Summary
파지 디스플레이 라이브러리는 대상 뼈되는 펩타이드 시퀀스를 식별하는 데 사용되었다. 목표는 mesenchymal 세포 분화에서 이러한 펩티드의 효과를 조사하고 뼈 재생에 대한 그들의 영향을 결정하는 것이었다.
Abstract
두 소설 합성 펩티드는 뼈 형성을 촉진하고 콜라겐 매트릭스를 사용하여 전달할 수 있습니다. 본 연구의 목적은 unicortical 결함 모델에서 뼈 수리에 대한 효과를 조사하는 것이었다. mesenchymal 세포의 치료, 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 활동 증가를 생산하는 세포에 의해 결절 형성을 보여주하고, runx2, osterix, 뼈 sialoprotein 및 osteocalcin에 대한 유전자의 표현을 증가했다. 컨트롤이 덜 효과적 반면 콜라겐 스폰지는 뼈 결함이 펩티드 홍보 복구로 적셔. 본 연구의 결과는 체외에서 펩타이드로 치료 mesenchymal 세포가 콜라겐 스폰지를 사용하여 생체내에 전달 펩티드가 unicortical 결함의 수리를 홍보, osteogenesis 대한 차별, 그리고 보여주었다.
Protocol
1. 생체내에서 파지를 분리 Biopanning 그 대상 긴 뼈가
파지 DNA가 합성되었으며 해당 시퀀스와 펩티드가 합성되었다. 펩티드는 gly - gly - gly - 려던 - 라이신 링커 (링커가 / 트랙 펩티드를 추적하는 데 도움이 부부 형광등 chromophores 필요합니다)와 합성했다.
- 10주 오래된 Balb / C 마우스 anesthetized 되었음 심장이 노출되었다.
- 박사 - 12 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리 키트 (뉴 잉글랜드 Biolabs, 비벌리, MA)는 생체내 biopanning, 10 X 1010 pfu에 사용하고, 심장에 주입했다.
- 약 5 분 후에 마우스가 euthanized되었다. 대퇴골은 노출과 해부, 대퇴골의 끝부분이 차단되었고, 골수가 삭제되었습니다되었습니다.
- 왼쪽 대퇴골의 내부와 외부가 PBS로 10 번 씻어서되었고, 대퇴골이 ER2537 박테리아에 추가되었습니다 (비 eluted 파지라고도, 6 단계로 건너 뜁니다.)
- 오른쪽 대퇴골의 intramedullary 운하가 아닌 바운드 파지를 제거하는 21 게이지 바늘로 주사기에 2% 건조 탈지 우유로 열번을 씻어서되었다. 바운드 파지는 HCL - 글리신 버퍼 산도 2.2, 1M 트리스와 함께 무력화와 intramedullary 운하에서 eluted ER2537 박테리아에 추가하고 파지를 (eluted라고도 함) 증폭 4.5 시간 교양되었습니다.
- 박테리아는 ° C와 파지는 PEG / NaCl 용액의 추가에 의해 4 ° C에서 하룻밤 시켰던했습니다 4에 10 분 원심 침강에 의해 제거되었습니다. 파지는 원심 분리에 의해 수집 정지와 PEG / NaCl의 육분의 일 볼륨에 의해 또한 두 시켰던했다. 최종 펠렛은 0.02 %의 NaN3와 TBS에서 resuspended되었습니다.
- eluted 및 비 - eluted 파지 모두에서 증폭 eluates은 별도의 생쥐에 주입했고, 파지는 위와 같이 고립되었다. 오직 왼쪽 대퇴골이 아닌 eluted 파지와 함께 주입하고, 대퇴골은 (위의 4 단계를 참조) 박테리아에 직접 배치되었다 마우스에서 제거되었습니다. eluted 파지 마우스는 오른쪽 대퇴골과 (위의 5 단계 참조) 박테리아에 추가하기 전에 HCL - 글리신 버퍼로 릴리즈 파지에서 고립되었다.
- 이것은 생체내의 biopanning 절차에 프라이머 (파지 디스플레이 키트와 함께 제공) - 98을 사용하여 DNA의 시퀀싱 전에 세 번 반복되었다.
