Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

Published: December 10, 2010 doi: 10.3791/2362
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1
1Orthopaedics Research, University of Virginia, 2Biological Sciences, University of Delaware, 3Orthopaedic Surgery, University of Virginia

Summary

تم استخدام المكتبة عرض فج لتحديد تسلسل الببتيد أن العظام الهدف. كان الهدف هو دراسة تأثير هذه الببتيدات على تمايز الخلايا الوسيطة وتحديد تأثيرها على تجديد العظام.

Abstract

اثنين من الببتيدات الاصطناعية رواية تسريع تشكيل العظام ، ويمكن تقديمها باستخدام مصفوفة الكولاجين. كان الهدف من هذه الدراسة إلى التحقيق في الآثار المترتبة على إصلاح العظام في نموذج unicortical عيب. تنتج خلايا اللحمة المتوسطة علاج زيادة في النشاط الفوسفاتيز القلوية ، وأظهر تشكيل العقيدات من الخلايا ، وزيادة التعبير عن الجينات runx2 ، osterix ، sialoprotein العظام ، وأوستيوكالسين. اسفنجة مبللة مع الببتيد الكولاجين تعزيز إصلاح عيوب العظام ، في حين أن السيطرة كانت أقل فعالية. النتائج من هذه الدراسة أثبتت أن خلايا اللحمة المتوسطة تعامل مع الببتيد في المختبر تفرق نحو تكون العظم ، والببتيدات التي ألقاها في الجسم الحي باستخدام اسفنجة الكولاجين تعزيز إصلاح العيوب unicortical.

Protocol

1. Biopanning في الجسم الحي لعزل بالعاثية ان العظام هدف طويل

وكان تسلسل الحمض النووي وكانت بالعاثية هضميدات توليفها مع تسلسل المقابلة. وتوليفها مع الببتيدات الغليسين - الغليسين - الغليسين ، سر ، ليسين رابط (مطلوب رابط لزوجين chromophores الفلورسنت التي تساعد على تعقب / تتبع الببتيدات).

  1. وكان 10 من العمر الاسبوع BALB / ج الماوس تم تخديره ، ويتعرضون في القلب.
  2. وقد استخدم الشاشة دكتوراه - 12 بالعاثية الببتيد المكتبة مجموعة (نيو إنجلاند Biolabs ، بيفرلي ، MA) في الجسم الحي للbiopanning ، 10 × 1010 pfu ، وحقنها في القلب.
  3. بعد حوالي 5 دقائق ، وكان الموت الرحيم الماوس. تعرضت femurs وتشريح ، وقطعت نهايات femurs الخروج ، وتمت إزالة نخاع العظام.
  4. وتشطف الداخل والخارج من عظم الفخذ الأيسر 10 مرات مع برنامج تلفزيوني ، وأضيف إلى عظم الفخذ ER2537 البكتيريا (ويشار إلى غير eluted فج ، انتقل إلى الخطوة 6).
  5. وتشطف القناة داخل النقي من عظم الفخذ الأيمن مع 2 ٪ المجفف الحليب الخالي من الدسم في المحاقن مع إبرة عيار 21 عشر مرات لإزالة غير منضم فج. وكان eluted بالعاثية ملزمة من القناة داخل النقي مع حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة عازلة جليكاين - 2.2 ، مع تحييد تريس 1M ، إضافة إلى ER2537 البكتيريا ، والمثقف عن 4.5 ساعة لتضخيم فج (ويشار إلى eluted).
  6. تمت إزالة البكتيريا عن طريق الترسيب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة على عجل 4 درجات مئوية ، وبين عشية وضحاها في بالعاثية 4 درجة مئوية عن طريق إضافة PEG / كلوريد الصوديوم الحل. تم جمع فج بواسطة الطرد المركزي وعلقت وعجل مرتين إضافة 06/01 حجم PEG / كلوريد الصوديوم. وكان بيليه معلق النهائي في TBS مع NaN3 0.02 ٪.
  7. وحقن eluates تضخيمها من كل فج وغير eluted eluted - منفصلة في الفئران ، وكان معزولا فج على النحو الوارد أعلاه. فقط تم إزالة عظم الفخذ الأيسر من الماوس الذي تم حقنه مع فج غير eluted ، وعظم الفخذ وضعها مباشرة في البكتيريا (راجع الخطوة 4 أعلاه). تم عزل الماوس بالعاثية eluted فقط من عظمة الفخذ الأيمن وبالعاثية اصدره حمض الهيدروكلوريك ، قبل ان يضيف جليكاين العازلة للبكتيريا (راجع الخطوة 5 أعلاه).
  8. هذا الإجراء في biopanning فيفو تكررت ثلاث مرات قبل تسلسل الحمض النووي باستخدام التمهيدي - 98 (قدم مع عدة عرض فج).
  9. وتضخمت بالعاثية المجمعة في الثقافات البكتيرية ، وتنقيتها ، quantitated ثم حقنت في ماوس الرابع. وتكررت التسلسل.
  10. لشرح خصوصية الببتيد لنخاع العظم و، بالعاثية eluted من الكلى والكبد وحللت كما هو موضح أعلاه. في جميع الجولات الأربع كان هناك كمية بسيطة من فج وتقع في هذه الأجهزة (أقل من 10 ٪).
  11. وتوليفها مع تسلسل الببتيدات الغليسين - الغليسين - الغليسين - سر - LYS ، والبيوتين ، ودون أن تستخدم لتلوين الخلية والأنسجة ، وكذلك للعمل في الجسم الحي.

