Peptiden van faag display bibliotheek Modulate genexpressie in mesenchymale cellen en versterken Osteogenesis in Unicortical Bone Gebreken

Summary

Een faag display bibliotheek werd gebruikt om de peptide-sequenties die zich richten op het bot te identificeren. Het doel was om het effect van deze peptiden op mesenchymale cel differentiatie te onderzoeken en om het effect op het bot regeneratie te bepalen.

Abstract

Twee nieuwe synthetische peptiden te versnellen botvorming en kan worden geleverd met behulp van een collageen matrix. Het doel van deze studie was om de effecten op het bot te repareren te onderzoeken in een unicortical defect model. Behandeling van mesenchymale cellen produceerde een stijging van de alkalische fosfatase-activiteit, toonde de vorming van knobbeltjes door de cellen, en verhoogde de expressie van genen voor runx2, osterix, bot sialoprotein, en osteocalcine. Een collageen sponsje nat met peptide bevorderde het herstel van botdefecten, terwijl de controlegroep was minder effectief. De resultaten van deze studie toonde aan dat mesenchymale cellen behandeld met peptide in vitro differentiëren naar osteogenesis, en dat de peptiden geleverd in vivo met behulp van een collageenspons de reparatie van unicortical gebreken te bevorderen.

Protocol

1. In vivo Biopanning om faag isolaat dat Target lange beenderen

Faag DNA werd gesequenced en peptiden met een overeenkomstige sequentie werden gesynthetiseerd. Peptiden werden gesynthetiseerd met Gly-Gly-Gly-Ser-lysine linker (de linker is nodig om paar tl-chromoforen die helpen om track / de peptiden trace).

1. Een 10 weken oude Balb / c muizen onder narcose was, werd het hart blootgesteld.
2. De Ph.D-12 Faagdisplay peptidenbibliotheek kit (New England Biolabs, Beverly, MA) werd gebruikt voor in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu, en geïnjecteerd in het hart.
3. Na ongeveer 5 minuten werd de muis laten inslapen. De bovenbenen werden blootgesteld en ontleed, de uiteinden van de bovenbenen werden afgesneden, en het beenmerg werd verwijderd.
4. De binnen-en buitenkant van het linker dijbeen werd 10 keer gespoeld met PBS, en het dijbeen werd toegevoegd aan ER2537 bacteriën (aangeduid als niet-geëlueerd faag, ga dan naar stap 6).
5. Het intramedullaire kanaal van de rechter dijbeen was gespoeld met 2%-gedroogde afgeroomde melk in een spuit met een 21-gauge naald tien keer om niet-gebonden faag te verwijderen. Gebonden faag werd geëlueerd van het intramedullaire kanaal met HCl-glycine buffer pH 2,2, geneutraliseerd met 1M Tris, toegevoegd aan ER2537 bacteriën en gekweekt gedurende 4,5 uur aan de faag (aangeduid als geëlueerd) te versterken.
6. Bacteriën werden verwijderd door centrifugale sedimentatie gedurende 10 min bij 4 ° C, en faag 's nachts werd bij 4 ° C neergeslagen door de toevoeging van PEG / NaCl-oplossing. De faag werd verzameld door centrifugatie en geschorst en twee keer neergeslagen door toevoeging van 1 / 6 volume van de PEG / NaCl. De uiteindelijke pellet werd geresuspendeerd in TBS met 0,02% NaN3.
7. De versterkte eluaten van zowel de geëlueerd en niet-geëlueerd faag werden geïnjecteerd in afzonderlijke muizen, en faag werd geïsoleerd als hierboven. Alleen de linker dijbeen werd verwijderd uit de muis die werd geïnjecteerd met de niet-geëlueerd faag, en het dijbeen geplaatst direct in de bacteriën (zie stap 4). De geëlueerd faag muis werd geïsoleerd alleen van de rechter dijbeen en de faag vrijgegeven door HCl-glycine buffer voor het toevoegen aan de bacteriën (zie stap 5 hierboven).
8. Deze in vivo biopanning procedure werd herhaald drie keer eerder sequentiebepaling van DNA met behulp van 98-primer (geleverd bij de Faagdisplay kit).
9. Samengevoegde faag werden versterkt in de bacteriële culturen, gezuiverd, gekwantificeerd en vervolgens werden geïnjecteerd in een kwart muis. Sequencing werd herhaald.
10. Om aan te tonen peptide specificiteit aan het bot en merg, faag geëlueerd van de nieren en de lever werden geanalyseerd zoals hierboven beschreven. In alle vier ronden was er geringe hoeveelheid faag zich in deze organen (minder dan 10%).
11. Peptiden werden gesynthetiseerd met een Gly-Gly-Gly-Ser-Lys volgorde, met en zonder biotine om te worden gebruikt voor cel-en weefsel vlekken, evenals voor de in vivo werk.