- 풀링 파지는 정화, 박테리아 문화의 증폭 quantitated 후 사분의 일 마우스에 주입 하였다. 시퀀싱이 반복되었다.
- 뼈 및 골수에 펩타이드 특이성을 증명하기 위해, 파지는 신장에서 eluted하고 위에 설명된대로 간이 분석했다. 네 명 모두 라운드에서 해당 기관 (이하 10 %)에있는 파지의 작은 금액이 발생했습니다.
- 펩티드는과 세포 및 조직 염색법에 사용할 비오틴뿐만 아니라 생체내 작업에 대한 않고, gly - gly - gly - 버리는 -리스 순서로 합성했다.
2. Osteogenic 세포 차별화 실험에 대한 Mesenchymal 세포 배양
- 우리 실험실 1 격리 복제 마우스 pluripotential 뼈 - 골수 기질 (D1) 세포 라인은 체외 실험에서 사용되었다. 세포는 Dulbecco의 수정 필수 중간, DMEM 10 % 태아 소 혈청 (Gibco 고양이 # 16000-044), 밀리리터 당 나트륨 아스코 브 50 밀리그램 (와 보충 낮은 포도당 (Gibco 고양이 # 11885-084)에 교양되었습니다 시그마 고양이 # A7631 ), 100 U / ML 페니실린 G와 100mg / ML 스트렙토 마이신 (Gibco 고양이 # 15140-122).
- 문화가 37 유지했다 ° 5 % CO 2 물 외피 incubators 및 하위 양식의 humidified 분위기에서 C 세포가 약 90% 합류했다 때까지.
- 세포는 trypsinized 펠렛을 centrifuged, 계산 및 plasticware 치료 5x10 3 세포 / 조직 문화에 cm 2 농도에 씨앗을 품고 있었다.
3. 교양 세포 조직에 대한 펩타이드 스테 이닝
- D1 또는 골수 세포는 fibronectin 또는 젤라틴 코팅 챔버에서 도금했다 잘 DMEM 24 시간 10 % 태아 소 혈청을 포함하는 슬라이드.
- 세포는 PBS로 씻은되었습니다. 세포 / 조직은 30 분 동안 4 % paraformaldehyde로 고정되었습니다
- 초과 알데히드는 10 분 동안 0.5 M 글리신을 (산도 7.5)를 사용하여 차단되었습니다.
- 세포 표면에 내생 아비딘와 비오틴 수용체가 1 시간 5% BSA + 아비딘 차단 솔루션의 추가에 의해 차단된 후 1 시간 동안 5% BSA + 비오틴 차단 솔루션으로 차단 5 분, 대한 PBS로 한번 씻어서.
- 그렇다면 100 μm의는 L7을 biotinylated과 R1 펩티드는 30 분 동안 우물에 추가되었습니다.
- 전지는 각각 알렉사 밀가루 Streptavidin의 1:1000 희석 30 분간 추가되고 어둠 속에 incubated되었습니다 5 분 PBS로 세 번 씻어했다.
- 전지는 세탁과 coverslips는 vectashield 설치 미디어 탑재하고 형광 현미경으로 조사되었다.
4. 알칼리성 인산 가수 분해 효소 활동 분석
- 알칼리성 인산 가수 분해 효소 Colorimetric 분석은 같은 제조 업체에서 권장하는 알칼리성 인산 가수 분해 효소 키트 (BioRad)를 사용 monolayers에서 수행되었다.
- D1의 세포 X 10 3 셀 / cm 2 6 - 글쎄 문화 접시에있는 밀도 5 도금과 R1 펩타이드로 치료했고 알프 활동 일 4, 8, 12, 16 및 20에서 계량했다.
- 세포 lysates를 준비하려면, 셀 레이어는 PBS 버퍼로 세 번 씻어 후 PBS로 스크랩한하던 sonication와 세포 부스러기를 제거하기 위해 원심 분리하여 따라갔다.
- lysate (100 μL)의 동등 권은 다음 신선한 colorimetric 기판의 100 μL 패러 nitrophenyl 인산과 혼합하고, 37 incubated되었습니다 ° C 30 분.
