Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l'expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l'ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

Summary

Une bibliothèque d'affichage de phages a été utilisé pour identifier les séquences peptidiques qui os cible. L'objectif était d'étudier l'effet de ces peptides sur la différenciation des cellules mésenchymateuses et de déterminer leur effet sur la régénération osseuse.

Abstract

Deux nouveaux peptides synthétiques d'accélérer la formation osseuse et peut être livré en utilisant une matrice de collagène. L'objectif de cette étude était d'étudier les effets sur la réparation osseuse dans un modèle de défauts unicortical. Le traitement des cellules mésenchymateuses produit une augmentation de l'activité phosphatase alcaline, a montré la formation de nodules par les cellules, et augmenté l'expression de gènes codant pour RUNX2, osterix, sialoprotéine osseuse et l'ostéocalcine. Une éponge de collagène imbibée de réparation promu peptide de défauts osseux, tandis que le contrôle a été moins efficace. Les résultats de cette étude ont démontré que les cellules mésenchymateuses traités avec le peptide in vitro de différenciation vers l'ostéogenèse, et que les peptides livré in vivo en utilisant une éponge de collagène favoriser la réparation des défauts unicortical.

Protocol

1. In vivo biopanning pour isoler les phages qui Bones cible à long

Phage l'ADN a été séquencé et peptides avec une séquence correspondant ont été synthétisés. Les peptides ont été synthétisés avec Gly-Gly-Gly-Ser-lysine linker (le lieur est nécessaire pour chromophores fluorescents quelques qui aident à suivre / trace les peptides).

1. A 10 semaines vieilles souris Balb / c était anesthésié, le cœur a été exposé.
2. Le Docteur-12 phages peptides bibliothèque kit (New England Biolabs, Beverly, MA) a été utilisé pour in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu, et injecté dans le cœur.
3. Après environ 5 minutes, la souris a été euthanasiée. Les fémurs ont été exposés et disséqués, les extrémités des fémurs ont été coupées, et la moelle osseuse a été enlevée.
4. L'intérieur et l'extérieur du fémur gauche ont été rincées 10 fois avec du PBS, et le fémur a été ajouté à ER2537 bactéries (appelés non élués phage, passez à l'étape 6).
5. Le canal médullaire du fémur droit a été rincé avec 2% de lait écrémé séché dans une seringue avec une aiguille de calibre 21 dix fois pour éliminer les non-liés phage. Phage lié a été élue par le canal médullaire avec HCl-tampon glycine pH 2,2, neutralisé avec du Tris 1M, ajouté à ER2537 bactéries, et cultivées pendant 4,5 heures pour amplifier le phage (dénommé élue).
6. Les bactéries ont été éliminées par sédimentation centrifuge pendant 10 min à 4 ° C, et le phage a été précipitée nuit à 4 ° C par addition de PEG / NaCl. Les phages ont été collectées par centrifugation et suspendues et précipité à deux reprises par plus de 1 / 6 du volume de PEG / NaCl. Le culot final est remis en suspension dans TBS avec NaN3 0,02%.
7. Les éluats amplifié à partir de deux phages élues et non-éluées ont été injectées dans des souris séparée, et le phage a été isolé comme ci-dessus. Seul le fémur gauche a été retiré de la souris qui a été injecté avec le phage non élues, et le fémur placé directement dans la bactérie (voir l'étape 4 ci-dessus). La souris phage élue a été isolée qu'à partir du fémur droit et les phages libérés par HCl-glycine tampon avant d'ajouter à la bactérie (voir étape 5 ci-dessus).
8. Cette procédure de biopanning in vivo a été répété trois fois avant le séquençage de l'ADN en utilisant l'amorce-98 (fourni avec le kit phage display).
9. Phage Pooled ont été amplifiés dans des cultures bactériennes, purifié, quantifié et ont ensuite été injectées dans une souris quatrième. Le séquençage a été répété.
10. Pour démontrer la spécificité peptidique à l'os et la moelle, le phage élue à partir de reins et du foie ont été analysées comme décrit ci-dessus. Dans tous les quatre tours il y avait quantité minime de phages situés dans ces organes (moins de 10%).
11. Les peptides ont été synthétisés avec une séquence Gly-Gly-Gly-Ser-Lys, avec et sans biotine à être utilisé pour la coloration des tissus cellulaires et, ainsi que pour les travaux en vivo.