2. الثقافة الوسيطة للخلية مولدة للعظم التجارب تمايز الخلايا

  1. تم استخدام الماوس متعدد الكوامن المستنسخة نقي العظم سدى (D1) خط خلية معزولة في مختبرنا 1 للتجارب في المختبر. وكانت الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​من الضروري تعديل Dulbecco ، DMEM والجلوكوز المنخفضة (Gibco القط # 11885-084) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (Gibco القط # 16000-044) والخمسين ملليغرامات من الصوديوم أسكوربات في الملليمتر الواحد (سيغما القط # A7631 ) ، و 100 U / مل البنسلين G والستربتوميسين 100mg / مل (Gibco القط # 15140-122).
  2. وقد حافظت الثقافات في 37 درجة مئوية في جو مرطب حاضنات ثاني 5 ٪ ماء 2 تغلف وشبه مثقف ، وحتى خلايا حوالي 90 ٪ متموجة.
  3. وtrypsinized الخلية ، لطرد بيليه ، عدها ، والمصنف في تركيز خلايا 5x10 3 / سم 2 في زراعة الأنسجة المعالجة بلستيكور.

3. الببتيد تلطيخ للخلايا والأنسجة مثقف

  1. وكانت مطلية D1 أو خلايا النخاع على غرفة فبرونيكتين أو الجيلاتين المغلفة جيدا الشرائح التي تحتوي على 10 ٪ وDMEM مصل بقري جنيني لمدة 24 ساعة.
  2. وجرفت المياه الخلايا مع برنامج تلفزيوني. تم إصلاح الخلايا / الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 30 دقيقة
  3. سدت ألدهيد الزائدة باستخدام 0.5 M جليكاين (الرقم الهيدروجيني 7.5) لمدة 10 دقيقة.
  4. تشطف تم حجب الذاتية أفيدين والبيوتين المستقبلات على سطح الخلية عن طريق إضافة 5 ٪ BSA حل أفيدين + حظر لمدة 1 ساعة ، مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، ثم سدت مع 5 ٪ BSA حل البيوتين + حظر لمدة 1 ساعة.
  5. biotinylated ثم 100 ميكرومتر L7 وأضيفت الببتيدات R1 إلى الآبار لمدة 30 دقيقة.
  6. تم غسلها ثلاث مرات مع الخلايا في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وكان كل وأضاف 1:1000 تخفيف اليكسا طحين Streptavidin والمحتضنة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  7. وجرفت المياه الخلايا وcoverslips شنت وسائل الاعلام مع تصاعد vectashield وفحصها تحت المجهر مضان.