- 효소 반응은 0.2 N NaOH 솔루션을 100 μL를 추가하여 중지되었습니다. 알프 활동 엘리사 리더 (생물 래드)를 사용하여 405 nm의에서 측정되었다.
- 세포 lysates의 단백질 농도는 BioRad 단백질 분석 키트로 측정되었고, AP 활동은 다음의 단백질 nmol / 분 / MG에서 생산되는 패러 nitrophenol으로 표현했다.
- 알프 활동은 제조 업체의 사양 (시그마 주식 회사)에 따라 계산되었습니다.
- 알프 활동의 단위는 세포 lysate의 BCA 분석 (피어스, 록퍼드, IL)로 전체 단백질의 콘텐츠 밀리그램으로 정상화되었습니다.
5. L7과 R1을 사용하여 Mesenchymal 세포 분화
- Subconfluent mesenchymal (D1) 세포 confluency 약 90 % 성장하고 5nM L7과 R1의 펩타이드로 치료했다.
- 전지는 0.5, 2, 6, 24 및 48 시간에 수확도하고, RNA는 제조 업체의 지침을 사용하여 Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 준비되었습니다.
- 리버스 transcriptase (RT) 반응은 annealed (37 ° C, 10 분)과 첫 번째 가닥 cDNA 합성 (42 ° C, 30 분)와 열 불활 성화 (5 분 95 ° C)에 의해 다음되었다. 그 결과 cDNA는 냉동 보관했습니다 (-70 ° C) 실시간 PCR에 의해 assayed까지.
- 실시간 PCR은 QuantiTect SYBR 녹색 PCR 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행되었습니다. 반응은 25 SYBR 그린 키트 마스터 믹스 μL와 순방향 및 예 Runx2, Osterix, Osteocalcin, 뼈 sialoprotein, 그리고 B - catenin과 같은 wnt 통로의 유전자에 대한 뼈 특정 유전자의 반대 primers (300 nmol / L)로 수행되었습니다 LRP6, Wnt 5A, 7B, 10B, DKK1 및 OPG와 RANKL (표 1 참조).
- cDNA 샘플의 3 μL은 RT 반응에서 undiluted 최종 반응 혼합물에 추가되었습니다. 96 - 웰 실시간 PCR 형식이 플라스미드 DNA 표준 중복 여섯 10 배 dilutions 포함되어 있습니다. 접시의 우물은 광학 접착제 커버 (BioRad)와 봉인 및 믹싱 완료하기 위해 낮은 속도 (300g, 5 분)에서 centrifuged했다.
- 각 샘플은 최소한 iCycler 악기 (BioRad 연구소, 헤라클레스, CA)과 중복으로 분석되었다.
- PCR 프로토콜 94의 변성의 40주기에 의해 다음 AmpliTaq 골드의 DNA 중합 효소의 참여 활성화를 사용 ° C 30 초, 30 초 동안 72 ° C에서 30 초 및 확장에 대한 각각의 풀림 온도. 각 시료에 대한 PCR 임계값 사이클 번호 (중부 표준시)은 형광이 임계값 한도를 초과 지점에서 계산되었다. 임계값 한도는 평균 배경 형광 위 10-20 표준 편차 (SDS)의 형광 곡선의 선형 대수 단계를 따라 해결되었습니다. 표준 곡선 방정식은 총 RNA 선물로 cDNA 상대의 log10 대 평균 중부 표준시의 회귀 분석에 의해 계산되었다. 대상 유전자의 상대 표현은 뼈 특정 유전자에 대한 18S로 정상화되었고 B - 굴지는 Wnt 통로의 유전자에 사용되었다.
6. Gelfoam 복합의 생체내 준비
- 무균 루틴을 사용하여 gelfoam 실린더 (Pharmacia & 업존 고양이 # 09-0353-01), 길이 8mm의 직경 3mm은 자기 설계 악기를 사용하여 만들어졌습니다.