2. Culture de cellules mésenchymateuses d'expériences différenciation des cellules ostéogéniques

1. Une lignée cellulaire de souris clonées pluripotentes de la moelle osseuse du stroma (D1) isolées dans notre laboratoire ¹ a été utilisé pour des expériences in vitro. Les cellules ont été cultivées en milieu essentiel de Dulbecco modifié, DMEM, faible taux de glucose (Gibco # 11885-084 cat) complété avec 10% sérum de veau fœtal (Gibco # cat 16000-044), cinquante milligrammes d'ascorbate de sodium par millilitre (chat Sigma # A7631 ), et 100 U / ml de pénicilline G et 100 mg / mL de streptomycine (Gibco # 15140-122 chat).
2. Les cultures ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée d'incubateurs 5% de CO ₂ d'eau à double enveloppe et sous-culture jusqu'à cellules ont été d'environ 90% de confluence.
3. Cellules ont été trypsinisées, centrifugées pour granulés, comptés et ensemencées à une concentration de 5x10 ³ cellules / cm ² en culture de tissus traités en matière plastique.

3. Coloration peptide des cellules en culture et de tissus

1. D1 ou cellules de la moelle ont été étalées sur la chambre de fibronectine ou de la gélatine à revêtement ainsi diapositives contenant du DMEM et 10% de sérum fœtal bovin pendant 24 heures.
2. Les cellules ont été lavées avec du PBS. Les cellules / tissus ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes
3. Aldéhyde en excès ont été bloqués en utilisant 0,5 M glycine (pH 7,5) pendant 10 minutes.
4. Récepteurs endogènes avidine et la biotine à la surface cellulaire a été bloquée par l'addition d'une solution de BSA 5% + avidine bloquant pendant 1 heure, rincées une fois avec du PBS pendant 5 minutes, puis bloquée avec une solution de BSA 5% + Biotine blocage pendant 1 heure.
5. Puis 100 uM biotinylé L7 et peptides R1 ont été ajoutés au puits pendant 30 minutes.
6. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS pendant 5 min chacun et 1:1000 dilution de farine Alexa streptavidine a été ajouté et incubé dans l'obscurité pendant 30 minutes.
7. Les cellules ont été lavées et lamelles montées avec les médias Vectashield montage et examiné sous un microscope à fluorescence.

4. Alkaline Phosphatase test d'activité

1. Phosphatase alcaline ctest a été effectué sur olorimetric monocouches en utilisant un kit de phosphatase alcaline (BioRad) tel que recommandé par le fabricant.
2. Cellules D1 ont été étalées à une densité de 5 x 10 ³ cellules / cm ² sur des plaques de culture 6 puits et traités avec R1 peptide, l'activité a été quantifiée au ALP jours 4, 8, 12, 16 et 20.
3. Pour préparer les lysats cellulaires, des couches de cellules ont été lavées trois fois avec du tampon PBS puis grattées dans du PBS suivie par sonication et centrifugation pour éliminer les débris cellulaires.
4. Des volumes égaux de lysat (100 ul) a ensuite été mélangée avec 100 ul de substrat fraîchement préparés colorimétrique para-nitrophényl phosphate, et incubées à 37 ° C pendant 30 minutes.
5. La réaction enzymatique a été arrêtée par addition de 100 ul de 0,2 N NaOH solutions. Activité de l'ALP a été mesurée à 405 nm en utilisant lecteur ELISA (Bio-Rad).
6. La concentration en protéines des lysats cellulaires a été mesurée avec un kit BioRad Protein Assay, et l'activité AP a ensuite été exprimée para-nitrophénol produit en nmol / min / mg de protéine.
7. Activité de l'ALP a été calculée selon les spécifications du fabricant (Sigma, Inc.)
8. Unités d'activité ALP ont été normalisées à des mg de teneur totale en protéines avec dosage BCA (Pierce, Rockford, IL) du lysat cellulaire.