4. الفوسفاتيز القلوية الفحص نشاط

  1. الفوسفاتيز القلوية جوقد أجريت تجربة على olorimetric monolayers باستخدام طقم الفوسفاتيز القلوية (BioRad) على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  2. وكانت مطلية D1 الخلايا في مناطق ذات كثافة 5 × 10 3 خلية / سم 2 على لوحات ثقافة 6 - جيدا ، وتعامل مع الببتيد R1 ، كميا ALP النشاط في أيام 4 و 8 و 12 و 16 و 20.
  3. لإعداد lysates الخلية ، تم غسلها طبقات الخلية ثلاث مرات مع العازلة PBS ثم كشط في برنامج تلفزيوني تليها صوتنة والطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوية.
  4. ثم كانت مختلطة كميات متساوية من lysate (100 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر من الركيزة للاللونية الطازجة شبه nitrophenyl الفوسفات ، وحضنت في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. وكان رد الفعل الأنزيمية توقفت عن طريق إضافة 100 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N الحلول. تم قياس النشاط في ALP 405 نانومتر باستخدام ELISA القارئ (بيو راد).
  6. وقد تم قياس تركيز البروتين في الخلية lysates مع طقم الفحص BioRad البروتين ، وأعرب عن AP ثم النشاط وشبه نيتروفينول المنتجة في nmol / دقيقة / ملغ من البروتين.
  7. وقد حسبت ALP النشاط وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (سيغما ، وشركة).
  8. وكانت وحدات من تطبيع لنشاط حزب العمال الاسترالى ملليغرام من محتوى البروتين الكلي مع مقايسة BCA (بيرس ، روكفورد ، إلينوي) من lysate الخلية.

5. الوسيطة تمايز الخلايا باستخدام L7 و R1

  1. وقد نمت Subconfluent الوسيطة (D1) الخلايا إلى ما يقرب من 90 ٪ confluency وتعامل مع 5nM L7 والببتيد R1.
  2. وكان حصاد الخلايا عند 0.5 و 2 و 6 و 24 و 48 ساعة ، وأعرب عن استعداد الجيش الملكي النيبالي استخدام عدة RNeasy Qiagen به الشركة الصانعة.
  3. وكان عكس المنتسخة صلب (RT) تفاعلات (37 درجة مئوية و 10 دقيقة) ويليه أول حبلا التوليف [كدنا] (42 درجة مئوية و 30 دقيقة) وتعطيل الحرارة (95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). تم تخزين تجميد الناتجة [كدنا] (-70 درجة مئوية) حتى يعاير بواسطة PCR الوقت الحقيقي.
  4. تم تنفيذ PCR الوقت الحقيقي باستخدام SYBR QuantiTect الخضراء PCR مجموعة (Qiagen). أجريت ردود الفعل مع 25 ميكرولتر من مزيج الأخضر SYBR رئيسية عدة والى الامام وعكس الاشعال (300 nmol / L) من جينات معينة ، مثلا Runx2 العظام ، Osterix ، أوستيوكالسين ، sialoprotein العظام ، والجينات مسار wnt مثل B - catenin ، LRP6 ، 5A Wnt ، 7B ، 10B ، وDKK1 OPG وRANKL (انظر الجدول 1).
  5. وأضاف ميكرولتر 3 من عينة [كدنا] إلى خليط التفاعل النهائي مخفف من ردود فعل RT. شملت 96 - PCR كذلك تنسيق حقيقي المحدد بستة أضعاف من 10 في التخفيفات مكررة من المعايير DNA البلازميد. تم اغلاق آبار للوحة مع لاصق يغطي الضوئية (BioRad) وطرد على سرعة منخفضة (300 غرام ، 5 دقائق) لضمان استكمال الاختلاط.
  6. وقد تم تحليل كل عينة على الاقل في مكررة مع صك iCycler (BioRad مختبرات ، هرقل ، كاليفورنيا).
  7. البروتوكولات المستخدمة PCR تفعيل المشاركة من الحمض النووي بوليميريز AmpliTaq الذهب تليها 40 دورة من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ومنها درجة الحرارة الصلب لمدة 30 ثانية ، وعلى امتداد 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم احتساب عدد دورة عتبة PCR (CT) لكل عينة عند نقطة حيث مضان تجاوز حد العتبة. وقد حددت عتبة الحد طول المرحلة وغاريتمي خطية من منحنيات مضان بمعدل 10 إلى 20 الانحرافات المعيارية (SDS) فوق المتوسط ​​مضان الخلفية. تم حساب المعادلات منحنى القياسية من خلال تحليل الانحدار من CT المتوسط ​​مقابل LOG10 من النسبية [كدنا] وحتى الوقت الحالي RNA الإجمالي. وكان تطبيع التعبير النسبية للجينات الهدف 18S لجينات معينة العظام ، وكان يستخدم B - أكتين لجين المسار Wnt.