2. Mesenchymale Cel Cultuur voor osteogeen Celdifferentiatie Experimenten

1. Een gekloonde muis pluripotential beenmerg stroma (D1) cellijn geïsoleerd in ons lab ^een werd gebruikt voor in vitro experimenten. De cellen werden gekweekt in gemodificeerde essentieel medium Dulbecco's, DMEM, lage glucose (Gibco cat # 11885-084) aangevuld met 10% foetaal runderserum (Gibco cat # 16.000-044), vijftig milligram natrium ascorbaat per milliliter (Sigma cat # A7631 ), en 100 U / ml penicilline G en 100 mg / ml streptomycine (Gibco cat # 15140 tot 122).
2. Culturen werden gehandhaafd bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer van 5% CO ₂ watermantel broedmachines en sub-gekweekte cellen werden tot ongeveer 90% confluent.
3. Cel werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd om pellet, geteld en uitgezet met een concentratie van 5x10 ³ cellen / cm ² in weefselkweek behandeld plasticware.

3. Peptide Kleuring voor gekweekte cellen en weefsels

1. D1 of beenmerg cellen werden geplateerd op fibronectine-of gelatine-gecoate kamer en dia's met DMEM en 10% foetaal runderserum voor 24 uur.
2. De cellen werden gewassen met PBS. Cellen / weefsel werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten
3. Overtollige aldehyde werden geblokkeerd met 0,5 M Glycine (pH 7,5) gedurende 10 minuten.
4. Endogene avidine en biotine receptoren op het celoppervlak werd geblokkeerd door de toevoeging van 5% BSA + avidine blokkering oplossing voor een uur, een keer gespoeld met PBS gedurende 5 minuten, vervolgens geblokkeerd met 5% BSA + Biotine blokkering oplossing voor een uur.
5. Dan 100 uM gebiotinyleerd L7 en R1 peptiden werden toegevoegd aan de putten voor 30 minuten.
6. Cellen werden drie keer gewassen met PBS gedurende 5 minuten per stuk en 1:1000 verdunning van Alexa Flour Streptavidine werd toegevoegd en geïncubeerd in het donker gedurende 30 minuten.
7. De cellen werden gewassen en dekglaasjes gemonteerd met vectashield montage media en onderzocht onder een fluorescentie microscoop.

4. Alkalische fosfatase activiteit Assay

1. Alkalische fosfatase colorimetric test werd uitgevoerd op monolagen met behulp van een alkalische fosfatase kit (BioRad), zoals aanbevolen door de fabrikant.
2. D1-cellen werden uitgeplaat bij een dichtheid 5 x 10 ³ cellen / cm ² op 6-putjes en behandeld met R1 peptide, was ALP activiteit gekwantificeerd op dag 4, 8, 12, 16 en 20.
3. Ter voorbereiding van de cellysaten, cel-lagen werden drie keer gewassen met PBS-buffer en vervolgens afgeschraapt in PBS gevolgd door sonificatie en centrifugeren voor cellulaire vuil te verwijderen.
4. Gelijke volumes van lysaat (100 ul) werd vervolgens gemengd met 100 pi van de vers bereide colorimetrische ondergrond para-nitrofenylfosfaat, en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
5. De enzymatische reactie werd gestopt door het toevoegen van 100 pi van 0,2 N NaOH-oplossingen. ALP activiteit werd gemeten bij 405 nm met behulp van ELISA-reader (Bio-Rad).
6. Eiwitconcentratie van de cellysaten werd gemeten met een BioRad Protein Assay Kit, en de AP-activiteit werd vervolgens uitgedrukt als para-nitrofenol geproduceerd in nmol / min / mg eiwit.
7. ALP activiteit werd berekend volgens de specificaties van de fabrikant (Sigma, Inc.)
8. Eenheden van ALP activiteit werden genormaliseerd milligrammen van de totale eiwitgehalte met BCA assay (Pierce, Rockford, IL) van de cel lysaat.