5. Différenciation des cellules mésenchymateuses en utilisant L7 et R1

1. Subconfluentes mésenchymateuses (D1), les cellules ont été cultivées à environ 90% de confluence et traités avec 5 nM L7 et le peptide R1.
2. Les cellules ont été récoltées à 0,5, 2, 6, 24 et 48 h, et l'ARN a été préparé en utilisant le kit Qiagen RNeasy en utilisant les instructions du fabricant.
3. Transcriptase inverse (RT) ont été les réactions recuit (37 ° C, 10 minutes) et suivie par la première mèche synthèse de l'ADNc (42 ° C, 30 minutes) et l'inactivation de la chaleur (95 ° C pendant 5 minutes). L'ADNc obtenu a été conservés congelés (-70 ° C) jusqu'à l'analyse par PCR en temps réel.
4. Real Time PCR a été réalisée en utilisant les QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen). Les réactions ont été effectuées avec 25 uL du mélange SYBR Green master kit et en avant et amorces inverses (300 nmol / L) de l'os des gènes spécifiques, par exemple pour Runx2, Osterix, l'ostéocalcine, sialoprotéine os, et les gènes de la voie Wnt tels que b-caténine, LRP6, 5a Wnt, 7b, 10b, DKK1 et OPG et de RANKL (voir tableau 1).
5. Le uL d'échantillon d'ADNc 3 a été ajouté au mélange réactionnel final non dilué de la réaction de RT. Les 96 puits en temps réel le format PCR comprenait six à 10 dilutions en double exemplaire des normes d'ADN plasmidique. Le puits de la plaque ont été scellés avec des couvertures colle optique (BioRad) et centrifugés à faible vitesse (300 g, 5 minutes) pour assurer un mélange complet.
6. Chaque échantillon a été analysé au moins en double avec l'instrument iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. Les protocoles de PCR utilisées activation de la polymérase AmpliTaq impliqués ADN d'or suivie de 40 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 30 secondes, respectivement température de recuit pendant 30 secondes, et l'extension à 72 ° C pendant 30 secondes. Le nombre de PCR cycle seuil (CT) pour chaque échantillon a été calculée au point où la fluorescence a dépassé le seuil limite. Le seuil limite a été fixée le long de la phase linéaire logarithmique des courbes de fluorescence de 10 à 20 déviations standard (DS) au-dessus du fond de fluorescence moyenne. Équations de la courbe standard ont été calculés par analyse de régression de la moyenne par rapport au CT log10 de l'ADNc relatifs à la présente ARN total. Expression relative de gènes cibles a été normalisée à 18S pour les os des gènes spécifiques et de b-actine a été utilisée pour le gène de la voie Wnt.

6. En préparation in vivo de Gelfoam Composite

1. En utilisant des routines d'asepsie, cylindres Gelfoam (Pharmacia & Upjohn chat # 09-0353-01), 3 mm de diamètre de 8 mm de longueur, ont été créés en utilisant l'auto-conception de l'outil.
2. Vingt-quatre heures avant l'intervention, les cylindres ont été Gelfoam s'imprégner-chargés avec soit L7 ou R1 peptide (20 uM dans du PBS) ou du tampon PBS sans peptide. Les cylindres ont été transférés à Gelfoam stérile 12 boîtes de culture bien et stockée pendant la nuit à -4 ° C.
3. Au moment de la chirurgie, le composite Gelfoam en boîtes de culture ont été déplacés hors du réfrigérateur et de mettre sur la glace jusqu'à l'opération.

7. Défauts osseux

1. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation du système de santé à l'Université de Virginie, avant d'être exécuté. Dix neuf mois pour adultes syngéniques rats mâles Fischer 344 (350-400 g) ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec un mélange de kétamine (50 g par gramme de poids corporel) et de xylazine (5 g par gramme de poids corporel).
2. Une approche bilatérale chirurgicale a été faite à l'antéro-tibia. Rats à cet âge ou plus âgés montrent une augmentation insignifiante en coupe transversale, la zone corticale, la masse osseuse, la densité osseuse, et la longueur axiale de l'anteromediaaspect de l de tibia. Un grand défaut de forme oblongue unicortical a été créé, qui mesurait 3 mm de large par 8 mm de long à l'aide d'une fraise pneumatique (Drill Hall High Speed; Zimmer) sous irrigation saline.
3. Le défaut osseux a été traité avec Gelfoam avec ou sans peptides. Tous les échafaudages implantés, mesurant 3 mm de largeur par 8 mm de longueur par 1,5 mm de profondeur, ont été insérés en tapotant légèrement. Aucun dispositif de fixation externe ou interne des membres ont été utilisés après l'opération, et les animaux autorisés à déambuler sans restriction immédiatement après la chirurgie.

8. Histologie et morphométrie

La régénération osseuse a été évaluée par la morphologie générale et des images numériques prises.