6. التحضير في الجسم الحي من المركب جلفوم

  1. باستخدام الروتين العقيم ، تم إنشاؤها جلفوم اسطوانات (فارماسيا وأبجون # 09-0353-01 القط) ، و 3 ملم في قطر بنسبة 8 ملم في الطول ، وذلك باستخدام أداة مصممة الذاتي.
  2. أربع وعشرين ساعة قبل الجراحة ، وكانت الاسطوانات جلفوم نقع محملة اما L7 أو R1 الببتيد (20 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني من دون الببتيد العازلة. تم نقل اسطوانات جلفوم لثقافة عقيمة 12 الأطباق جيدا وتخزينها بين عشية وضحاها في -4 درجة مئوية.
  3. في وقت الجراحة ، تم نقل مركب جلفوم في أطباق الثقافة من الثلاجة ووضعها على الجليد حتى الجراحة.

7. عيوب العظام

  1. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية رعاية الحيوان واللجنة استخدام النظام الصحي في جامعة فرجينيا ، قبل أن يتم تنفيذها. وكان عشرة من العمر تسعة أشهر من الذكور البالغين مسانج فيشر 344 الفئران (350-400 ز) intraperitoneally تخدير بمزيج من الكيتامين (50 غ لكل غرام من وزن الجسم) وزيلازين (5 غ لكل غرام من وزن الجسم).
  2. وقدم النهج الثنائي الجراحية إلى جانب أمامي إنسي من الساق. الفئران في هذا العمر أو المسنين تظهر زيادات ضئيلة في منطقة مستعرضة ، القشرية منطقة العظام ، والعظام ، وكثافة العظام ، وطول محوري للanteromediaل جوانب الساق. وأنشئت ، مستطيل كبير عيب unicortical التي تقاس 3 مم واسعة من قبل 8 ملم به منذ فترة طويلة لدغ الهوائية (قاعة حفر سرعة عالية ؛ زيمر) تحت الري المالحة.
  3. كان يعالج الخلل العظام مع جلفوم سواء مع أو بدون الببتيدات. أدرجت جميع السقالات مزروع ، وقياس عرض 3 ملم بطول 8 ملم التي ملم عمق 1.5 ، من خلال استغلال لطيف. واستخدمت أي طرف خارجي أو تثبيت أجهزة الداخلية بعد العمل الجراحي ، والسماح للحيوانات ambulate دون قيود التالية مباشرة لعملية جراحية.

8. قياس الأشكال والأنسجة.

تم تقييم العظام التجدد بواسطة مورفولوجيا الجسيمة والصور الرقمية التي اتخذت.

  1. وكانت الفئران والموت الرحيم جمعت tibias في 3 و 5 و 12 أسبوعا لقياس كمية من العظام الجديدة ولدت استجابة لإصابات.
  2. بعد التحقق من عيب العظم بعناية ، وكانت ثابتة في الساق تحصد 10 ٪ محايدة مخزنة الفورمالين ، مخلص من الكالسيوم في RDO decalcifier السريع لمدة 72 ساعة ، ثم معالجتها بصورة روتينية وجزءا لا يتجزأ من البرافين ، ومقطوع طوليا.
  3. تم تقييم العظام التجدد بواسطة الفحص المجهري الجسيمة والخفيفة.
  4. استخدمت عشر حيوانات لكل حالة (أي عيب فارغة ، وحدها جلفوم وجلفوم زائد الببتيد R1). وقد مثل الخلل 8MM unicortical عبر ~ أقسام النسيج 40 عاما ، الذي كان كل من 8 ميكرون سميكة. من تلك الأبواب 40 ، استخدمنا الحد الأدنى من 6 أقسام لقياس كمية من العظام الجديدة.
  5. تم صبغ جميع المقاطع مع الأنسجة الهيماتوكسيلين / يوزين (H & E) ، التي تصف مصفوفة عظمية.
  6. وجرى تقييم جميع الشرائح التي المجهري.

