4.5通常どおり続行できます。

4.7発光シグナルは、光子（としてカウントするのではなく）の実験の間に撮像条件の変化（例えば、撮像時間）生物発光シグナルの測定に影響しないことで定量化されている場合。

4.8指定された領域で光子を測定するための全光束を使用する場合、形状は同じ"関心領域"は、すべてのサンプルに使用されていることを確認してください。

5.1Aマウスは、研究者の関心に応じて、インフルエンザウイルスに感染後、いつの時点で安楽死することができます。我々は一般的にインフルエンザウイルスUdorn/307/72（H3N2）に感染後6日目に細菌やウイルスの力価を決定し、任意の死亡率/罹患率を観察していない。しかし、これらの実験で観察された罹患率と死亡率は、S.pneumoniaeによって異なり、使用されると時間のポイントがchosedインフルエンザウイルス株は、動物福祉への影響を最小限に抑えるために考慮死亡率および罹患率率を取る必要があります。表3は、これらの実験で使用するための介入の基準と人道的エンドポイントへの有用なガイドを提供します。一般的に、マウスを安楽死および in vivo生物発光イメージングの後3時間以内に説明したように処理された組織です。

10日齢未満の5.1Bマウスは低酸素に対する耐性があり、斬首によって安楽死させる。記載される実験のセットアップでは、マウスは少なくとも14日以前のものであり、CO ₂窒息により安楽死されることがあります。

5.7血液寒天プレートは、鼻組織のホモジネート中の共生細菌の増殖を防ぐために、5μg/mlゲンタマイシンを補充することができます。使用される希釈の範囲は、S.によって異なります。 肺炎ひずみが使用。 S.、20日齢のマウスでの実験のための肺炎ひずみEF3030は、我々はきちんとした、10E - 1、10E - 2と10E - 3を使用してください。

ウイルスのプラークアッセイで障害が発生した場合にバックアップのサンプルが利用できるように、少なくとも二つのアリコートでホモジナイズした組織の5.8ストア各サンプル、！正確なウイルスの力価は、試料から凍結ではなく、繰り返し凍結融解後に一度解凍したサンプルから得ることができる。

6.1が90〜100％コンフルエントに増殖した場合、単一の150センチメートル²組織培養フラスコは、5、6ウェルプレートに十分なMDCK細胞が得られます。

6.5最適な段階希釈が使用されるウイルス株と感染後の時間に依存します。一般的に、我々は6日、インフルエンザウイルスに感染した後に採取した臓器ホモジネートのためにきちんとした、10E - 1と10E - 2希釈を使用します。

ウイルスストックの連続希釈液の6.6を使用するには、各プラークアッセイで使用するための適切なポジティブコントロールです。ネガティブコントロールとして、RPMI +を使用することができます。

8。代表的な結果：

図1。発育鶏卵の模式図。

図2 S.のBLI 肺炎は、インフルエンザウイルスによるモック感染後3日と4日目にマウスを感染。

図3 S.のBLI 3日目とインフルエンザウイルス感染後4日目に肺炎とインフルエンザウイルスに共感染したマウス。

図4シングルの鼻との共同感染における細菌負荷テッドマウス。

図5。共感染したマウスの鼻と肺におけるウイルス力価。

メディアの	内容
1.8％（w / v）のアガロース	50mLの蒸留H 2 Oにアガロースの0.9グラムを追加し、10分間121℃でオートクレーブで滅菌する。 ° Cの水浴で冷却して56に転送する。
二重強度リーボビッツのL15培地（DS L15）	L15パウダー（1Lを補うために）1学生かばんを450 mLの滅菌蒸留H 2 Oに溶解し、溶解するまで撹拌する。 pHを1M HClでpHを6.8に調整されます。その後、7％（w / v）のNaHCO3水溶液、0.4mL HEPES（0.5M、pH6.8）を、200 U / mlペニシリン、200μg/ mlのストレプトマイシン、60μg/ mlのゲンタマイシンの4mlので補完する。殺菌500mLにとフィルタへの最終的な音量を調整します。
馬血液寒天（HBA）	4パーセントHBA（オキソイド、ベージングストーク、英国）、のdH 2 O、7％（v / v）の馬の血
RF10	2mMグルタミン、2nmのピルビン酸ナトリウム、24μg/ mlのゲンタマイシン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清を含むRPMI - 1640。
RPMI +	2mMグルタミン、2nmのピルビン酸ナトリウム、24μg/ mlのゲンタマイシン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンを含むRPMI - 1640
トッド - ヒューイットブロス+ 0.5％酵母エキス	のdH 2 O中のトッドヒューイット培地は（オキソイド、ベージングストーク、英国）2％（w / v）酵母エキスを補充

