Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

Summary

Una biblioteca de fagos se utilizó para identificar las secuencias de péptidos de que el hueso blanco. El objetivo fue investigar el efecto de estos péptidos en la diferenciación de células mesenquimales y para determinar su efecto sobre la regeneración ósea.

Abstract

Dos péptidos sintéticos novedosos acelerar la formación de hueso y se puede entregar con una matriz de colágeno. El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la reparación ósea en un modelo de defecto unicortical. Tratamiento de las células mesenquimales producido un aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina, mostró la formación de nódulos en las células, y el aumento de la expresión de genes de Runx2, osterix, sialoproteína ósea y osteocalcina. Una esponja empapada con la reparación del colágeno péptido promovido de defectos óseos, mientras que el control era menos eficaz. Los resultados de este estudio demostraron que las células mesenquimales tratados con el péptido in vitro se diferencian hacia la osteogénesis y, que los péptidos entrega en vivo con una esponja de colágeno promover la reparación de defectos unicortical.

Protocol

1. En vivo biopanning aislar fagos que meta los huesos largos

Fago ADN fue secuenciado y péptidos con una secuencia correspondiente se sintetizaron. Los péptidos se sintetizaron con Gly-Gly-Gly-Ser-lisina enlazador (linker la que se necesita para cromóforos fluorescentes par que ayudan a la pista / trace los péptidos).

1. A 10 semanas de edad ratones Balb / c ratón fue anestesiado, el corazón fue expuesto.
2. El doctorado-12 fagos péptido biblioteca kit (New England Biolabs, Beverly, MA) fue utilizado en vivo biopanning, 10 x 1010 ufp, y se inyecta en el corazón.
3. Después de aproximadamente 5 minutos, el ratón fue sacrificado. Los fémures fueron expuestos y diseccionados, los extremos de los fémures estaban cortadas, y la médula ósea fue removido.
4. El interior y el exterior del fémur izquierdo se lavaron 10 veces con PBS, y el fémur se añadió a ER2537 bacteria (en adelante, no eluyen fagos, vaya al paso 6).
5. El canal intramedular del fémur derecho, se enjuagó con-seca 2% de leche descremada en una jeringa con una aguja de calibre 21 diez veces para expulsar a los no obligados fago. Fago unido se eluye de la canal intramedular con HCl-glicina buffer de pH 2,2, se neutralizó con Tris 1M, sumado a ER2537 bacteria, y se cultivan durante 4,5 horas para amplificar los fagos (conocido como eluido).
6. Las bacterias se eliminan por sedimentación centrífuga durante 10 min a 4 ° C, y fagos se precipitó la noche a 4 ° C con la adición de PEG / NaCl. El fago se recogió por centrifugación y se suspendió dos veces y se precipitó por adición de 1 / 6 del volumen de PEG / NaCl. El sedimento final se resuspendió en TBS con 0,02% de NaN3.
7. Los eluidos amplifica tanto del fago eluído y no eluyen-se inyectaron en ratones por separado, y fagos fue aislado como antes. Sólo el fémur izquierdo fue retirado del ratón que fue inyectado con el fago no eluye y el fémur se colocan directamente en las bacterias (ver paso 4). El ratón de fagos eluidos se aisló sólo en el fémur derecho y el fago liberado por HCl-buffer glicina antes de añadir a las bacterias (ver paso 5).
8. Este procedimiento biopanning en vivo se repitió tres veces antes de la secuenciación de ADN utilizando primers-98 (suministrado con el kit de fagos).
9. Fagos agrupados se amplifica en cultivos de bacterias, purifica, cuantificar y luego fueron inyectadas en un ratón de cuarta. La secuencia se repitió.
10. Para demostrar la especificidad del péptido de hueso y médula, fagos eluidos de los riñones y el hígado se analizaron como se describe anteriormente. En las cuatro rondas hubo menor cantidad de fagos encuentra en estos órganos (menos del 10%).
11. Los péptidos se sintetizaron con una secuencia Gly-Gly-Gly-Ser-Lys, con y sin biotina que se utilizará para las células y tinción de tejidos, así como para el trabajo en vivo.

