Summary
Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel.
Abstract
Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel. Het maakt gebruik van gelelektroforese om native of gedenatureerde proteïnen scheiden door de lengte van de polypeptide (denaturerende omstandigheden) of door de 3-D structuur van het eiwit (native / niet-denaturerende omstandigheden). De eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan (meestal nitrocellulose of PVDF), waar ze worden gepeild (gedetecteerd) met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de doelgroep eiwit.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
De eerste stap in Western blotting is monstervoorbereiding. Ter voorbereiding monsters voor het uitvoeren van een gel cellen en weefsels moeten worden gelyseerd aan de eiwitten van belang release.
- Een handige, kant-en-klare reagens dat is veelzijdig en gemakkelijk te gebruiken voor het oplosbaar eiwit-extractie is CytoBuster of PhosphoSafe. Deze extractie buffers bevatten wasmiddelen geoptimaliseerd voor een efficiënte extractie van oplosbare eiwitten van zoogdieren en insecten cellen. De zachte, niet-ionische samenstelling van CytoBuster eiwitextractie Reagent maakt de isolatie van functioneel actieve endogene of tot expressie gebrachte eiwitten zonder de noodzaak voor secundaire behandeling, zoals sonicatie of vries / dooi. PhoshoSafe heeft het extra voordeel van met vier fosfatase-remmers.
- Pellet de cellen door lage snelheid centrifugeren (bijv. 5 min bij 2500 xg), goed uitlekken van de cel pellet.
- Resuspendeer de cellen in CytoBuster eiwitextractie Reagent met behulp van 150 pi per 10 6 cellen (optimale hoeveelheid CytoBuster eiwitextractie Reagent kunnen variëren op basis van celgrootte).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Transfer naar een geschikte buis en spin voor 5 min bij 16.000 xg bij 4 ° C.
- Transfer gewist supernatans (cel extract) naar een nieuwe buis en ga verder met de analyse.
- Voor gespecialiseerde eiwitextractie, raden wij u onze hoogwaardige ProteoExtract Kits. EMD heeft meer dan een dozijn kits voor mitochondriële isolatie, subcellulaire proteoom extractie, transmembraan eiwit extractie, en vele anderen. Bezoek onze Western blot landing page voor meer informatie.
- EMD verkoopt ook een breed scala van protease en fosfatase-inhibitor cocktail sets. Zodra lysis optreedt, proteolyse, defosforylering en denaturatie beginnen. Deze gebeurtenissen kan worden vertraagd enorm indien uit de monsters worden bewaard op ijs of bij 4 ° C te allen tijde en passende remmers zijn toegevoegd in verse toestand aan de lysis buffer. Bezoek onze Western blot landing page voor meer informatie.
2. SDS-PAGE
De tweede stap in Western blotting is eiwit scheiding. Eiwitten worden gescheiden op basis van moleculaire gewicht.
- U kunt uw eigen PAGE gel te maken, maar we zullen met behulp van een commercieel pre-cast gel.
- Na de voorbereiding van uw sample, bent u klaar om de proteïne concentratie te bepalen. EMD heeft twee kits om dit te laten concentratie te meten, namelijk de niet-storende Protein Assay Kit en de andere is de BCA Protein Assay Kit.
- Zodra de eiwitconcentratie wordt beoordeeld zijn we klaar om onze steekproef voor te bereiden op het laden van de gel. Antilichamen meestal te herkennen een klein deel van het eiwit van belang (hierna het epitoop) en dit domein kan wonen in de 3D-conformatie van het eiwit. Om ervoor te zorgen toegang van het antilichaam aan dit deel is het noodzakelijk om ontvouwen van het eiwit.
- Te denatureren, gebruik dan een laadbuffer met de anionische detergent denatureren natriumdodecylsulfaat (SDS), en kook het mengsel bij 95 tot 100 ° C gedurende 5 minuten. Een gemakkelijke en handige laden buffer te gebruiken is 4X Sample Buffer.
- Plaats de eerste rijstrook van de goed met Trail Mix Protein Marker. Deze marker heeft drie referentie-banden die u toelaten om elektroforese controleren. Wanneer de gel is gekleurd, 10 banden zijn zichtbaar, variërend 10 tot 225 kDa.
- Vul de elektroforese-eenheid met stromend buffer. Voor PAGINA gels, dit is meestal 1X Tris-glycine. Voor gedetailleerde buffer recepten, bezoek de Western blotting pagina. EMD biedt hoogwaardige buffers reagentia met onze OmniPur chemische lijn. Laat de gel op 220V gedurende 1 uur.
- Nadat de eiwitten hebben gescheiden, vlekken op de gel met Coomassie blauw om ervoor te zorgen de eiwitten zijn gelijkmatig en uniform gemigreerd. RAPIDstain is een ultra-gevoelige vlek, die is kant-en-gebruik. Geen ontkleuren is vereist.
3. Eiwit Transfer
Net als eiwitten met een elektrische lading kan worden opgewekt om te reizen door middel van een gel in een elektrisch veld, kan zo de eiwitten worden overgedragen in een elektrisch veld van de gel op een membraan, die ofwel PVDF of nitrocellulose.