1. Les rats ont été euthanasiés et les tibias ont été recueillies à 3, 5 et 12 semaines pour quantifier la quantité d'os nouveau généré en réponse à une blessure.
2. Après vérification du défaut osseux attentivement, le tibia récoltés ont été fixés dans 10% du formol tamponné neutre, décalcifiés dans RDO rapide détartrant pendant 72 heures, puis traitées régulièrement et inclus en paraffine et coupé longitudinalement.
3. La régénération osseuse a été évaluée par un examen microscopique brute et la lumière.
4. Dix animaux ont été utilisés pour chaque condition (c'est à dire, défaut vide, Gelfoam seul, et en plus Gelfoam R1 peptide). Le défaut de 8mm unicortical était représentée dans ~ 40 coupes de tissus, dont chacun a été de 8 um d'épaisseur. Sur ces 40 sections, nous avons utilisé un minimum de 6 sections de quantifier la quantité d'os nouveau.
5. Toutes les sections de tissus ont été colorées à l'hématoxyline / éosine (H & E), dont les étiquettes de matrice ostéoïde.
6. Toutes les lames ont été évalués par microscopie.

9. Réparation osseuse

Aperçu

Réparation osseuse est clairement un domaine très important de la contrepartie dans le domaine de la régénération des tissus musculo-squelettiques. Les peptides que l'os cible pourrait avoir une utilité importante dans la pratique de la chirurgie orthopédique, en particulier dans l'utilisation de prothèses qui peuvent être à demeure pendant des années sinon des décennies. Les propriétés biomimétiques de facteurs Tropic osseuse pourrait créer une étape en avant technologique dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, ainsi que pour la chirurgie prothétique de l'os. L'inclusion de l'os ciblant les facteurs de polymères synthétiques ou naturels peuvent aider la spécificité de l'adhérence des cellules, ce balayage des cellules endogènes dans les tissus qui sont en cours de réparation et de régénération. Un autre objectif était d'établir si notre os unique ciblant les peptides identifiés par in vivo biopanning d'une bibliothèque de phage display serait se lier aux cellules isolées à partir d'os et de moelle osseuse, et ont le potentiel de moduler l'ostéogenèse in vitro et in vivo la régénération osseuse.

Dans nos expériences, nous avons livré les peptides en défauts fémorale chez des rats en utilisant des matrices polymères naturels et synthétiques et la régénération osseuse examinée par l'histologie, la biochimie, l'expression des gènes, les micro-CT et biomécanique afin d'élucider les détails de l'activité de peptides sur la régénération osseuse. Poursuite du développement de cette approche peut conduire à la découverte et le développement de composés biologiquement actifs os cible et potentialiser la réparation par le biais des mécanismes qui sont bien caractérisés biologiquement aux niveaux cellulaire et moléculaire.

Coloration

Les peptides ont été synthétisés avec de la biotine-étiquettes afin de déterminer la liaison et la localisation des cellules mésenchymateuses. Fluorescéine isothiocyanate (FITC) avidine marquée a été utilisé pour localiser au microscope la liaison de peptides sur des cellules cultivées in vitro. Les peptides se lient à des cellules mésenchymateuses en culture ainsi que de l'os et la moelle dans les sections de souris thoracique tissus in vitro (figure 1).

Coloration de Von Kossa

Une des cellules mésenchymateuses (D1) a été cloné à partir de la moelle osseuse et utilisé pour déterminer l'effet ostéogénique de peptides sur des cellules in vitro. Les cellules ont été traitées par les peptides L7 et R1 pour déterminer les changements dans la morphologie cellulaire et l'expression des gènes. Au jour 4, les cellules ont commencé à regrouper, et les agrégats élargie avec le temps de former des nodules, un modèle de comportement des cellules semblables aux cellules osseuses en culture (figure 2).

L'ajout de peptide L7 ou R1 pour la coloration des cellules améliorée des cultures avec von Kossa. Les cellules ont ensuite été traitées avec différentes concentrations de peptide L7 ou R1 pour un maximum de 16 jours de culture. On a déterminé que 5 nM de peptide a été la plus efficace in vitro. L'activité phosphatase alcaline dans les cultures qui ont été traités avec le peptide est passée de 2 à 3,5 fois. L'augmentation d'un facteur dépend de la concentration de peptide et le temps de traitement dans la culture.

PCR en temps réel

Les cellules traitées avec L7 et les peptides ont été analysés en utilisant R1 Temps Réel PCR pour l'expression des gènes de deux facteurs de transcription cellulaire osseux connus (Osterix et Runx2) et trois protéines de la matrice osseuse (sialoprotéine, l'ostéocalcine et de collagène de type I). Le traitement avec R1 ont montré des augmentations de Osterix et l'expression des gènes Runx2. Collagène de type 1 l'expression des gènes est restée inchangée. Le traitement avec L7 montré une augmentation de l'expression des gènes BSP et l'ostéocalcine ainsi que l'expression du type du gène du collagène I. Cela démontre que les deux peptides ont un effet sur les gènes qui sont liés à l'apparition et la progression de l'ostéogenèse dans les cultures de cellules mésenchymateuses.

