Summary
Western blotting är en analysteknik som används för att påvisa specifika proteiner i ett visst prov av vävnad homogenatet eller utdraget.
Abstract
Western blotting är en analysteknik som används för att påvisa specifika proteiner i ett visst prov av vävnad homogenatet eller utdraget. Den använder gelelektrofores att separera infödda eller denatureras proteiner genom längden på polypeptid (denaturering villkor) eller av 3-dimensionella strukturen av proteinet (okomprimerat / icke-denaturering villkor). Proteinerna har sedan överförts till ett membran (typiskt nitrocellulosa eller PVDF), där de sonderade (detekteras) med hjälp av antikroppar specifika för målprotein.
Protocol
1. Provberedning
Det första steget i Western blotting är provberedning. För att förbereda prover för att köra en gel celler och vävnader måste lyseras att frigöra proteiner av intresse.
- En praktisk, färdiga att använda reagens som är mångsidig och enkel att använda för lösligt protein extraktion är CytoBuster eller PhosphoSafe. Dessa utvinning buffertar innehåller rengöringsmedel optimerad för effektivare utvinning av lösliga proteiner från däggdjur och insekter celler. Den milda, icke-joniska sammansättning CytoBuster Protein Extraction Reagent möjliggör isolering av funktionellt aktiva endogen eller uttryckta proteinerna utan behov av sekundär behandling såsom ultraljudsbehandling eller frysa / tina upp. PhoshoSafe har den extra fördelen med fyra fosfatas hämmare.
- Pellets cellerna genom låg hastighet centrifugering (t.ex. 5 min på 2500 xg), dränera cellpelleten väl.
- Resuspendera cellerna i CytoBuster Protein Extraction Reagent med 150 mikroliter per 10 6 celler (optimal mängd CytoBuster Protein Extraction Reagent kan variera beroende på cellstorlek).
- Inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Överför till lämplig slang och snurrar i 5 min vid 16.000 xg vid 4 ° C.
- Överför rensas supernatanten (cell extrakt) till ett nytt rör och fortsätta med analys.
- För specialiserad protein utvinning, rekommenderar vi att du använder våra högkvalitativa ProteoExtract Kit. EMD har mer än ett dussin kit för mitokondriell isolering, subcellulära Proteome utvinning, transmembrana protein utvinning, och många andra. Besök gärna vår västerländska sida blot landning för mer information.
- EMD säljer även ett brett utbud av proteas och fosfatas hämmare sätter cocktail. Så snart lys inträffar proteolys, defosforylationen och denaturering börja. Dessa händelser kan bromsas oerhört om prover förvaras på is eller vid 4 ° C vid alla tidpunkter och lämpliga hämmare läggs färsk till lyseringsbuffert. Besök gärna vår västerländska sida blot landning för mer information.
2. SDS-PAGE
Det andra steget i Western blotting är protein separation. Proteiner är separerade baseras på molekylvikt.
- Du kan göra din egen sida gel, men vi kommer att använda ett kommersiellt prefabricerade gel.
- Efter att förbereda ditt prov, är du redo att fastställa proteinets koncentration. EMD har två satser för att mäta koncentration, varav ett är den icke-Störande Protein Assay Kit och den andra är BCA Protein Assay Kit.
- När proteinkoncentrationen bedöms vi är redo för att förbereda vårt urval för lastning gelen. Antikropparna känner igen oftast en liten del av proteinet av intresse (kallad epitop) och denna domän får vistas inom 3D-konformation av proteinet. För att möjliggöra åtkomst av antikroppen till denna del är det nödvändigt att fälla proteinet.
- Att denaturera, använd en buffert med anjoniska denaturering tvättmedel natriumdodecylsulfat (SDS), och koka blandningen vid 95-100 ° C i 5 minuter. En enkel och bekväm buffert att använda är 4X Sample buffert.
- Lägg den första körfältet för bra med Trail Mix Protein Marker. Denna markör har tre referens band som gör att du kan övervaka elektrofores. När gelen är färgade, 10 band syns allt från 10 till 225 kDa.
- Fyll i elektroforesenhetens med rinnande buffert. För PAGE geler, är detta vanligtvis 1X Tris-glycin. För detaljerad buffert recept finns på Western blotting sida. EMD erbjuder högkvalitativa buffertar reagenser med våra OmniPur kemiska linje. Kör gelen vid 220V i 1 timme.
- När proteiner har separerat, färga gelen med Coomassie blått för att säkerställa att proteiner har migrerat jämnt och enhetligt. RAPIDstain är en ultra-känsliga fläck som är färdiga att använda. Ingen avfärgning krävs.