表1。このプロトコルで使用する特定のメディア。

材料名	タイプ	会社	カタログ番号	コメント
RPMI培地1640	試薬	ギブコ	21870-076
トリプシン	試薬	ワーシントン生化学株式会社	LS003740	TPCKは扱わ
リーボビッツのL - 15培地	試薬	ギブコ	41300-039
アガロースは、私のように入力します	試薬	シグマアルドリッチ	A6013	このようなSeaPlaqueアガロースなどの低融点アガロースを、使用
Madin - Darbyイヌ腎細胞	試薬	ATCC	CCL - 34

表2に特異的な試薬と装置。。

動物福祉への影響
	兆候は軽度から中等度	重篤な症状のB
非固有の記号（S）：
外観	無脱水（皮膚のテンティング）で立毛を緩和するためにわずかな	脱水による立毛、（皮膚のテンティング）
ボディコンディション	減少体重増加	重量の体重増加しないか減少しない
行動	落ち着いたであるが応答する、ピアとの相互作用が減少した。	活動と挑発に反応しない。他の同腹子から分離さ
特定の条件や異常な臨床徴候（S）：
ミルクのスポットの欠如 （<2〜3日齢）	これは<24で観察されている場合は授乳を奨励してみてください。	24 - 48時間後の励ましでさえミルクのスポットの証拠はない場合、または明らかにsuckledていない場合、安楽死を考慮してください。
他の徴候	動物が中等度または重度の痛みや苦痛にある場合、適切な処置またはeuthanise：動物施設の管理者/実験動物の獣医のアドバイスの再を求める

表3。乳児マウス（<21日齢）のための介入の基準：

一つ以上の"軽度から中等度の"サインは毎日二度に観測の頻度を高め、その治療とケアを与えることができるように、適切な動物福祉の担当者からのアドバイスを求める観測されているとき。

^Bつまたは複数の"深刻な"徴候が観察されている場合、使用してマウスをeuthanise適切な方法。マウス<10日古いが斬首によって安楽死させ、マウス> 10日古いがCO ₂窒息により安楽死させる。

Discussion

IVISのマシンとのin vivoイメージングでは微生物の病原性^4、6-9のリアルタイム可視化を可能にする独自の方法論です。ここで、我々はS.の間に相乗効果を理解するために、この技術の応用を示す乳児マウスにおける肺炎およびインフルエンザウイルス。この手法の非侵襲的な性質のため、我々は時間の経過とともに、個々のマウスにおける感染症の進行を監視することができた。これは、共同収容乳児マウス³の間で肺炎球菌感染の動態を文書化することができるようになりました。この手法の非侵襲的な性質は、実験ごとの少ない動物を使用し、それゆえ動物の使用量を削減するための研究が可能になります。それは、体内の感染症の未知の部位に感染の普及を視覚化するだけでなく、容易に解離（など中耳など）でサンプリングされないサイトにIVISマシンを使用することも可能です。

イメージング実験を始める前に、我々は生物発光EF3030株の植民地化のレベルが組織ホモジネート中の生菌数を列挙することにより、親EF3030ひずみの植民地化のレベルに匹敵することを確認した。さらに、我々は最初のインフルエンザウイルスによる感染がの鼻咽頭に生物発光EF3030の負荷の増大をもたらしたことを確認した親EF3030株（結果は示していない）で示したように動物を植民地化。

IVIS技術は操作が簡単であり、データを理解するために、再現性があり簡単に生成しながら、実験は慎重に技術の感度とユーティリティが最大となるように設計されている必要があります。例えば、IVISのカメラの感度は、私たちの経験では、肺から発生する生物発光シグナルの検出限界を向上させる組織⁸の深さと不透明度に影響されます。さらに、暗い毛皮と色素沈着した皮膚は程度^8（ヘアレスマウスに比べて）10倍などで光透過率を低減します。この方法を開発する一方で、我々は5〜14日齢のC57BL / 6マウスで使用するためにこのプロトコルを最適化して、それ以来、IVISがbioluminescent Sで 20日齢のC57BL / 6マウスの定着を検出するために使用できることを実証している肺炎 EF3030。これらの実験は、ヌードやBALB / cマウスで実行されるときにしかし、信号の検出を増加させることができる。それにもかかわらず、IVISのカメラは、監視の特性と、最終的にインフルエンザウイルス感染後の肺炎球菌疾患のin vivoでの開発で理解するために新しいアプローチを表しています。