Le traitement des cultures cellulaires in vitro avec les peptides R1 et L7 a révélé un effet anabolisant liés à la formation osseuse en utilisant des cellules mésenchymateuses. Une augmentation du ratio de l'ostéoprotégérine à RANKL indique une diminution dans le recrutement des cellules résorption osseuse qui sont connus comme les ostéoclastes. Le traitement des cellules avec les peptides conduit également à une augmentation de l'expression des gènes qui sont associés à la formation osseuse et diminue les facteurs qui inhibent l'ostéogenèse.

Histologie

Pour déterminer la quantité d'os, nous avons exposé les tranches d'os à la lumière, produisant ainsi μLtraviolet autofluorescence. Cela apporte plus de contraste entre l'os et les tissus non osseux à des fins de quantification ^2. Les sections ont été photographiées à l'aide tant sur ​​le terrain lumineux et la lumière UV (figure 3) un Nikon et la lumière UV par un système d'imagerie numérique Nikon au même grossissement (x10 objectif). Les images numériques résultants ont été analysés avec le logiciel d'imagerie Metavue (Molecular Devices). Nous avons choisi un fixe, région rectangulaire d'intérêt (ROI) qui contenait le défaut de 8 mm unicortical. Le site de la lésion était toujours représenté dans ce retour sur investissement en plaçant manuellement la boîte en position correcte sur chaque image. Les pixels H & E-positifs ont été partiellement automatisée en utilisant l'outil baguette magique réglée à une tolérance de couleur. Ce paramètre de tolérance conduit à pixels mis en évidence avec une gamme de verts qui correspondait précisément à l'aspect histologique du tissu osseux dans le H & E des sections colorées. Le nombre total de H & E-positif pixels pour chaque section a été enregistré. Les chiffres de pixels de différentes sections ont été en moyenne pour chaque échantillon tibial et les différences au sein et entre les groupes de traitement ont été calculés sur la base de ces moyennes. Les domaines pour tous les échantillons ont ensuite été comparés en fonction de la quantité d'os cortical nouvelles (figure 4).

La présence d'os dans les sections a été quantifié pour déterminer la réparation osseuse dans les défauts traités avec Gelfoam + peptide par rapport à Gelfoam seul. Les défauts qui ont été remplis de Gelfoam peptide + R1 a montré la plus grande quantité de réparation corticale avec un 10, 7 et 2 fois augmenter à 3, 5, 12 semaines respectivement. Les différences dans la réparation de l'os cortical dans le Gelfoam + peptide par rapport à Gelfoam seules étaient les plus perceptibles à 3 et 5 semaines démontrant que le peptide favorise la régénération des os cortical (figure 5).

10. Effet anabolisant de peptides ostéogénique

Le ratio OPG / RANKL est supérieur au ratio RANKL / OPG, ce qui suggère que les peptides peuvent avoir un effet direct sur les ostéoblastes et de réguler la résorption osseuse.

Les peptides synthétiques peuvent avoir des avantages sur de plus grandes molécules telles que la vitesse de préparation, de la stabilité moléculaire, longue durée de conservation et les applications potentiellement thérapeutiques. Des progrès significatifs ont été réalisés dans les tentatives de moduler la perte osseuse et la régénération par des cytokines et des facteurs contrôlant la croissance. Ces peptides peuvent ostéotropiques offrir des alternatives intéressantes aux thérapies existantes qui stimulent l'anabolisme osseux et la régénération osseuse.

Figure 1. Liaison peptidique à la moelle et les os dans la section des tissus de souris rib in vitro.

Figure 2. Les cellules mésenchymateuses (D1) après un traitement sous forme de nodules peptide.

Figure 3. Histologie de la réparation osseuse en utilisant des peptides ostéogénique, L7 et R1.

Sections d'os figure 4. Colorés avec H & E sous lumière UV qui provoque l'autofluorescence. Cela apporte plus de contraste entre l'os et non d'os tissus à des fins de quantification.

Figure 5. Quantification d'os dans les coupes histologiques ont montré la plus grande quantité de réparation corticale était à 5 semaines avecun changement de 10 fois, 7 et 2 fois à 3 et 5 semaines démontrant que le peptide favorise la régénération des os cortical.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S