9. إصلاح العظام

نظرة عامة

إصلاح العظام بشكل واضح في منطقة مهمة جدا للنظر في مجال ترميم الأنسجة العضلية. والببتيدات التي تستهدف العظام يمكن أن يكون أداة هامة في ممارسة جراحة العظام ، وخاصة في مجال استخدام التأهبل التي يمكن سكنى لسنوات اذا لم يكن لعقود. يمكن أن خصائص بيوميمتيك من العوامل مدار العظام خلق نقلة تكنولوجية إلى الأمام في مجال هندسة الأنسجة ، وكذلك لجراحة العظام الاصطناعية. قد إدراج العظام استهداف العوامل في بوليمرات تركيبية أو طبيعية تساعد خصوصية التقيد الخلية ، وبالتالي مسح الخلايا الذاتية داخل أنسجة التي تمر الإصلاح والتجديد. كان الهدف إضافية لتحديد ما اذا عظم الفريد استهداف الببتيدات التي حددها في الجسم الحي من biopanning بالعاثية مكتبة عرض وربط الخلايا المعزولة من العظام ونخاع العظام ، ولها القدرة على أن تكون العظم تعدل في المختبر وتجديدها العظام في الجسم الحي.

في تجاربنا ، نحن الببتيدات تسليمها الى عيوب الفخذ لدى الفئران باستخدام المصفوفات البوليمر الطبيعية والاصطناعية وتجديد العظام التي درستها الأنسجة ، الكيمياء الحيوية ، والتعبير الجيني ، CT - الجزئي والميكانيكا الحيوية من أجل توضيح تفاصيل النشاط الببتيد على تجديد العظام. ويمكن تطوير هذا النهج يؤدي إلى اكتشاف وتطوير المركبات النشطة بيولوجيا العظام التي تستهدف تحفيز وإصلاح من خلال الآليات التي تتسم جيدا من الناحية البيولوجية على المستويين الخلوي والجزيئي.

تلطيخ

وتوليفها مع الببتيدات البيوتين العلامات من أجل تحديد ملزم والتوطين إلى خلايا اللحمة المتوسطة. فلوريسئين - ثيوسيانات (FITC) المسمى تم استخدامه في توطين أفيدين المجهر الربط من الببتيدات على الخلايا المزروعة في المختبر. والببتيدات ربط خلايا اللحمة المتوسطة في الثقافة وكذلك لنخاع العظم والأنسجة في الفروع الماوس ضلع في المختبر (الشكل 1).

فون كوسا يلطخ

تم استنساخ خلية الوسيطة (D1) من نخاع العظم واستخدامها لتحديد تأثير المكونة للعظم من الببتيدات على الخلايا في المختبر. تم علاج الخلايا مع الببتيدات L7 و R1 لتحديد التغييرات في مورفولوجية الخلية والتعبير الجيني. في يوم 4 ، فإن الخلايا التي لتجميع والمجاميع الموسع مع الوقت لتشكيل العقيدات ، وهو نمط السلوك خلية مماثلة لخلايا العظام في الثقافة (الشكل 2).

إضافة الببتيد L7 أو R1 إلى تلطيخ الخلايا تعزيز الثقافات مع كوسا فون. وعولج ثم الخلايا التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الببتيد L7 أو R1 لمدة تصل إلى 16 يوما في الثقافة. تقرر أن الببتيد 5 نانومتر والأكثر فعالية في المختبر. زيادة النشاط الفوسفاتيز القلوية في الثقافات التي تم التعامل معها من الببتيد في الفترة بين 2 و 3.5 أضعاف. يتوقف أضعاف الزيادة في تركيز الببتيد ووقت المعالجة في الثقافة.

في الوقت الحقيقي PCR

وقد تم تحليل الخلايا تعامل مع L7 والببتيدات R1 في الوقت الحقيقي باستخدام PCR للتعبير الجين المعروف لمدة عوامل العظام النسخ الخلية (Osterix وRunx2) وثلاثة بروتينات مصفوفة العظام (العظم sialoprotein ، أوستيوكالسين والكولاجين النوع الأول). وأظهرت المعاملة مع R1 الزيادات في Osterix Runx2 والتعبير الجيني. وظل نوع الكولاجين التعبير الجيني 1 دون تغيير. وأظهرت المعاملة مع L7 زيادة في التعبير الجيني BSP أوستيوكالسين وكذلك التعبير عن النوع الأول من الجينات الكولاجين. هذا يدل على أن كلا من الببتيدات يكون لها تأثير على الجينات التي ترتبط ظهور وتطور الثقافات تكون العظم في الخلية الوسيطة.

كشفت علاج الخلايا في المختبر الثقافات مع R1 الببتيدات وL7 تأثير الابتنائية المتصلة تكوين العظام باستخدام خلايا اللحمة المتوسطة. زيادة في نسبة osteoprotegerin لRANKL تشير إلى حدوث انخفاض في تجنيد خلايا العظام resorbing التي تعرف باسم الخلايا الآكلة. علاج الخلايا مع الببتيدات يؤدي أيضا إلى زيادة في التعبير عن الجينات التي ترتبط مع تشكيل العظام ويقلل من العوامل التي تحول دون تكون العظم.