5. Mesenchymale Celdifferentiatie met behulp van L7 en R1

1. Subconfluent mesenchymale (D1) cellen werden gegroeid naar ongeveer 90% confluentie en behandeld met 5nM L7 en R1 peptide.
2. Cellen werden geoogst bij 0,5, 2, 6, 24 en 48 uur, en het RNA werd bereid met behulp van de Qiagen RNeasy kit met behulp van instructies van de fabrikant.
3. Reverse transcriptase (RT) reacties waren gegloeid (37 ° C, 10 minuten) en gevolgd door de eerste streng cDNA synthese (42 ° C, 30 minuten) en warmte-inactivatie (95 ° C gedurende 5 minuten). De resulterende cDNA werd opgeslagen, bevroren (-70 ° C) totdat getest door real-time PCR.
4. Real Time PCR werd uitgevoerd met behulp van de QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen). De reacties werden uitgevoerd met 25 pi van de SYBR Green kit master mix en de forward en reverse primers (300 nmol / L) van het bot specifieke genen voor bijvoorbeeld Runx2, Osterix, Osteocalcin, Bone sialoprotein en Wnt-route genen zoals b-catenine, LRP6, Wnt-5a, 7b, 10b, DKK1 en OPG en RANKL (zie tabel 1).
5. De 3 pl van cDNA monster werd toegevoegd aan het uiteindelijke reactiemengsel onverdund uit de RT-reactie. De 96-well real-time PCR-formaat opgenomen zes 10-voudige verdunningen in tweevoud van het plasmide DNA normen. De putjes van de plaat werden afgesloten met optische lijm dekt (BioRad) en gecentrifugeerd op lage snelheid (300 g, 5 minuten) om ervoor te zorgen mixen af ​​te ronden.
6. Elk monster werd geanalyseerd ten minste in duplo met het ICycler instrument (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. De PCR-protocollen die gebruikt worden bij de activering van AmpliTaq Gold DNA polymerase gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, respectievelijk annealing temperatuur gedurende 30 seconden, en extensie bij 72 ° C gedurende 30 seconden. De PCR-drempel cyclus nummer (CT) voor elk monster werd berekend op het punt waar de fluorescentie boven de drempelwaarde. De drempelwaarde werd vastgesteld langs de lineaire logaritmische fase van de fluorescentie bochten 10 tot 20 standaarddeviaties (SDS) boven het gemiddelde achtergrond fluorescentie. Standaardcurve vergelijkingen werden berekend door regressie-analyse van de gemiddelde CT ten opzichte van de log10 van de cDNA ten opzichte van het totaal RNA aanwezig is. Relatieve expressie van de doelwitgenen was genormaliseerd tot 18S voor bot-specifieke genen en b-actine werd gebruikt voor de Wnt-pathway gen.

6. In vivo Voorbereiding van Gelfoam Composite

1. Met behulp van aseptische routines, werden gelfoam cilinders (Pharmacia & Upjohn cat # 09-0353-01), 3 mm in diameter van 8 mm in de lengte, gemaakt met behulp van zelf ontworpen instrument.
2. Vierentwintig uur voor de operatie, de gelfoam cilinders werden weken-geladen met een L7 of R1 peptide (20 uM in PBS) of PBS buffer zonder peptide. De gelfoam cilinders werden overgebracht naar steriele 12 goed cultuur gerechten en 's nachts opgeslagen bij -4 ° C.
3. Op het moment van de operatie werden de gelfoam composiet in cultuur gerechten verhuisde uit de koelkast en zet op ijs tot chirurgie.

7. Botdefecten

1. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik het Comite van de Health System van de Universiteit van Virginia, alvorens te worden uitgevoerd. Tien negen maanden oude volwassen mannelijke syngene Fischer 344 ratten (350-400 g) werden verdoofd intraperitoneaal met een mengsel van ketamine (50 g per gram lichaamsgewicht) en xylazine (5 g per gram lichaamsgewicht).
2. Een bilaterale chirurgische benadering is gemaakt om de ventromediale aspect van het scheenbeen. Ratten op deze leeftijd of ouder vertonen significant toename van de dwarsdoorsnede, corticale bot gebied, botmassa, de botdichtheid en de axiale lengte van de anteromedial aspect van het scheenbeen. Een grote, langwerpige unicortical defect werd gecreëerd die gemeten 3 mm breed en 8 mm lang met behulp van een pneumatische braam (Hall High Speed ​​Boor; Zimmer) onder zoutoplossing irrigatie.
3. Het botdefect werd behandeld met gelfoam met of zonder peptiden. Alle geïmplanteerde steigers, het meten van 3 mm breedte van 8 mm lengte van 1,5 mm diepte, werden ingebracht door zachtjes te tikken. Geen externe of interne fixatie ledematen apparaten werden postoperatief gebruikt, en de dieren mogen wandelen zonder beperkingen direct na de operatie.

8. Histologie en morfometrie

Botregeneratie werd geëvalueerd door grove morfologie en meegenomen digitale beelden.