- 스물 네 시간 수술 전에 gelfoam 실린더 있었다 흡수 -로드 L7 또는 펩타이드없이 R1 펩타이드 (PBS에서 20 μm의) 또는 PBS 버퍼 중 하나와 함께. gelfoam 실린더는 무균 12 잘 문화 요리로 전송하고 -4 ° C.에 하룻밤 보관되었습니다
- 수술 당시, 문화, 요리에 gelfoam의 합성은 냉장고에서 꺼내 이동되었으며 수술까지 얼음에 넣어.
7. 본 결함
- 모든 동물의 절차는 버지니아 대학에서 보건 시스템의 동물 케어 및 사용위원회, 이전에 수행되기 위해서 승인되었습니다. 십 구 달 된 성인 syngeneic 남성 피셔 344 쥐 (3백50-4백g)는 마취제 (g 체중 당 50g)와 xylazine (g 체중 당 5g)의 혼합물로 anesthetized intraperitoneally되었습니다.
- 양국 수술 접근법은 경골의 anteromedial 관점에서 만들어졌다. 이 나이에 이상 쥐 단면적에 볼품 증가, 대뇌 피질의 뼈 지역, 뼈 질량, 뼈 밀도 및 anteromedia의 축 길이를 표시경골의 내 측면. 생리 관개에 따라, 대형 직사각형 unicortical 결함은 오랫동안 공기 버를 (짐머 홀 고속 드릴)를 사용하여 8mm 폭 3mm를 측정하는 만들었습니다.
- 뼈 결함이 펩티드 여부와 상관없이 어느 gelfoam로 치료했다. 1.5 mm 깊이로 8mm 길이가 3mm 폭을 측정하는 모든 이식 공사장 공중 발판은, 부드럽게 눌러서로 삽입되었다. 외부 또는 내부 사지 고정 장치 postoperatively 사용하지 않으며 제한없이 ambulate 수 동물은 즉시 수술을 따라했다.
8. 조직학 및 Morphometry
본 재생은 총 형태학 및 촬영한 디지털 이미지에 의해 평가되었다.
- 쥐은 euthanized되었으며 tibias 5, 3에서 수집된 있었다 12 주 부상에 대한 응답으로 생성된 새로운 뼈의 양을 수치.
- 조심스럽게 뼈 결함을 확인 후, 수확 경골은 다음 길이 방향 일상적으로 처리하고 파라핀에 포함하고, sectioned, 72 시간 RDO 신속한 decalcifier에 decalcified, 중립은 포르말린 버퍼 10 % 해결되었습니다.
- 본 재생은 총 가벼운 현미경 검사에 의해 평가되었다.
- 텐 동물은 각 조건 (즉, 비어있는 결함, gelfoam 혼자하고, gelfoam 플러스 R1 펩타이드)에 사용되었습니다. 8mm unicortical 결함은 8 μm의 두께되었다 각각의 ~ 40 조직 섹션에 걸쳐 표현되었다. 그 40 섹션, 우리는 새로운 뼈의 양을 계량 6 섹션의 최소를 사용합니다.
- 모든 조직 섹션은 뼈 같은 매트릭스를 레이블 hematoxylin / eosin (H & E)와 스테인드되었습니다.
- 모든 슬라이드는 현미경으로 평가했다.
9. 본 수리
개요
본 수리 명확하게 musculoskeletal 조직 재생 분야의 배려에 매우 중요한 지역입니다. 대상 뼈 특히 년 않을 경우 수십 년 동안 내재 수 protheses의 사용, 정형 외과의 실천에 중요한 유틸리티를 할 수있는 펩티드. 뼈 트로픽 요인의 biomimetic 속성은 기술 조직 공학 분야에서 앞으로 단계뿐만 아니라 뼈의 인공 수술을 만들 수 있습니다. 합성 또는 천연 고분자의 요소를 대상으로 뼈 포함하므로 수리와 재생을 겪고 아르 조직 내에 내생 세포를 청소, 세포 부착의 특이성을 도와 수 있습니다. 추가 목표는 파지 디스플레이 라이브러리의 biopanning 생체내에 의해 식별 펩티드를 대상으로 우리 고유의 뼈가 뼈 및 골수에서 분리된 세포에 바인딩면 확립하고, 생체내의 체외와 뼈 재생에 osteogenesis을 조절하는 잠재력을 가지고하는 것이었다.