الأنسجة

لتحديد كمية من العظام ، ونتعرض لشرائح من العظام للضوء وبالتالي إنتاج μLtraviolet تألق ذاتي. هذا يوفر قدرا أكبر من التباين بين العظام والأنسجة غير العظام لغرض الكميات 2. صورت المقاطع باستخدام كل حقل مشرق والأشعة فوق البنفسجية (الشكل 3) ونيكون والأشعة فوق البنفسجية من خلال نظام نيكون التصوير الرقمي في نفس التكبير (X10 الهدف). وقد تم تحليل الصور الرقمية الناتجة مع Metavue برامج التصوير (الأجهزة الجزيئية). اخترنا ثابت ، منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) التي تحتوي على عيب unicortical 8 ملم. ومثلت على الدوام في موقع الإصابة داخل هذا ROI يدويا عن طريق وضع مربع في الموضع الصحيح على كل صورة. وكانت الآلية جزئيا بكسل H & E - الإيجابية باستخدام أداة العصا السحرية تعيين إلى التسامح اللون. هذا الإعداد التسامح أسفرت أبرز بكسل مع مجموعة من الخضراء التي تتوافق تماما مع ظهور النسيجي للنسيج عظمي في أقسام H & E - الملون. تم تسجيل عدد من H & E - إيجابية بكسل لكل مقطع. وبلغ متوسط ​​بحساب بكسل من المقاطع الفردية لكل عينة الظنبوب وحسبت الخلافات داخل وبين مجموعات العلاج بناء على هذه المعدلات. ثم كانت المقارنة بين المناطق لجميع العينات على أساس كمية من العظام القشرية الجديدة (الشكل 4).

وكان وجود كمية من العظام في الفروع لتحديد إصلاح العيوب في العظم تعامل مع الببتيد + جلفوم بالمقارنة إلى جلفوم وحدها. وأظهرت العيوب التي كانت تعج R1 جلفوم الببتيد + اكبر قدر من إصلاح القشرية مع 10 و 7 و زيادة بنسبة 2 مرات في 3 و 5 و 12 أسبوعا على التوالي. الاختلافات في إصلاح العظام القشرية في جلفوم + الببتيد مقارنة مع جلفوم وحدها أكثر ما يلفت الانتباه في 3 و 5 أسابيع مما يدل على أن يعزز الببتيد القشرية تجديد العظام (الشكل 5).

10. الابتنائية تأثير هضميدات المكونة للعظم

نسبة OPG / RANKL هي أكبر من نسبة RANKL / OPG ، مما يوحي بأن الببتيدات قد يكون له أثر مباشر على بانيات وتنظيم ارتشاف العظام.

قد الببتيدات الاصطناعية لها مزايا أكثر من الجزيئات الكبيرة مثل سرعة التحضير والاستقرار الجزيئية ، وحياة طويلة الجرف والتطبيقات العلاجية المحتملة. وقد أحرز تقدما كبيرا في محاولات لتعديل فقدان العظام والتجدد من خلال السيطرة على السيتوكينات وعوامل النمو. قد تكون هذه الببتيدات osteotropic تقدم بدائل مغرية للالعلاجات الحالية التي تحفز ابتناء العظام وتجديد العظام.

الشكل 1
الشكل 1. الببتيد ملزمة لنخاع العظم والفأرة في الضلع قسم الأنسجة في المختبر.

الشكل 2
الشكل 2. خلايا اللحمة المتوسطة (D1) شكل عقيدات الببتيد بعد العلاج.

الشكل 3
الشكل 3. الأنسجة لإصلاح العظام باستخدام الببتيدات المكونة للعظم ، وL7 R1.

الشكل 4
أقسام العظام الشكل 4. ملطخة H & E تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تسبب تألق ذاتي. هذا يوفر قدرا أكبر من التباين بين العظام والأنسجة غير العظام لأغراض الكميات.

الشكل 5
أظهر الرقم 5. الكميات من العظام في أقسام الأنسجة أكبر كمية من إصلاح القشرية كان في 5 أسابيع معتغيير 10 أضعاف ، و 7 و 2 أضعاف في 3 و 5 أسابيع مما يدل على أن يعزز الببتيد القشرية تجديد العظام.