1. Ratten werden gedood en de dij werden verzameld op 3, 5, en 12 weken om de hoeveelheid nieuw bot gegenereerd in reactie op de blessure te kwantificeren.
2. Na controle van het botdefect zorgvuldig, werden de geoogste tibia gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, ontkalkte in RDO snel ontkalker voor 72 uur, dan routinematig verwerkt en ingebed in paraffine, en coupes lengterichting.
3. Botregeneratie werd geëvalueerd door grove en licht microscopisch onderzoek.
4. Tien dieren werden gebruikt voor elke toestand (dat wil zeggen, lege defect, gelfoam alleen, en gelfoam plus R1 peptide). De 8mm unicortical defect was vertegenwoordigd zijn op alle ~ 40 weefselcoupes, die elk 8 urn dik. Van die 40 secties, gebruikten we een minimum van 6 secties om de hoeveelheid van nieuw bot te kwantificeren.
5. Al het weefsel secties werden gekleurd met hematoxyline / eosine (H & E), die osteoid matrix labels.
6. Alle dia's werden geëvalueerd door microscopie.

9. Bone Repair

Overzicht

Botherstel is duidelijk een zeer belangrijk aandachtsgebied op het gebied van het bewegingsapparaat weefselregeneratie. De peptiden die zich richten op het bot kunnen zeer nuttig zijn in de praktijk van de orthopedische chirurgie, met name in het gebruik van prothesen die kunnen worden inwoning voor de jaren, zo niet decennia. De biomimetische eigenschappen van het bot tropische factoren zou kunnen leiden tot een technologische stap voorwaarts op het gebied van tissue engineering, alsmede voor prothetische chirurgie van het bot. Opname van het bot gericht op factoren in synthetische of natuurlijke polymeren kan helpen specificiteit van celadhesie, waardoor scavenging endogene cellen in weefsels die worden ondergaan herstel en regeneratie. Een bijkomend doel was om vast te stellen of onze unieke bot richtende peptiden geïdentificeerd door in vivo biopanning van een faag display bibliotheek zou binden aan cellen geïsoleerd uit het bot en beenmerg, en het potentieel om moduleren osteogenesis in vitro en in vivo regeneratie van bot hebben.

In onze experimenten hebben we de peptiden geleverd in femorale gebreken in ratten met behulp van natuurlijke en synthetische polymeren matrices en botregeneratie onderzocht door histologie, biochemie, genexpressie, micro-CT en biomechanica, om de details van de peptide-activiteit toe te lichten op het bot regeneratie. Verdere ontwikkeling van deze aanpak kan leiden tot de ontdekking en ontwikkeling van biologisch actieve verbindingen die zich richten op het bot en de werking te herstellen door middel van mechanismen die goed biologisch worden gekarakteriseerd op cellulair en moleculair niveau.

Vlekken

De peptiden werden gesynthetiseerd met biotine-labels om te binden en lokalisatie te bepalen mesenchymale cellen. Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld avidine werd gebruikt om microscopisch lokaliseren van de binding van peptiden op cellen gekweekt in vitro. De peptiden binden aan mesenchymale cellen in cultuur evenals aan het bot en merg in de muis rib weefselcoupes in vitro (figuur 1).

Von Kossa kleuring

Een mesenchymale cel (D1) werd gekloond uit het beenmerg en gebruikt om de osteogene effect van peptiden op cellen in vitro te bepalen. De cellen werden behandeld met peptiden L7 en R1 om veranderingen in cel morfologie en genexpressie te bepalen. Op dag 4, had de cellen begonnen te aggregeren, en de aggregaten uitgebreid met de tijd om knobbeltjes, een cel gedragspatroon lijkt op het bot cellen in cultuur (figuur 2) te vormen.

De toevoeging van peptide L7 of R1 om de cellen verbeterde kleuring van de culturen met von Kossa. Cellen werden vervolgens behandeld met verschillende concentraties van peptide L7 of R1 tot 16 dagen in cultuur. Er werd vastgesteld dat 5 nM peptide was het meest effectief in vitro. Alkalische fosfatase activiteit in de culturen die werden behandeld met peptide nam toe van tussen de 2 en 3,5 maal. De voudige toename hing af van de concentratie van peptide en de tijd van de behandeling in de cultuur.

