Summary
모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다.
Abstract
모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다. 그것은 polypeptide의 길이 (denaturing 조건) 또는 단백질의 3 차원 구조 (기본 / 비 denaturing 조건)에 의해 기본 또는 변성 단백질을 분리하는 겔 전기 영동을 사용합니다. 단백질은 다음 대상 단백질에 특정한 항체를 사용하여 그들이 탐지하는 막 (일반적으로 nitrocellulose 또는 PVDF), (감지)으로 전송됩니다.
Protocol
1. 샘플 준비
서양은 모래 바닥의 첫 번째 단계는 샘플 준비합니다. 젤 세포와 조직을 실행하기위한 샘플을 준비하기 위해서는 관심의 단백질을 공개 lysed해야합니다.
- 다목적 및 가용성 단백질 추출에 사용하기 쉬운 편리 즉시 사용 시약은 CytoBuster 또는 PhosphoSafe입니다. 이러한 추출 버퍼는 포유 동물 및 곤충 세포에서 가용성 단백질의 효율적인 추출에 최적화된 세제를 포함하고 있습니다. CytoBuster 단백질 추출 시약의 부드러운 아닌 이온 성분은 sonication이나 동결 / 해동 보조 치료를 위해 필요없이 기능 활성화 내생이나 표현 단백질의 분리 수 있습니다. PhoshoSafe 네 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는의 추가 혜택을했다.
- 저속 원심 분리 (2,500 XG의 예 5 분)에 의해 펠렛 세포가 잘 세포 펠렛을 물기.
- 10 6 셀 당 150 μL (셀 크기에 따라 달라질 수 있습니다 CytoBuster 단백질 추출 시약의 최적의 금액)을 사용하여 CytoBuster 단백질 추출 시약으로 세포를 Resuspend.
- 5 분 실온에서 알을 품다.
- 적합한 튜브로 전송하고 4 16,000 XG에서 5 분 스핀 ° C.
- 전송 새로운 튜브로 (세포 추출물) 뜨는 취소 및 분석 진행합니다.
- 전문 단백질 추출을 위해, 우리는 고품질 ProteoExtract 키트를 사용하는 것이 좋습니다. EMD는 mitochondrial 고립, subcellular 프로테옴 추출, transmembrane 단백질의 추출, 그리고 많은 다른 이상 한 다스 키트가 있습니다. 자세한 내용은 우리가 서양 얼룩의 방문 페이지를 방문하십시오.
- EMD는 또한 프로 테아제와 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일 세트의 다양한 판매하고 있습니다. 즉시 용해가 발생로서, proteolysis, dephosphorylation 및 변성이 시작됩니다. 샘플 얼음이나 4에 보관하는 경우 이러한 이벤트는 엄청난 속도가 느려졌 수 있습니다 ° 항상 적절한 억제제에 C가 용해 버퍼에 새로운 추가됩니다. 자세한 내용은 우리가 서양 얼룩의 방문 페이지를 방문하십시오.
2. SDS - PAGE
모래 바닥 서양 두 번째 단계는 단백질 분리됩니다. 단백질은 분자량에 따라 구분됩니다.
- 당신은 자신의 페이지 젤을 할 수 있지만 우리는 상업적으로 사전 캐스트 젤을 사용하는 것입니다.
- 샘플 준비 후 단백질 농도를 결정하기 위해 준비가되어 있습니다. EMD는 농도를 측정하는이 두 키트를 가지고, 그 중 하나가 아닌 방해하는 단백질 분석 키트 및 BCA 단백질 분석 키트되고있는 다른되지.
- 단백질 농도가 평가되면 우리는 젤 로딩을위한 샘플을 준비하는 준비가되어 있습니다. 항체는 일반적으로 관심의 단백질의 작은 부분을 (에피토프라고도 함)임을 인식하고이 도메인은 단백질의 3 차원 형태 내에 있습니다. 그것은 단백질을 펼쳐 필요가이 부분에 대한 항체의 액세스를 설정하려면 다음과 같이하십시오.
- 변성하려면, 음이온 denaturing 세제 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)로 로딩 버퍼를 사용하고 5 분 95-100 ° C에서 혼합물을 끓여. 사용하기 쉽고 편리하게 로딩 버퍼 4X 샘플 버퍼입니다.
- 트레일 믹스 단백질 마커와 잘의 첫 번째 차선을로드합니다. 이 표식은 전기를 모니터링하도록 세 참조 밴드가 있습니다. 겔이 묻은 경우, 10 밴드가 10-225 KDA까지 볼 수 있습니다.
- 버퍼를 실행과 함께 전기 영동 장치를 입력합니다. 페이지 젤 들어,이 트리스 - 글리신 보통 1X입니다. 자세한 버퍼 조리법은 서양 모래 바닥 페이지를 방문하십시오. EMD는 우리 OmniPur 화학 라인 고품질의 버퍼의 시약을 제공합니다. 1 시간 220V에서 젤을 실행합니다.
- 단백질이 분리되면, 단백질이 골고루하고 균일하게 마이 그 레이션이 보장 쿠매시과 청색의 젤 얼룩. RAPIDstain가 - 사용 준비가되어있는 극도로 민감한 얼룩이다. 아무 destaining은 필요하지 않습니다.
3. 단백질 전송
전기 요금과 단백질은 전기 분야에서 젤을 통해 여행을 유도 할 수있는 것처럼, 그래서 단백질은 PVDF 또는 nitrocellulose 중 하나되고, 멤브레인로 젤에서 전기 분야에 전송할 수 있습니다.