- Vandaag zullen we doen een natte transfer. In natte overdracht, zijn de gel en membraan ingeklemd tussen spons en papier (spons / papier / gel / membraan / papier / spons) en allemaal zijn ze stevig tegen elkaar geklemd na zodat er geen luchtbellen gevormd tussen de gel en membraan. De sandwich is ondergedompeld in de overdracht buffer waarbij een elektrisch veld wordt toegepast. De negatief geladen eiwitten reizen naar de positief geladen elektrode, maar het membraan houdt hen tegen, bindt hen, en verhindert hen verder op.
- Er zijn twee soorten membranen zijn beschikbaar: nitrocellulose en PVDF. Beiden werken goed. Vandaag zullen we gebruiken PVDF. PVDF-membranen vereisen weken in methanol voor een paar minuten, gevolgd door een ijskoud overdracht buffer gedurende 5 minuten. De gel moet ook equilibreren voor een paar minuten in ijskoud overdracht buffer. Niet doet, kan krimpen de gel tijdens de overdracht.
- De buffer voor natte overdracht is 1X Tris-glycine met 20% methanol. Gedetailleerde buffer voorbereidingen zijn beschikbaar op onze website.
- Zodra de overdracht is voltooid, is het een goed idee om eiwitten te visualiseren om nog ervoor te zorgen dat geen lucht zakken te dragen. Dit kan gemakkelijk gedaan worden met RedAlert Western Blot Stain. Deze vlek is klaar voor gebruik en ontkleuring kan eenvoudig worden gedaan met water.
4. Antilichamen en accessoires reagentia
- De eerste stap in het doen sonderen en antilichaam aan antigeen te blokkeren het membraan. Het blokkeren van de membraan voorkomt dat niet-specifieke binding achtergrond.
- Ofwel niet-vette melk of BSA kan worden gebruikt als een blokkerende oplossing. Echter, bij het gebruik van fosfo-specifieke antilichamen, is het niet aangeraden om melk te gebruiken omdat het hoge achtergrond veroorzaken.
- Merck biedt verschillende hoogwaardige het blokkeren van reagentia, waaronder SeaBlock, dat is een niet-zoogdieren blokkerende middel en BLOT QuickBlocker, die bereid is, kant-en-klare blokkerend middel. We hebben ook een hoge-kwaliteit BSA (Fraction V) beschikbaar.
- Incubeer het membraan 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Was driemaal in TBST of PBST na incubatie. Een eenvoudige en handige manier om TBST of PBST te maken is om onze tabletten te gebruiken (PBS TWEEN Tablets / TBS TWEEN tabletten)
- Zodra het membraan is geblokkeerd, bent u klaar om incuberen met het primaire antilichaam. EMD is het aanbieden van een uitgebreid portfolio van uitzonderlijke antilichamen met de beste antilichaam garantie in de industrie voor meer dan 30 jaar. Vergeet niet dat bij alle EMD antilichamen, hebben we een volle 100% no-risk garantie te bieden. Aankoop van een antilichaam en het gebruiken voor een soort specificiteit of toepassing die u wenst. Als het antilichaam niet werkt naar tevredenheid, zullen wij een volledige credit te worden gebruikt op een ander product. Voor meer informatie, bezoek onze Western blotting webpagina.
- Vandaag zullen we het incuberen van onze primaire antilichaam met behulp van een oplossing van SignalBoost. SignalBoost is een geweldig product waarmee je signaal aanzienlijk worden verbeterd. Gewoon incubeer je primaire antilichaam in Oplossing 1 en incubeer gedurende 1 uur of als je normaal zou doen. Er is geen behoefte om verder blokkerende middelen toe te voegen. Als alternatief kunt u gebruik maken BSA of magere melkpoeder als een blokkerend middel.
- Wassen met TBST. Wij maken TBST het gebruik van de ready-to-ontbinden TBST tablet.
- Incubeer uw secundaire antilichaam met behulp van oplossing 2 van SignalBoost. Incubeer het secundaire antilichaam in het blokkeren van buffer gedurende 1 uur. Opnieuw Was het membraan meerdere malen met TBST.
5. Opsporing
Voor de HRP vervoegen secundaire antilichamen, wordt ECL traditioneel gebruikt. Een uitstekende ECL reagens die wij aanbieden is RapidStep. De voordelen van RapidStep zijn dat er geen vermenging van luminal of enhancer is vereist. Gewoon spuiten het membraan een paar keer en ontwikkelen met behulp van x-ray film. RapidStep biedt een lage pictogram gevoeligheid en uitzenden van licht, tot twee uur na de toevoeging van substraat.
Discussion
In deze video presentatie hebben we gewezen op de belangrijke stappen in Western blotting die monstervoorbereiding, SDS-PAGE, membraan blokkeren / sonderen met antilichamen, en detectie. Voor elke stap van het proces, moet een goede protocollen en geschikte reagentia worden gebruikt om de resultaten van hoge kwaliteit te bereiken.
Disclosures
De auteurs Anna Eslami en Jesse Lujan zijn in dienst van Merck Chemicals Inc dat de reagentia en instrumenten die gebruikt worden in dit artikel oplevert.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. 'W. estern blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).
- O'Malley, D. ervia Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