Real-time PCR

Cellen behandeld met L7 en R1 peptiden werden geanalyseerd met behulp van Real-Time PCR voor de genexpressie van twee bekende bot cel transcriptiefactoren (Osterix en Runx2) en drie botmatrixproteïnen (bot sialoprotein, osteocalcine en collageen type I). Behandeling met R1 toonde een toename in Osterix en Runx2 genexpressie. Collageen type 1 genexpressie bleef ongewijzigd. Behandeling met L7 toonde een toename van de BSP en osteocalcine genexpressie als uitdrukking van het type I collageen gen. Dit toont aan dat zowel de peptiden een effect hebben op de genen die gerelateerd zijn aan het ontstaan ​​en de progressie van osteogenese in de mesenchymale cel culturen.

De behandeling van in vitro celculturen met de peptiden R1 en L7 heeft onthuld een anabole werking met betrekking tot botvorming met behulp van mesenchymale cellen. Een toename in de verhouding van osteoprotegerine om RANKL wijst op een daling van de rekrutering van de botresorberende cellen die bekend staan ​​als osteoclasten. De behandeling van cellen met de peptiden leidt ook tot een toename in de expressie van genen die geassocieerd zijn met de botvorming en vermindert de factoren die osteogenesis remmen.

Histologie

Voor het bepalen van de hoeveelheid bot, hebben we de plakjes van bot blootgesteld aan het licht waardoor de productie van μLtraviolet autofluorescentie. Dit biedt meer contrast tussen bot en niet-botweefsel in het kader van kwantificatie ^2. De secties werden gefotografeerd met behulp van zowel helderveld en UV-licht (figuur 3) een Nikon en UV-licht met een Nikon digitale imaging-systeem op dezelfde vergroting (x10 doelstelling). De resulterende digitale beelden werden geanalyseerd met Metavue imaging software (Molecular Devices). We kozen voor een vaste, rechthoekig gebied van interest (ROI) dat de 8 mm unicortical defect bevatte. De blessure site is altijd vertegenwoordigd binnen deze ROI door handmatig het plaatsen van de box in de juiste positie op elke afbeelding. De H & E-positieve pixels werden deels geautomatiseerd met behulp van de toverstaf ingesteld op een kleur tolerantie. Deze tolerantie instelling resulteerde in gemarkeerd pixels met een bereik van groen die precies overeenkwam met de histologische verschijning van botweefsel in de H & E-gekleurde coupes. Het totaal aantal H & E-positieve pixels voor elke sectie werd geregistreerd. De pixel telt van de individuele secties werden gemiddeld voor elke tibialis monster en de verschillen binnen en tussen behandelingsgroepen werden berekend op basis van deze gemiddelden. De gebieden voor alle monsters werden vervolgens vergeleken op basis van de hoogte van nieuwe corticale bot (figuur 4).

De aanwezigheid van het bot in de secties werd gekwantificeerd aan het bot te repareren bepalen de gebreken die werden behandeld met gelfoam + peptide in vergelijking met alleen gelfoam. Gebreken die waren gevuld met gelfoam + R1 peptide toonde de grootste hoeveelheid van corticale repareren met een 10, 7 en 2-voudige toename van op 3, 5, 12 weken. De verschillen in corticale bot te repareren in de gelfoam + peptide in vergelijking met gelfoam alleen waren het meest merkbaar bij de 3 en 5 weken aan te tonen dat het peptide corticale bot regeneratie (figuur 5) bevordert.

10. Anabole werking van osteogeen peptiden

De OPG / RANKL verhouding groter is dan de RANKL / OPG-ratio, wat suggereert dat de peptiden kan een direct effect op de osteoblasten te hebben en te reguleren botresorptie.

Synthetische peptiden kan zijn voordelen ten opzichte van grotere moleculen, zoals snelheid van voorbereiding, moleculaire stabiliteit, een lange houdbaarheid en potentieel therapeutische toepassingen. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in pogingen te moduleren botverlies en regeneratie door het beheersen van cytokines en groeifactoren. Deze osteotropic peptiden kunnen bieden aantrekkelijke alternatieven voor de bestaande therapieën die bot anabolisme en botregeneratie te stimuleren.

Figuur 1. Peptide binding aan merg en been in de muis rib weefselsectie in vitro.

Figuur 2. Mesenchymale cellen (D1) formulier knobbeltjes na de peptide behandeling.

Figuur 3. Histologie van botherstel gebruik van osteogene peptiden, L7 en R1.

Figuur 4. Bone secties gekleurd met H & E onder UV-licht waardoor autofluorescentie. Dit biedt meer contrast tussen bot en niet-bot-weefsels voor kwantificatie doeleinden.

Figuur 5. Kwantificering van het bot in de histologie secties bleek dat de grootste hoeveelheid van de corticale reparatie werd bij 5 weken meteen 10-voudige verandering, 7 en 2-voudig bij 3 en 5 weken aan te tonen dat het peptide corticale bot regeneratie bevordert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S