3. Protein Transfer
Precis som proteiner med en elektrisk laddning kan förmås att resa genom en gel i ett elektriskt fält, så kan proteinerna överförs i ett elektriskt fält från gelen på ett membran, som antingen PVDF eller nitrocellulosa.
- Idag kommer vi att göra en våt överföring. I våta överföring, är gel och membranet inklämt mellan svamp och papper (svamp / papper / gel / membran / papper / svamp) och alla är fästa tätt tillsammans efter att se några luftbubblor har bildats mellan gel och membran. Smörgåsen är nedsänkt i överföring buffert som ett elektriskt fält tillämpas. Den negativt laddade proteiner resa mot den positivt laddade elektroden, men membranet stoppar dem, binder dem och hindrar dem från att fortsätta på.
- Två typer av membran finns: nitrocellulosa och PVDF. Båda fungerar bra. Idag är vi kommer att använda PVDF. PVDF membran behöver blötläggning i metanol för ett par minuter, följt av iskall överföra buffert i 5 minuter. Gelen måste också balansera ett par minuter i iskallt överföra buffert. Inte gör det kan krympa gelen under överföringen.
- Den buffert för våta överföringen är 1X Tris-glycin med 20% metanol. Detaljerade buffert preparat finns på vår hemsida.
- När överföringen är klar, är det en bra idé att visualisera proteiner för att även flytta utan luftfickor. Detta kan enkelt göras med RedAlert Western Blot Stain. Denna fläck är redo att använda och avfärgning kan göras enkelt med vatten.
4. Antikroppar och reagenser tillbehör
- Det första steget i att göra sondering och antikropp till antigen är att blockera membranet. Blockering av membranet hindrar icke-specifik bakgrund bindande.
- Antingen fettfri mjölk eller BSA kan användas som en blockerande lösningen. Men när man använder fosfor-specifika antikroppar, är det inte rekommenderat att använda mjölk som det kommer att orsaka hög bakgrund.
- EMD erbjuder flera högklassiga blockering reagenser, inklusive SeaBlock, som är en icke-däggdjur blockerande medel och blot QuickBlocker, som är beredd, färdig att använda blockerande medel. Vi har också hög kvalitet BSA (Fraktion V) tillgängliga.
- Inkubera membranet 1 timme i rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Tvätta tre gånger i TBST eller PBST efter inkubation. Ett enkelt och bekvämt sätt att göra TBST eller PBST är att använda vår tabletter (PBS Tween tabletter / TBS Tween tabletter)
- När membranet har blockerats, är du redo att inkubera med den primära antikroppen. EMD har erbjudit en omfattande portfölj av exceptionell antikroppar med de bästa antikroppen garantin i branschen i över 30 år. Kom ihåg att med alla EMD antikroppar, vi erbjuder ett komplett 100% ingen risk garanti. Köp en antikropp och använda det för något artspecificitet eller program du önskar. Om antikroppar inte fungerar till din belåtenhet, kommer vi att ge en fullständig kredit att användas på någon annan produkt. För mer information, besök vår Western blotting webbsida.
- Idag kommer vi att inkubationstiden vår primära antikroppen med lösning 1 av SignalBoost. SignalBoost är en bra produkt så att din signal att förbättras avsevärt. Bara inkubera din primära antikroppen i Lösning 1 och inkubera i 1 timme eller som vanligt. Det finns ingen anledning att lägga till ytterligare blockerande medel. Alternativt kan du använda BSA eller nonfat torka mjölk som en blockerande medel.
- Tvätta med TBST. Vi gör TBST använda färdiga upplösa TBST tablett.
- Inkubera din sekundär antikropp med lösning 2 av SignalBoost. Inkubera sekundär antikropp med blockerande buffert i 1 timme. Tvätta membranet igen flera gånger med TBST.
5. Detection
För HRP konjugera sekundära antikroppar är ECL traditionellt används. En utmärkt ECL reagens vi erbjuder är RapidStep. Fördelarna med RapidStep är att ingen blandning av luminala eller förstärkare krävs. Spraya membranet några gånger och utveckla med hjälp av x-ray film. RapidStep erbjuder låga piktogram känslighet såväl som avger ljus i upp till 2 timmar efter tillsats av substrat.
Discussion
I denna videopresentation, har vi lyft fram viktiga stegen i Western blotting som provberedning, SDS-PAGE, membran blockerar / sondering med antikroppar, och detektion. För varje steg i processen måste korrekta protokoll och lämpliga reagens användas för att uppnå resultat av hög kvalitet.
Disclosures
Författarna Anna Eslami och Jesse Lujan är anställda av EMD Chemicals Inc som tillverkar reagens och instrument som används i denna artikel.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. 'W. estern blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).
- O'Malley, D. ervia Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