- 오늘 우리는 젖은 전송을 할 것입니다. 서부 유럽 표준시 전송에서 젤 및 멤브레인는 스펀지와 종이 (스폰지 / 종이 / 젤 / 멤브레인 / 종이 / 스펀지)와 모든 기포가가 젤과 막 사이에 형성이 없습니다 확인한 후 함께 단단히 고정되어 아르 사이에 끼워 넣으면됩니다. 샌드위치는 전기장이 적용입니다 전송 버퍼에 빠져들 수 있습니다. 부정적 - 충전 단백질은 긍정적 - 충전 전극을 향해 여행을하지만, 멤브레인 그들을 중지, 그들을 바인딩, 및 계속에서 그들을 방지합니다.
- 세포막의 두 종류가 있습니다 : nitrocellulose 및 PVDF. 둘 다 잘 작동. 오늘 우리는 PVDF를 사용하는 것입니다. PVDF의 점막은 methano에 몸을 담글 필요5 분 얼음 차가운 전송 버퍼로 다음 몇 분 동안 리터. 젤은 또한 얼음 차가운 전송 버퍼에서 몇 분 동안 평형을해야합니다. 이렇게하지 않으면 전송 중에 젤 축소 있습니다.
- 서부 유럽 표준시 전송을위한 버퍼 20 % 메탄올로 1X 트리스 - 글리신입니다. 상세 버퍼 준비는 저희 웹사이트에서 사용할 수 있습니다.
- 전송이 완료되면, 아무 공기 주머니로 전송도 보장하기 위해 단백질을 시각화하는 것이 좋습니다. 이것은 쉽게 RedAlert 서양 얼룩 얼룩도 함께 수행할 수 있습니다. 이 얼룩은 - 사용 준비하고 destaining는 물로 쉽게 수행할 수 있습니다.
4. 항체 및 액세서리 시약
- 항원을 탐색하고 항체를하고의 첫 번째 단계는 멤브레인을 차단하는 것입니다. 멤브레인를 차단하면 불특정 배경 바인딩을 방지할 수 있습니다.
- 비 - 지방 우유 또는 BSA 중 하나는 차단 솔루션으로 사용할 수 있습니다. 그러나, phospho 특정 항체를 사용하는 경우, 그것은 그것이 높은 배경의 원인이되므로 우유를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- EMD이 아닌 포유 동물 차단 에이전트 및 준비 얼룩 QuickBlocker입니다 SeaBlock 포함한 여러 고품질 차단 시약,,, 즉시 사용 에이전트를 차단.을 제공합니다 우리는 또한 고품질 BSA (분수 V)를 사용할 수 있습니다.
- 부드러운 교반에 따라 상온에서 막 1 시간 품어.
- 부화 후 TBST 또는 PBST로 세 번 씻으십시오. TBST 또는 PBST를 만들기 위해 쉽고 편리한 방법은 (PBS 트윈의 위패 / TBS 트윈 제나) 우리의 타블렛을 사용하는 것입니다
- 멤브레인가 차단되면, 당신은 기본 항체와 부화 준비가되어 있습니다. EMD는 30 년 이상 업계 최고의 항체 보증과 탁월한 항체의 포괄적인 포트폴리오를 제공하고 있습니다. 모든 EMD 항체와 함께, 우리는 전체 백퍼센트 노 위험 보장을 제공하는 기억하십시오. 항체를 구입하고 원하는 어떤 종류의 특이성 또는 응용 프로그램을 위해 사용합니다. 항체가 만족을 위해 노력하지 않으면, 우리는 다른 제품에 사용되는 전체 크레딧을 제공합니다. 자세한 내용은 Google 서양 모래 바닥 웹 페이지를 방문하시기 바랍니다.
- 오늘 우리는 SignalBoost의 해결 방법 1을 사용하는 우리의 기본 항체를 잠복기 것입니다. SignalBoost는 신호가 크게 향상 될 수 있도록 좋은 제품입니다. 단순히 솔루션 1 기본 항체를 품어 1 시간 동안이나 평소처럼 품어. 자세한 차단 에이전트를 추가할 필요가 없습니다. 또는 BSA 또는 차단 요원으로 무지방 건조 우유를 사용할 수 있습니다.
- TBST로 씻으십시오. 우리는 사용 준비를 해산하기 위해 TBST 태블릿을 TBST합니다.
- SignalBoost의 솔루션 2를 사용하여 보조 항체를 품어. 1 시간 버퍼를 차단에서 보조 항체를 품어. TBST로 다시 여러 번 멤브레인 씻으십시오.
5. 검색
HRP 항체 결합 보조 들어, ECL은 전통적으로 사용됩니다. 우리가 제공하는 뛰어난 ECL 시약은 RapidStep입니다. RapidStep의 장점은 luminal 또는 확장기에 대한 혼합이 필요하지는 것입니다. 단순히 막 몇 번 스프레이하고 X - 선 필름을 사용하여 개발할 수 있습니다. RapidStep는 기판의 추가 후 낮은 그림 문 감도뿐만 아니라 최대 2 시간 동안 발광 빛을 제공합니다.
Discussion
이 비디오 프레 젠 테이션에서 우리는 SDS - PAGE, 항체와 프로빙 / 차단 막하고, 감지, 샘플 준비 아르 서양은 모래 바닥의 주요 단계를 강조합니다. 프로세스의 각 단계에 대해 적절한 프로토콜과 적절한 시약은 고품질 결과를 달성하는 데 사용해야합니다.
Disclosures
저자 안나 Eslami 제시 루얀이 문서에 사용되는 시약 및 악기를 생산 EMD 화학 병원에서 근무하고 있습니다.
Materials
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. 'W. estern blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Ambroz, K. Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis. , (2006).
- Quan, Z. Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells. Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).
- O'Malley, D. ervia Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors. Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).