우리의 실험에서, 우리는 뼈 재생에 대한 펩타이드 활동의 세부 사항을 명료하게하다하는 조직학, 생화학, 유전자 발현, 마이크로 - CT와 순서 biomechanics 검사를 자연과 합성 폴리머 매트릭스와 뼈를 재생을 사용하여 쥐에서 대퇴 결함에 펩티드를 전달. 이 접근법의 앞으로의 개발은 생물학적으로 활성 화합물 것을 목표 뼈의 발견과 개발로 이어질 잘 세포와 분자 수준에서 생물 학적 특징 메커니즘을 통해 수리를 힘을 주다 수 있습니다.
더럽히는 것
펩티드는 mesenchymal 세포에 바인딩 및 현지화을 결정하기 위해 비오틴 - 레이블 합성했다. 플루오레신 - isothiocyanate (FITC) 아비딘가 미세 체외에서 성장 세포에있는 펩티드의 바인딩을 집중하기 위해 사용되었습니다 - 표시. 펩티드는 문화 mesenchymal 세포뿐만 아니라 체외에서 마우스 리브 조직 섹션 (그림 1)의 뼈 및 골수에 바인딩.
본 Kossa의 스테 이닝
mesenchymal 세포는 (D1) 골수에서 복제하고 체외에서 세포에 펩티드의 osteogenic 효과를 결정하는 데 사용되었다. 세포는 세포 형태와 유전자 발현의 변화를 결정하는 펩티드 L7와 R1로 치료했다. 일 4, 전지 집계하기 시작했고, 집계가 nodules, 문화의 뼈 세포 (그림 2)와 유사한 세포의 행동 패턴을 형성하는 시간을 확대.
펩타이드 L7를 추가하거나 본 Kossa와 문화의 세포 향상된 얼룩에 R1. 전지는 다음 최대의 문화에서 16 일 동안 펩타이드 L7 또는 R1 다른 농도로 치료했다. 그것은 5 NM의 펩타이드가 체외에서 가장 효과적인 것을 결정했다. 펩타이드 대우 있던 문화에 알칼리성 인산 가수 분해 효소 활동은 2 사이 3.5 배 증가. 배 증가 펩타이드와 문화에 치료 시간의 농도에 의존.
실시간 PCR
L7 취급 세포 R1 펩티드는 리얼 타임 P를 사용하여 분석되었다이 알려진 뼈 세포 전사 요인 (Osterix과 Runx2) 세 뼈 매트릭스 단백질 (뼈 sialoprotein, osteocalcin과 콜라겐 유형 I)에 대한 유전자 발현을위한 CR. R1과 치료 Osterix과 Runx2의 유전자 발현의 증가를 보여주었다. 콜라겐 1 형 유전자 표현이 변하지 남아. L7과 치료 BSP 및 osteocalcin 유전자 발현의 증가뿐만 아니라, 유형 I 콜라겐 유전자의 표현을 보여주었다. 이것은 두 펩티드는 mesenchymal 세포 문화에 osteogenesis의 발병과 진행에 관련된 유전자에 영향이 있는지 보여줍니다.
펩티드 R1과 L7과 함께 체외 세포 배양에의 치료 mesenchymal 세포를 사용하여 뼈 형성과 관련된 근육 강화 효과를 밝혔다. RANKL에 osteoprotegerin의 비율의 증가는 osteoclasts로 알려져있는 뼈 resorbing 세포의 채용 감소를 나타냅니다. 펩티드와 함께 세포의 치료는 뼈 형성과 관련된과 osteogenesis을 억제하는 요인을 감소 아르 유전자의 표현 증가로 연결됩니다.