2. Cultivo de células mesenquimales de osteogénica experimentos de diferenciación celular

1. Un ratón clonado pluripotenciales de la médula ósea del estroma (D1) de la línea de células aisladas en el laboratorio ¹ se utiliza para los experimentos in vitro. Las células se cultivaron en medio Dulbecco, el DMEM, bajos niveles de glucosa (Gibco cat # 11885-084) suplementado con fetal al 10% de suero bovino (Gibco cat # 16000-044), cincuenta miligramos de ascorbato de sodio por mililitro (Sigma cat # A7631 ), y 100 U / ml de penicilina G y estreptomicina 100 mg / ml (Gibco cat # 15.140-122).
2. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera húmeda de las incubadoras de 5% de CO ₂ con camisa de agua y sub-cultivadas hasta que las células eran aproximadamente el 90% confluente.
3. Células se tripsinizaron, se centrifuga para sedimentar, se cuentan y se siembran a una concentración de 5x10 ³ células / cm ² en cultivo de tejidos tratados con utensilios de plástico.

3. La tinción de péptidos para cultivo de células y tejidos

1. D1 o células de la médula se sembraron en la cámara de fibronectina o gelatina recubierto y diapositivas que contienen DMEM y 10% de suero fetal bovino durante 24 horas.
2. Las células fueron lavadas con PBS. Células / tejidos se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos
3. El exceso de aldehído fueron bloqueados con 0,5 M de glicina (pH 7,5) durante 10 minutos.
4. Receptores endógenos avidina y biotina sobre la superficie de la célula fue bloqueado por la adición de BSA 5% + solución de avidina bloqueo durante 1 hora, se lavó una vez con PBS durante 5 minutos, y luego bloquearon con BSA al 5% + solución de biotina bloqueo durante 1 hora.
5. De 100 M biotinilado L7 y péptidos R1 se añaden a los pocillos durante 30 minutos.
6. Las células fueron lavadas tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno y dilución 1:1000 de la harina de Alexa estreptavidina y se incubó en la oscuridad durante 30 minutos.
7. Las células fueron lavadas y montadas con cubreobjetos Vectashield montaje de los medios de comunicación y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Fosfatasa alcalina Ensayo de actividad

1. Fosfatasa alcalina colorimetric ensayo se llevó a cabo en monocapas utilizando un kit de fosfatasa alcalina (BioRad) según lo recomendado por el fabricante.
2. D1 células se sembraron a una densidad de 5 x 10 ³ células / cm ² en placas de cultivo de 6 pocillos y se trataron con péptido R1, actividad de la ALP se cuantificó en los días 4, 8, 12, 16 y 20.
3. Para preparar los lisados ​​celulares, las capas de células se lavaron tres veces con PBS y luego raspó en PBS seguido por ultrasonidos y centrifugación para eliminar los desechos celulares.
4. Volúmenes iguales de lisado (100 l) fue mezclado con 100 l de sustrato recién preparado colorimétrico para-nitrofenil fosfato, y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos.
5. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 100 L de 0,2 N NaOH soluciones. Actividad de la ALP se midió a 405 nm utilizando lector de ELISA (Bio-Rad).
6. La concentración de proteínas de los lisados ​​celulares se midió con un kit de ensayo de proteínas BioRad, y la actividad de AP se expresó como para-nitrofenol producido en nmol / min / mg de proteína.
7. Actividad de la ALP se calculó de acuerdo a las especificaciones del fabricante (Sigma, Inc.).
8. Las unidades de actividad de la ALP se normalizaron a miligramos de contenido total de proteínas con BCA (Pierce, Rockford, IL) del lisado celular.

5. Diferenciación de células mesenquimales con L7 y R1

1. Subconfluentes mesenquimales (D1), las células fueron cultivadas a aproximadamente el 90% de confluencia y tratados con 5 nm L7 y el péptido R1.
2. Las células fueron cosechadas en el 0,5, 2, 6, 24 y 48 horas, y el ARN se preparó utilizando el kit Qiagen RNeasy con las instrucciones del fabricante.
3. De la transcriptasa inversa (RT), las reacciones fueron recocidos (37 ° C, 10 minutos) y seguido por primer capítulo de síntesis cDNA (42 ° C, 30 minutos) y la inactivación por calor (95 ° C durante 5 minutos). El cDNA resultante se almacenó congelado (-70 º C) hasta el ensayo de PCR en tiempo real.
4. PCR en tiempo real se realizó con el QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen). Las reacciones se realizaron con 25 l de la mezcla SYBR Green maestro kit y adelante y atrás primers (300 nmol / L) de los huesos genes específicos para, por ejemplo Runx2, Osterix, osteocalcina, sialoproteína ósea, y los genes Wnt vía, tales como b-catenina, LRP6, 5a Wnt, 7b, 10b, Dkk1 y OPG y RANKL (ver Tabla 1).
5. El l 3 de la muestra de cDNA se añadió a la mezcla de reacción final sin diluir de la reacción RT. El 96 y en tiempo real en formato de PCR incluyó seis de 10 diluciones por duplicado de las normas de ADN plásmido. Los pozos de la placa fueron sellados con tapas de pegamento óptico (BioRad) y se centrifuga a baja velocidad (300 g, 5 minutos) para asegurar una mezcla completa.
6. Cada muestra fue analizada al menos por duplicado con el instrumento iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. Los protocolos de PCR utilizado involucraba la activación de la polimerasa de ADN AmpliTaq oro seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 segundos, la temperatura de recocido respectivos durante 30 segundos y extensión a 72 ° C durante 30 segundos. El umbral del número de ciclos de PCR (CT) para cada muestra se calculó en el punto donde la fluorescencia excedió el límite del umbral. El límite de umbral se ha fijado a lo largo de la fase lineal logarítmica de las curvas de fluorescencia de 10 a 20 desviaciones estándar (DE) por encima de la media de fluorescencia de fondo. Ecuaciones de la curva estándar se calcularon mediante análisis de regresión de la media de CT en comparación con el log10 de la relación de cDNA para el total actual de ARN. Expresión relativa de los genes objetivo se normalizó a 18S de hueso genes específicos y b-actina se utilizó para el gen de la vía Wnt.

6. En la preparación in vivo de Gelfoam compuesto

1. Utilizando las rutinas de asepsia, cilindros de espuma de gel (Pharmacia Upjohn & cat # 09-0353-01), 3 mm de diámetro y 8 mm de largo, fueron creados con diseño propio instrumento.
2. Veinticuatro horas antes de la cirugía, los cilindros de espuma de gel se empape-cargado, ya sea con o L7 R1 péptido (20 mM en PBS) o solución tampón PBS sin péptido. Los cilindros de espuma de gel fueron transferidas a placas de cultivo estéril de 12 bien y almacenados durante la noche a -4 ° C.
3. En el momento de la cirugía, el compuesto de espuma de gel en placas de cultivo fueron trasladados fuera de la nevera y poner en hielo hasta la cirugía.

7. Los defectos óseos

1. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo del Sistema de Salud de la Universidad de Virginia, antes de que se está realizando. Diez nueve meses de edad, adultos singénico ratas macho Fischer 344 (350-400 g) fueron anestesiados intraperitonealmente con una mezcla de ketamina (50 g por gramo de peso corporal) y xilazina (5 g por gramo de peso corporal).
2. Una técnica quirúrgica bilateral se hizo a la cara anteromedial de la tibia. Las ratas de esta edad o mayores muestran un aumento insignificante en la sección transversal, el área cortical del hueso, la masa ósea, la densidad ósea, y la longitud axial del anteromedial aspecto de la tibia. Un gran defecto, unicortical oblonga se ha creado, que mide 3 mm de ancho por 8 mm de largo con una fresa neumática (Drill Hall de alta velocidad; Zimmer) bajo irrigación con solución salina.
3. El defecto óseo fue tratado con espuma de gel con o sin péptidos. Todos los andamios implantado, que mide 3 mm de ancho por 8 mm de longitud por 1,5 mm de profundidad, se introduce con unos golpecitos suaves. No hay ningún dispositivo externo o interno del miembro de fijación se utiliza después de la operación, y los animales les permite deambular sin restricciones, inmediatamente después de la cirugía.

8. Histología y morfometría

Regeneración ósea se evaluó mediante la morfología general y las imágenes digitales tomadas.

1. Las ratas fueron sacrificados y las tibias se recogieron en 3, 5, y 12 semanas para cuantificar la cantidad de hueso nuevo generado en respuesta a una lesión.
2. Después de comprobar el defecto óseo con cuidado, la tibia cosechados fueron fijadas en 10% neutros formalina tamponada, descalcificadas en RDO rápida descalcificador de 72 horas, luego se procesa de manera rutinaria y embebidos en parafina, y seccionados longitudinalmente.
3. Regeneración ósea se evaluó mediante el examen microscópico bruto y la luz.
4. Diez animales fueron utilizados para cada condición (es decir, defecto vacío, solo espuma de gel y espuma de gel más péptido R1). El defecto de 8 mm unicortical estuvo representada a través de ~ 40 secciones de tejido, cada una de ellas fue de 8 micras de espesor. De las 40 secciones, se utilizó un mínimo de 6 secciones para cuantificar la cantidad de hueso nuevo.
5. Todas las secciones de tejidos fueron teñidas con hematoxilina / eosina (H & E), que las etiquetas de matriz osteoide.
6. Todas las diapositivas se evaluaron mediante microscopía.

9. Reparación ósea

Información general

Reparación de los huesos es claramente un área muy importante de considerar en el campo de la regeneración de tejidos músculo-esqueléticos. Los péptidos que el hueso blanco podría tener una utilidad importante en la práctica de la cirugía ortopédica, sobre todo en el uso de prótesis que puede ser que mora en nosotros por años si no décadas. Las propiedades de los factores de biomimética trópico hueso puede crear un avance tecnológico en el campo de la ingeniería de tejidos, así como para la cirugía de prótesis de hueso. La inclusión de los huesos dirigidas a los factores de polímeros sintéticos o naturales pueden ayudar a la especificidad de la adherencia de las células, con lo que las células endógenas de barrido dentro de los tejidos que están en proceso de reparación y regeneración. Otro objetivo fue establecer si nuestros huesos único dirigido a péptidos identificados por in vivo biopanning de una biblioteca de fagos que se unen a células aisladas de hueso y médula ósea, y tienen el potencial de modular la osteogénesis in vitro y la regeneración ósea in vivo.

En nuestros experimentos, hemos entregado los péptidos en los defectos femorales en ratas, utilizando matrices de polímeros naturales y sintéticos y la regeneración ósea examinado por la histología, la bioquímica, la expresión de genes, micro-CT y la biomecánica con el fin de aclarar detalles de la actividad del péptido sobre la regeneración ósea. Un mayor desarrollo de este enfoque puede conducir al descubrimiento y desarrollo de compuestos biológicamente activos que el hueso blanco y potenciar la reparación a través de mecanismos que están bien caracterizados biológicamente a nivel celular y molecular.

Tinción

Los péptidos se sintetizaron con biotina-etiquetas con el fin de determinar la unión y la localización de las células mesenquimales. Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-etiquetados avidina se utilizó para localizar al microscopio de la unión de los péptidos en las células cultivadas in vitro. Los péptidos se unen a las células mesenquimales de la cultura, así como a los huesos y la médula ósea de ratón en las secciones de tejido costilla in vitro (Figura 1).

Von Kossa tinción

Una de las células mesenquimales (D1) fue clonado a partir de la médula ósea y se utiliza para determinar el efecto osteogénico de los péptidos en las células in vitro. Las células fueron tratadas con péptidos L7 y R1 para determinar los cambios en la morfología celular y la expresión génica. En el día 4, las células habían comenzado a agregar, y los agregados ampliada con el tiempo para formar nódulos, un patrón de comportamiento de las células similares a las células óseas en cultivo (Figura 2).

La adición del péptido L7 o R1 a la tinción de las células mejora de los cultivos con Von Kossa. Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de péptido L7 o R1 para un máximo de 16 días en la cultura. Se determinó que 5 nM del péptido fue más efectivo in vitro. Actividad de fosfatasa alcalina en los cultivos que fueron tratados con el péptido aumento de entre 2 y 3,5 veces. El aumento de veces depende de la concentración de péptido y el tiempo de tratamiento en la cultura.

PCR en tiempo real

Las células tratadas con L7 y péptidos R1 fueron analizados utilizando Real-Time PCR para la expresión de genes de dos factores de transcripción celular ósea conocida (Osterix y Runx2) y tres proteínas de la matriz ósea (hueso sialoproteína, osteocalcina y colágeno tipo I). El tratamiento con R1 mostraron aumentos en Osterix y la expresión de genes Runx2. Colágeno tipo 1 y la expresión del gen se mantuvo sin cambios. El tratamiento con L7 mostraron un aumento en la expresión génica y la osteocalcina BSP así como la expresión del gen del colágeno tipo I. Esto demuestra que ambos péptidos tienen un efecto sobre los genes que están relacionados con la aparición y progresión de la osteogénesis en cultivos de células mesenquimales.

El tratamiento de los cultivos celulares in vitro con la R1 péptidos y L7 ha revelado un efecto anabólico en relación con la formación ósea con células mesenquimales. Un aumento en la proporción de la osteoprotegerina de RANKL indica una disminución en el reclutamiento de las células óseas reabsorción que se conocen como los osteoclastos. Tratamiento de las células con los péptidos también conduce a un aumento en la expresión de genes que están asociados con la formación de hueso y disminuye los factores que inhiben la osteogénesis.

Histología

Para determinar la cantidad de hueso, se exponen las rebanadas de hueso a la luz lo que produce μLtraviolet autofluorescencia. Esto proporciona un mayor contraste entre el hueso y los tejidos no óseos con el objeto de cuantificación ^2. Los cortes fueron fotografiados utilizando tanto en el terreno brillante y la luz UV (Figura 3) una Nikon y la luz ultravioleta por un sistema de imagen digital Nikon con el mismo aumento (x10 objetivo). Las imágenes digitales resultantes se analizaron con el software de imágenes Metavue (Molecular Devices). Hemos elegido una región fija, rectangular de interés (ROI) que contenía el defecto de 8 mm unicortical. El sitio de la lesión fue representado siempre dentro de este retorno de la inversión colocando manualmente la caja en la posición correcta en cada imagen. Los píxeles de H & E-positivos fueron parcialmente automatizados utilizando la herramienta de varita mágica conjunto con una tolerancia de color. Este ajuste dio lugar a la tolerancia píxeles destacado con una gama de verdes que se correspondían exactamente con el aspecto histológico del tejido óseo en las secciones H & E-manchado. El número total de H & E-positivas píxeles para cada sección se registró. El número de píxeles de las secciones individuales fueron promediados para cada muestra de la tibia y las diferencias dentro y entre los grupos de tratamiento se calcularon con base en esos valores. Las áreas para todas las muestras se compararon basándose en la cantidad de hueso cortical nuevo (Figura 4).

La presencia de hueso en las secciones se cuantificó para determinar la reparación del hueso en los defectos tratados con gelfoam péptido + en comparación con espuma de gel solo. Los defectos que se llenaron de espuma de gel péptido + R1 mostraron la mayor cantidad de reparación cortical con un 10, 7 y 2 veces mayor a los 3, 5, 12 semanas, respectivamente. Las diferencias en la reparación del hueso cortical en el gelfoam + péptido en comparación con espuma de gel solo fueron más notables a los 3 y 5 semanas que demuestran que el péptido favorece la regeneración de hueso cortical (Figura 5).

10. Efecto anabólico de los péptidos osteogénica

La relación de OPG / RANKL es mayor que la razón RANKL / OPG, lo que sugiere que los péptidos pueden tener un efecto directo sobre los osteoblastos y regular la resorción ósea.

Péptidos sintéticos pueden tener ventajas sobre las moléculas más grandes, como la velocidad de la preparación, la estabilidad molecular, una larga vida útil y aplicaciones potencialmente terapéuticos. Importantes avances logrados en los intentos de modular la pérdida de masa ósea y la regeneración por el control de las citoquinas y factores de crecimiento. Estos péptidos osteotropic pueden ser una alternativa atractiva a las terapias existentes que estimulan el anabolismo óseo y la regeneración ósea.

Figura 1. Péptido de unión a la médula ósea y en la sección de tejido de ratón costilla in vitro.

Figura 2. Las células mesenquimales (D1) forman nódulos después del tratamiento de péptidos.

Figura 3. Histología de la reparación ósea utilizando péptidos osteogénico, L7 y R1.

Secciones de la Figura 4. Ósea teñidos con H & E bajo la luz ultravioleta que hace que la autofluorescencia. Esto proporciona un mayor contraste entre el hueso y los tejidos no óseos con fines de cuantificación.

Figura 5. Cuantificación de los huesos en las secciones histológicas mostraron la mayor cantidad de reparación cortical a las 5 semanas conun cambio de 10 veces, 7 y 2 veces en 3 y 5 semanas que demuestran que el péptido favorece la regeneración del hueso cortical.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S