Disclosures

وقد رعت إنتاج هذا الفيديو من قبل نيو انغلاند Biolabs ، المؤتمر الوطني العراقي ، والتي تنتج بعض الكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgments

المعاهد الوطنية للصحة ، AR53579 ، تكون العظم : التقوية مع هضميدات مدار العظام
المعاهد الوطنية للصحة ، AR056422 ، تأثير الابتنائية من الببتيدات المكونة للعظم
المعاهد الوطنية للصحة ، T32 AR050960 ، العظام والعضلات والأنسجة إصلاح التجديد
DOD ، PC051219 Nucleolin : وسيط الرواية من سرطان البروستاتا والعظام نخاع التصاق الخلية البطانية
وزارة الدفاع ، PC061508 ، الإنبثاث سرطان البروستاتا الخلوي نخاع العظام وسطاء التصاق

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12 New England Biolabs E8110S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diduch, D. R., Coe, M. R., Joyner, C., Owen, M. E., Balian, G. Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization. J. Bone Joint Surg. Am. 75, 92-105 (1993).
  2. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A. E., Davies, C. M., Richards, R. G. Viability in ex vivo cultured cancellous. Eur. Cells. Mater. 13, 69-70 (2007).
  3. Lehr, J. E., Pienta, K. J. Preferential adhesion of prostate cancer cells to a human bone marrow endothelial cell line. J. Natl. Cancer Inst. 90, 118-123 (1998).
  4. Schuster, N., Götz, C., Faust, M., Schneider, E., Prowald, A., Jungbluth, A., Montenarh, M. Wild-type p53 inhibits protein kinase CK2 activity. J. Cell Biochem. 81, 172-183 (2001).
  5. Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., Dower, W. J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 6378-6382 (1990).
  6. Doorbar, J., Winter, G. Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display. J. Mol. Biol. 244, 361-369 (1994).
  7. Ellerby, H. M., Arap, W., Ellerby, L. M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G. D., Krajewski, S., Lombardo, C. R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D. E., Pasqualini, R. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat. Med. 5, 1032-1038 (1999).
  8. Goodson, R. J., Doyle, M. V., Kaufman, S. E., Rosenberg, S. High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriophage peptide display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7129-7133 (1994).
  9. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins. J. Cell Biol. 130, 1189-1196 (1995).
  10. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nat. Biotechnol. 15, 542-546 (1997).
  11. Pasqualini, R., Koivunen, E., Kain, R., Lahdenranta, J., Sakamoto, M., Stryhn, A., Ashmun, R. A., Shapiro, L. H., Arap, W., Ruoslahti, E. Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 60, 722-727 (2000).
  12. Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J. Clin. Invest. 102, 430-437 (1998).
  13. Rajotte, D., Ruoslahti, E. Membrane dipeptidase is the receptor for a lung-targeting peptide identified by in vivo phage display. J. Biol. Chem. 274, 11593-11598 (1999).
  14. Wang, B. Isolation of high-affinity peptide antagonists of 14-3-3 proteins by phage display. Biochemistry. 38, 12499-12504 (1999).
  15. Sugahara, K. N., Teesalu, T., Karmali, P. P., Kotamraju, V. R., Agemy, L., Greenwald, D. R., Ruoslahti, E. Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs. Science. 328, 1031-1035 (2010).
  16. Sikes, R. A., Cooper, C. R., Beck, G. L., Pruitt, F., Brown, M. L., Balian, G. Bone Stromal Cells as Therapeutics Targets in Osseous Metastasis. Cancer Growth and Progression. "Integration/Interaction of Oncologic Growth". Meadows, G., Kluwer, K. H. , Academic Publishers. Boston, MA. 369-386 (2005).
  17. Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., Pêgo, A. P., Granja, P. L., Tomás, H., Balian, G. Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides. Molecular Pharmaceutics. , Forthcoming (2010).

Tags

البيولوجيا الخلوية ، العدد 46 ، تكون العظم ، الببتيد ، وإصلاح العظام ، وتأثير الابتنائية
الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balian, G., Beck, G., Madhu, V.,… More

Balian, G., Beck, G., Madhu, V., Sikes, R., Cui, Q., Liang, H., Bush, J. Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects. J. Vis. Exp. (46), e2362, doi:10.3791/2362 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter