Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Summary

Библиотека фагового дисплея была использована для определения пептидных последовательностей, предназначенных для костей. Целью было изучение влияния этих пептидов на мезенхимальной дифференциации клеток и определить их влияние на регенерацию кости.

Abstract

Две новые синтетические пептиды, ускорить формирование костей и может быть доставлена ​​по коллагеновой матрицы. Целью настоящего исследования было изучение влияния на кости ремонта в unicortical модель дефекта. Лечение мезенхимальных клеток производится увеличение активности щелочной фосфатазы, показали, образование узелков на клетки, и увеличение экспрессии генов для runx2, osterix, кости sialoprotein и остеокальцина. Коллагеновой губки пропитанной пептид способствует ремонт костных дефектов, в то время как контроль был менее эффективным. Результаты этого исследования показали, что мезенхимальные клетки, обработанные пептида в пробирке дифференцироваться в направлении остеогенеза и, что пептиды доставлен в естественных условиях использования коллагеновой губки способствовать ремонт unicortical дефектов.

Protocol

1. В естественных условиях Biopanning изолировать Фаг, ориентированных длинных костей

Фага ДНК последовательности и пептиды с соответствующей последовательности были синтезированы. Пептиды были синтезированы с гли-гли-гли-сер-лизин линкер (компоновщик необходим для пары флуоресцентных пигментов, которые помогают отслеживать / след пептиды).

1. 10 неделя Balb / с мышь под наркозом, сердце был разоблачен.
2. Кандидат-12 Фаг дисплей пептидной библиотеке комплект (New England Biolabs, Беверли, штат Массачусетс) было использовано для прижизненного biopanning, 10 х 1010 БОЕ, и вводят в сердце.
3. Примерно через 5 минут, мыши был подвергнут эвтаназии. Бедренные кости были разоблачены и рассеченные, концы бедренных костей были отрезаны, и костного мозга была удалена.
4. Внутри и снаружи левой бедренной кости промывали 10 раз PBS, и бедра был добавлен в ER2537 бактерий (упоминаются как не относящиеся-элюировали фага, перейдите к шагу 6).
5. Интрамедуллярного канала правой бедренной кости промывают 2%-сухого обезжиренного молока в шприц с 21-иглы в десять раз, чтобы удалить, не связан фага. Связанный фаг элюируют из интрамедуллярного канала с HCl-глицина буфера рН 2,2, нейтрализовали 1 М Трис, добавлена ​​ER2537 бактерии, и культивировали в течение 4,5 часа для усиления фага (именуемые элюируется).
6. Бактерии были удалены центробежной седиментации в течение 10 мин при 4 ° С, а фага осаждали в течение ночи при 4 ° С путем добавления PEG / NaCl решение. Фага была собрана с помощью центрифугирования и взвешенных и осаждают в два раза при добавлении в 1 / 6 объема PEG / NaCl. Окончательный осадок ресуспендировали в TBS с 0,02% NaN3.
7. Усиливается элюатов с обеих элюируется и не элюируется фага вводили в отдельные мышей и фаг был выделен как указано выше. Только левой бедренной кости был снят с мышь, которая вводилась с не-элюировали фага, и бедра помещается непосредственно в бактерии (см. пункт 4 выше). Элюировали мыши фаг был выделен только из правого бедра и фага выпущен HCl-глицина буфера перед добавлением бактерий (см. пункт 5 выше).
8. Это, в процедуре biopanning естественных условиях повторялся трижды, прежде чем секвенирование ДНК с использованием праймеров-98 (поставляется с комплектом дисплей фага).
9. Объединенные фага амплифицировали в бактериальных культурах, очищают, а затем количественно вводили в четвертом мыши. Последовательность повторяется.
10. Чтобы продемонстрировать пептида специфичность к кости и костный мозг, фаг элюируют из почек и печени было проанализировано, как описано выше. Во всех четырех раундах было незначительное количество фага расположены в этих органах (менее 10%).
11. Пептиды были синтезированы с Gly-Gly-Gly-Ser-Lys последовательности, с учетом и без биотина, который будет использоваться для клеток и тканей окрашивание, а также в естественных условиях работы.