조직학
뼈의 수량을 결정하기 위해, 우리는이를 autofluorescence를 생산 μLtraviolet 빛을 뼈의 조각 노출. 이것은 quantitation 2의 목적을 위해 뼈 및 비 뼈 조직 사이에 큰 대조를 제공합니다. 섹션은 동일한 배율 (X10 목적)에서 니콘 디지털 이미징 시스템에 의해 명시야 및 UV 라이트 (그림 3) 니콘과 자외선을 모두 사용하여 촬영되었다. 그 결과 디지털 이미지는 Metavue 이미징 소프트웨어 (분자 장치)로 분석되었다. 우리는 8mm unicortical 결함을 포함하고 관심의 고정, 직사각형 영역 (ROI)을 선택했습니다. 상해 사이트는 항상 수동으로 각각의 이미지를 올바른 위치에 상자를 배치하여 투자 수익 (ROI) 안에 표시했습니다. H & E - 긍정적인 픽셀은 부분적으로 색상 오차로 설정 마법 지팡이 도구를 사용하여 자동되었습니다. H & E - 묻은 부분에 뼈의 조직의 histological 모습과 정확하게 통신을 녹색의 범위 강조 픽셀 결과이 허용 설정. H & 각 섹션에 대한 E - 긍정적인 픽셀의 총 개수가 기록되었습니다. 개별 섹션에서 픽셀 카운트는 각 tibial 샘플에 대한 평균되었으며 치료 그룹 내의과 사이의 차이는이 평균을 기준으로 계산했다. 모든 샘플에 대한 영역은 다음 새 피질 골의 양을 (그림 4)에 따라 비교했다.
섹션 뼈의 존재는 혼자 gelfoam 비교하여 gelfoam + 펩타이드 대우 결함에 뼈를 복구를 결정하는 계량했다. gelfoam + R1 펩타이드로 가득 차 있었다 결함은 3 시에 가장 큰 10과 대뇌 피질의 수리 금액, 7, 2 배 증가, 5, 12주 각각을 보여주었다. gelfoam의 피질 뼈 수리의 차이 + 펩타이드 혼자 gelfoam에 비해 펩타이드는 대뇌 피질의 뼈 재생 (그림 5)을 촉진 것을 보여주는 3 오주에서 가장 눈에 띄게되었다.
10. Osteogenic 펩티드의 근육 효과
OPG / RANKL 비율은 펩티드가 osteoblasts에 직접적인 영향을 미치고 뼈 재흡수 조절을 수있는 제안 RANKL / OPG 비율보다 큽니다.
합성 펩티드는 준비 속도, 분자 안정성, 긴 진열 삶과 잠재적 치료 응용 프로그램과 같은 큰 분자 이상의 장점이있을 수 있습니다. 큰 진전은 통제 크린 시토킨과 성장 요인에 따라 뼈 손실 및 재생을 조절하려고 시도에서 만든되었습니다. 이러한 osteotropic 펩티드는 뼈 anabolism 및 뼈 재생을 자극 기존의 치료에 매력적인 대안을 제공할 수 있습니다.
그림 1. 골수와 체외에서 마우스 리브 조직 섹션에서 뼈 바인딩 펩타이드.
그림 2. Mesenchymal 세포 (D1) 펩타이드 치료 후 nodules를 형성하고 있습니다.
그림 3. osteogenic 펩티드, L7 및 R1을 사용하여 뼈 수리의 조직학.
그림 4. 본 섹션은 autofluorescence 원인은 자외선 아래에서 H & E 물들다. 이것은 quantitation을 위해 뼈 및 비 뼈 조직 사이에 큰 대조를 제공합니다.
그림 5. 조직학 섹션에있는 뼈 Quantitation 대뇌 피질의 수리의 가장 큰 금액이 5 주가되었습니다했다10 배 변화, 7, 2 배 3과 펩타이드가 대뇌 피질의 뼈 재생을 촉진 것을 보여주는 오주.
Disclosures
이 비디오의 제작이 문서에서 사용되는 시약의 일부를 생산하고 뉴잉글랜드 Biolabs, Inc의 후원했다.
Acknowledgments
건강, AR53579, Osteogenesis 국립 연구소 : 본 트로픽 펩티드와 Potentiation
보건 국립 연구소, AR056422, Osteogenic 펩티드의 근육 효과
보건 국립 연구소, T32 AR050960, Musculoskeletal 조직 정비 및 리제 너 레이션
국방부 PC051219 Nucleolin : 전립선암과 골수 내피 세포 접착의 소설 중재자
국방부, PC061508, 전립선 암 전이 셀 골수 접착 중재자
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12 | New England Biolabs | E8110S |
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