2. Мезенхимальные культуры клеток для Остеогенные Эксперименты дифференциации клеток

1. Клонированных мышей широкого спектра действия костного мозга стромы (D1) клеточной линии изолированы в нашей лаборатории ¹ был использован для лабораторного эксперимента. Клетки культивировали в модифицированной существенных Дульбекко среде, DMEM, низкий уровень глюкозы (Gibco # 11885-084 кошка) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco # 16000-044 кошки), пятьдесят миллиграммов натрия аскорбата на миллилитр (Sigma кошка # A7631 ) и 100 ед / мл пенициллина G и 100 мг / мл стрептомицина (Gibco # 15140-122 кошка).
2. Культуры при температуре 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO _2, водяной рубашкой инкубаторов и суб-культурных, пока клетки приблизительно на 90% вырожденная.
3. Сотовые трипсинизировали, центрифугируют для осаждения, подсчитываются и посеяны в концентрации 5х10 ^{3 клеток} / см ² в культуре ткани лечение Пластик.

3. Пептид Окрашивание для культивируемых клеток и тканей

1. D1 или клеток костного мозга высевали на фибронектином или желатин покрытием камеры также слайды содержащие DMEM и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 часов.
2. Клетки промывали PBS. Клетки / ткани фиксировали 4% параформальдегида в течение 30 минут
3. Превышение альдегид были заблокированы с помощью 0,5 М глицина (рН 7,5) в течение 10 минут.
4. Эндогенные рецепторов авидин и биотин на поверхности клеток была заблокирована добавлением 5% BSA + авидин блокирующий раствор в течение 1 часа, промыть один раз с PBS в течение 5 минут, а затем блокировали 5% BSA + Биотин блокирующий раствор в течение 1 часа.
5. Затем 100 мкМ биотинилированного L7 и R1 пептиды были добавлены к скважинам в течение 30 минут.
6. Клетки трижды промывали PBS в течение 5 минут каждый и разведение 1:1000 Alexa Мука стрептавидином и инкубировали в темноте в течение 30 минут.
7. Клетки промывали и покровных монтируется с vectashield монтажа средств массовой информации и рассматривается в соответствии с флуоресцентного микроскопа.

4. Щелочная Пробирной активность фосфатазы

1. Щелочной фосфатазы сolorimetric анализ был проведен на монослоев использованием щелочной фосфатазы комплект (BioRad) в соответствии с рекомендациями производителя.
2. D1 клетки высевали при плотности 5 х 10 ^{3 клеток} / см ² на 6-луночных культуры и обрабатывают R1 пептид, ALP активности количественно в дни 4, 8, 12, 16 и 20.
3. Для подготовки клеточных лизатов, сотовые слои промывали три раза PBS буфера, а затем соскабливают в PBS следуют с помощью ультразвука и центрифугирования, чтобы удалить продукты распада клеток.
4. Равные объемы лизат (100 мкл) смешивают с 100 мкл свежеприготовленного субстрата колориметрическим пара-нитрофенил фосфат, и инкубировали при 37 ° С в течение 30 минут.
5. Ферментативной реакции останавливали добавлением 100 мкл 0,2 N NaOH решений. ALP активность измеряли при 405 нм с использованием ИФА (Bio-Rad).
6. Концентрация белка в клеточных лизатов измерялась BioRad Kit Анализ белка, А. П. активности был тогда в виде пара-нитрофенол производится в нмоль / мин / мг белка.
7. ALP деятельности рассчитан в соответствии с техническими условиями производителя (Sigma, Inc.)
8. Единицы ALP активности были нормированы на миллиграмм общего содержания белка с BCA анализа (Pierce, Rockford, IL) ячейки лизат.

5. Мезенхимальные дифференциации клеток использованием L7 и R1

1. Subconfluent мезенхимальные (D1) Клетки выращивались приблизительно на 90% слияния и обрабатывают 5 нм L7 и R1 пептида.
2. Клетки собирают на уровне 0,5, 2, 6, 24 и 48 часов, а РНК была подготовлена ​​с использованием комплекта Qiagen RNeasy согласно инструкции производителя.
3. Обратной транскриптазы (RT) реакции отжигали (37 ° C, 10 минут), а затем первого цепи кДНК синтеза (42 ° С, 30 минут) и тепловой инактивации (95 ° С в течение 5 минут). В результате кДНК хранят в замороженном виде (-70 ° С) до анализировали с помощью ПЦР в реальном времени.
4. ПЦР в реальном времени проводили с использованием QuantiTect SYBR Green ПЦР-комплект (Qiagen). Реакции проводили в 25 мкл SYBR Green Mix Master комплект и прямого и обратного праймеров (300 нмоль / л) костной специфических генов, например, для Runx2, Osterix, остеокальцина, Кость sialoprotein и Wnt генов пути, такие как B-катенина, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 и ОПГ и RANKL (см. Таблицу 1).
5. 3 мкл кДНК образца был добавлен в конечной реакционной смеси неразбавленном от реакции РТ. 96-луночных ПЦР в реальном времени формат включены шесть 10-кратные разведения в двух экземплярах, из плазмиды стандартов ДНК. Скважинах пластины были опечатаны с оптическим охватывает клей (BioRad) и центрифугировали при низкой скорости (300 г, 5 минут) для обеспечения полного смешивания.
6. Каждый образец был проанализирован по крайней мере в двух экземплярах с инструментом iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. ПЦР протоколов, используемых участие активации AmpliTaq ДНК-полимеразы Золотой затем 40 циклов денатурации при 94 ° С в течение 30 секунд, соответствующих температуре отжига в течение 30 секунд, и расширения при 72 ° С в течение 30 секунд. Цикл ПЦР пороговое число (КТ) для каждого образца был рассчитан в точке, где флуоресценция превысил порог. Порог был установлен вдоль линейной логарифмической фазе флуоресценции кривые от 10 до 20 стандартных отклонения (SDS), выше среднего флуоресценции фон. Стандартные уравнения кривой были рассчитаны путем регрессионного анализа средних КТ по ​​сравнению с log10 из кДНК по отношению к общему настоящее РНК. Относительная экспрессия генов-мишеней была нормирована на 18S для костной специфических генов и бета-актин был использован для Wnt генов пути.

6. В естественных условиях Подготовка Gelfoam композитный

1. Использование асептических процедур, gelfoam цилиндров (Pharmacia & Upjohn кошка # 09-0353-01), 3 мм в диаметре до 8 мм в длину, были созданы с использованием собственной разработки инструмента.
2. Двадцать четыре часа до операции, gelfoam цилиндры замочить загружены либо L7 или R1 пептид (20 мкМ в PBS) или PBS буфера без пептида. Gelfoam цилиндры были переведены в стерильную 12 и блюда культуры и храниться в течение ночи при -4 ° C.
3. Во время операции, композитный gelfoam в культуре блюда были перенесены из холодильника и поставить на лед до хирургического вмешательства.

7. Костных дефектов

1. Все животные процедуры были одобрены уходу и использованию животных комитет системы здравоохранения в Университете Вирджинии, до того, как выполнена. Десять девять месяцев от роду взрослого мужчины сингенных Fischer 344 крыс (350-400 г) под наркозом внутрибрюшинно смесью кетамина (50 г на грамм массы тела) и ксилазина (5 г на грамм массы тела).
2. Двусторонних хирургический подход был сделан на переднемедиальной аспект голени. Крысы в ​​этом возрасте и старше показывают незначительное увеличение площади поперечного сечения, области коры кости, костной массы, плотности костной ткани, и осевой длиной anteromediaл аспект голени. Большие, продолговатые unicortical дефект был создан в котором измерялось 3 мм в ширину и 8 мм в длину использованием пневматических заусенцев (Зал Высокая дрели; Zimmer) в условиях засоления орошения.
3. Костный дефект обрабатывают gelfoam или без пептидов. Все имплантированные леса, размером 3 мм в ширину на 8 мм в длину на 1,5 мм в глубину, были вставлены, осторожно коснувшись. Никаких внешних или внутренних устройств фиксации конечностей были использованы после операции, и животных разрешено передвигаться без ограничений сразу после операции.

8. Гистологии и Морфометрия

Регенерация кости оценивали по валовой морфологии и цифровых изображений, снятых.

1. Крысы были подвергнуты эвтаназии и большеберцовые кости были собраны в 3, 5 и 12 недель, чтобы определить количество новой кости генерируются в ответ на травму.
2. После проверки костного дефекта тщательно, собранных голени были зафиксированы в 10% нейтральный буферный формалин, декальцинированного в RDO быстрого decalcifier в течение 72 часов, затем обрабатываются в плановом порядке и в парафин, а также секционные продольно.
3. Регенерация кости оценивали по валовой и легкой микроскопического исследования.
4. Десять животных были использованы для каждого условия (например, пустые дефект, gelfoam в одиночку, и gelfoam плюс R1 пептид). 8мм unicortical дефект был представлен через ~ 40 срезов ткани, каждая из которых было 8 мкм. Из этих 40 разделов, мы использовали минимум 6 секций, чтобы определить количество новой кости.
5. Все разделы ткань окрашивали гематоксилином / эозином (H & E), который этикетки остеоида матрицы.
6. Все слайды были оценены с помощью микроскопа.

9. Кость Ремонт

Обзор

Кость ремонта явно очень важная область рассмотрения в области регенерации тканей опорно-двигательного аппарата. Пептиды, которые целевой кости может иметь значительные полезности в практике ортопедической хирургии, в частности в использовании протезов, которые могут быть пребывающего в течение многих лет, если не десятилетия. Биомиметических свойства кости факторов тропического может создать технологический шаг вперед в области тканевой инженерии, а также для протезно хирургии костей. Включение кости целенаправленного воздействия на факторы в синтетических или природных полимеров может помочь специфичность клеточного присоединения, тем самым очистку эндогенных клеток в тканях, которые проходят ремонт и восстановление. Еще одна цель была установить, если наши уникальные кости ориентации пептидов, определенные в естественных условиях biopanning библиотеки дисплей фага будет связываться с клетки, выделенные из костей и костного мозга, и обладают потенциалом для модуляции остеогенеза в пробирке и регенерации костной ткани в естественных условиях.

В наших экспериментах мы поставили пептидов в бедренную дефекты в крысах с использованием природных и синтетических полимеров, матриц и регенерации костной рассмотрены гистология, биохимия, генная экспрессия, микро-КТ и биомеханики для того, чтобы выяснить подробности пептид деятельность по регенерации кости. Дальнейшее развитие этого подхода может привести к открытию и разработке биологически активных соединений, предназначенных для костей и потенцируют ремонт с помощью механизмов, которые хорошо характеризуется биологически на клеточном и молекулярном уровнях.

Окрашивание

Пептиды были синтезированы с биотин-этикетки, чтобы определить обязательные и локализации мезенхимальных клеток. Fluorescein-изотиоцианат (FITC) меченных авидин был использован для локализации микроскопически связывание пептидов на клетки, выращенные в пробирке. Пептиды связываются с мезенхимальных клеток в культуре, а также кости и костный мозг мышей ребра срезов ткани в пробирке (рис. 1).

Фон Косса Окрашивание

Мезенхимальные клетки (D1) был клонирован из костного мозга и используется для определения остеогенной влияние пептидов на клетки в пробирке. Клетки обрабатывали пептидов L7 и R1 для определения изменений в морфологии клеток и экспрессии генов. На 4-й день, клетки начали совокупности, и агрегаты пополнился время для формирования узелков, шаблон поведения клеток похож на костных клеток в культуре (рис. 2).

Кроме того пептидных L7 или R1 в клетки расширенной окрашивания культур с фон Косса. Клетки затем обрабатывают различными концентрациями пептида L7 или R1 на срок до 16 дней в культуре. Было установлено, что 5 нМ пептид был наиболее эффективным в пробирке. Активность щелочной фосфатазы в культурах, которые лечились пептида увеличился с от 2 до 3,5 раза. Кратного увеличения зависит от концентрации пептида и время лечения в культуре.

ПЦР в реальном времени

Клетки обрабатывали L7 и R1 пептиды были проанализированы с использованием реального времени PCR для экспрессии гена в течение двух известных костных клеток факторов транскрипции (Osterix и Runx2) и трех белков костного матрикса (костный sialoprotein, остеокальцина и коллагена типа I). Лечение с R1 показал увеличение Osterix и Runx2 экспрессии генов. Коллаген типа 1 экспрессии генов оставались неизменными. Лечение L7 показали увеличение экспрессии гена BSP и остеокальцина, а также выражения типа я коллагена гена. Это показывает, что оба пептида влиять на гены, которые связаны с возникновения и прогрессирования остеогенеза в мезенхимальных клеточных культурах.

Лечение в культурах пробирке клетки с пептидами R1 и L7 выявил анаболический эффект, связанный с использованием формирования костей мезенхимальных клеток. Увеличение отношения остеопротегерин к RANKL свидетельствует об уменьшении набора костной резорбции клетками, которые известны как остеокластов. Лечение клеток с пептидами также приводит к увеличению экспрессии генов, которые связаны с формирования костей и уменьшает факторы, которые препятствуют остеогенеза.

Гистология

Чтобы определить количество костей, мы подвержены ломтиками кости μLtraviolet свет таким образом производя аутофлюоресценция. Это обеспечивает больший контраст между костью и без костных тканей с целью количественного ^2. Разделы были сфотографированы с использованием как светлого поля и УФ-света (рис. 3) Nikon и УФ-света системой Nikon цифровых изображений при том же увеличении (х10 цель). В результате цифровые изображения были проанализированы с Metavue обработки изображений (Molecular Devices). Мы выбрали фиксированный, прямоугольной области интереса (ROI), который содержал 8 мм unicortical дефекта. Место повреждения всегда был представлен в этом окупаемость инвестиций путем ручного размещения окна в правильном положении на каждом изображении. H & E-положительных пиксели были частично автоматизированы с помощью волшебной палочки инструмент задан цвет толерантности. Эта терпимость настройку в результате подчеркнул пикселей с рядом зеленый, что соответствует именно с гистологическим появления костной ткани в H & E-окрашенные срезы. Общее число H & E-положительных пикселей для каждой секции был записан. Пиксель насчитывает от отдельных участков были усреднены для каждого образца и большеберцовой различия внутри стран и между группами лечения были рассчитаны на основе этих средних. Территориях для всех образцы затем сравниваются на основе количества новых кортикальной кости (рис. 4).

Наличие костных в секциях было количественно определить кости ремонта в дефектов получавших пептид gelfoam + по сравнению с gelfoam в одиночку. Дефекты, которые были заполнены gelfoam + R1 пептид показал наибольшее количество корковой ремонт с 10, 7 и 2-кратное увеличение на 3, 5, 12 недель, соответственно. Различия в корковых ремонт кости в gelfoam + пептида по сравнению с gelfoam одни были наиболее заметны на 3 и 5 недель демонстрируя, что пептид способствует регенерации кости корковых (рис. 5).

10. Анаболический эффект Остеогенные пептиды

ОПГ / RANKL отношение больше RANKL / OPG отношение, которое предполагает, что пептиды могут оказывать непосредственное влияние на остеобласты и регулировать резорбцию кости.

Синтетические пептиды могут иметь преимущества по сравнению с более крупных молекул, таких как быстрота приготовления, молекулярной стабильности, долгую жизнь шельфа и потенциально терапевтических применений. Значительный прогресс был достигнут в попытках модулировать потерю костной массы и регенерации, контролируя цитокинов и факторов роста. Эти остеотропных пептиды могут предлагать привлекательные альтернативы существующей терапии, которые стимулируют анаболизм костей и костной регенерации.

Рисунок 1. Пептида связывания с мозга и костей мышей ребра срез ткани в пробирке.

Рисунок 2. Мезенхимальных клеток (D1) образуют узелки после пептид лечения.

Рисунок 3. Гистология костной отремонтировать, используя остеогенной пептиды, L7 и R1.

Разделах Рисунок 4. Кость окрашивали H & E в УФ-свете, который вызывает аутофлюоресценция. Это обеспечивает больший контраст между костью и без костных тканей для количественного определения целей.

Рисунок 5. Количественное кости в разделах гистологии показали наибольшее количество корковой ремонт был на 5 недель10-кратное изменение, 7 и 2-кратный на 3 и 5 недель демонстрируя, что пептид способствует регенерации корковой кости.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S