Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Summary

Uma biblioteca de mostrar fago foi utilizado para identificar seqüências de peptídeos que o osso alvo. O objetivo foi investigar o efeito destes peptídeos sobre a diferenciação de células mesenquimais e determinar seus efeitos sobre a regeneração óssea.

Abstract

Dois novos peptídeos sintéticos acelerar a formação óssea e podem ser entregues utilizando uma matriz de colágeno. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos sobre a reparação óssea em um modelo de defeito unicorticais. Tratamento de células mesenquimais produziu um aumento na atividade da fosfatase alcalina, mostrou formação de nódulos pelas células, e aumentou a expressão de genes para Runx2, osterix, sialoproteína óssea e osteocalcina. A esponja de colágeno embebida com a reparação promovida peptídeo de defeitos ósseos, enquanto o controle foi menos eficaz. Os resultados deste estudo demonstraram que as células mesenquimais tratados com peptídeo in vitro para diferenciar a osteogênese, e, que os peptídeos entregues in vivo utilizando uma esponja de colágeno promover a reparação de defeitos unicorticais.

Protocol

1. In vivo Biopanning para isolar Phage que os ossos meta de longo

Fago de DNA foi seqüenciado e Peptídeos com uma correspondente seqüência foram sintetizados. Peptídeos foram sintetizados com gli-gli-gli-ser-lisina linker (o linker é necessário para casal cromóforos fluorescentes que ajudam a controlar / trace os peptídeos).

1. A 10 semanas do mouse Balb / c idade foi anestesiado, o coração foi exposto.
2. O Ph.D-12 Phage mostrar peptídeo biblioteca kit (New England Biolabs, Beverly, MA) foi utilizado para in vivo biopanning, 10 x 1.010 UFP, e injetadas no coração.
3. Depois de aproximadamente cinco minutos, o rato foi eutanasiado. Os fêmures foram expostos e dissecados, as extremidades dos fêmures foram cortados, e da medula óssea foi removido.
4. O interior eo exterior do fêmur esquerdo foram lavadas 10 vezes com PBS, e do fêmur foi adicionado em ER2537 bactérias (referido como não-eluída fago, pule para o passo 6).
5. O canal intramedular do fêmur direito foi lavado com 2% de leite desnatado-dried em uma seringa com uma agulha calibre 21 dez vezes para remover não-vinculados fago. Fago ligada foi eluída da canal intramedular com pH tampão HCl-glicina 2.2, neutralizado com 1M Tris, adicionado ao ER2537 bactérias, e cultivados por 4,5 horas para amplificar o fago (referido como eluído).
6. As bactérias foram removidos por sedimentação centrífuga por 10 min a 4 ° C, e fago foi precipitado durante a noite a 4 ° C pela adição de PEG / NaCl solução. O fago foi coletado por centrifugação e suspensos e precipitado duas vezes com a adição de 1 / 6 do volume de PEG / NaCl. O pellet final foi ressuspenso em TBS com NaN3 0,02%.
7. Os eluatos amplificado a partir de ambos os fagos eluídos e não eluída foram injetadas em ratos separados, e fago foi isolado como descrito acima. Somente o fêmur esquerdo foi retirado do mouse que foi injetado com o fago não-eluído e do fêmur colocado diretamente as bactérias (veja o passo 4 acima). O mouse fago eluída foi isolada somente a partir do fêmur direito eo fago lançado pela HCl-tampão glicina antes de adicionar à bactéria (veja o passo 5 acima).
8. Este procedimento in vivo biopanning foi repetido três vezes antes de seqüenciamento de DNA usando-98 primer (fornecido com o kit de exibição Phage).
9. Fago agrupados foram amplificados em culturas bacterianas, purificado, quantificado e então foram injetados em um rato quarto. Seqüenciamento foi repetida.
10. Para demonstrar a especificidade de peptídeos ao osso e medula, fago eluída rins e fígado foram analisadas como descrito acima. Em todos os quatro rodadas, houve menor quantidade de fagos localizados nesses órgãos (menos de 10%).
11. Peptídeos foram sintetizados com uma seqüência Gly-Gly-Gly-Ser-Lys, com e sem biotina para ser usado para celular e coloração de tecidos, bem como para o trabalho em vivo.

2. Cultura de Células mesenquimais de Experimentos diferenciação osteogênica celular

1. A linhagem de células clonadas do mouse estroma da medula óssea pluripotenciais (D1) isolados em nosso laboratório ¹ foi usado para experimentos in vitro. As células foram cultivadas em meio Dulbecco modificado é essencial, DMEM, glicose baixa (Gibco 11885-084 # cat) suplementado com 10% soro fetal bovino (Gibco 16000-044 # cat), cinqüenta miligramas de ascorbato de sódio por mililitro (Sigma cat # A7631 ), e 100 U / mL de penicilina G e 100 mg / mL estreptomicina (Gibco 15140-122 # cat).
2. Culturas foram mantidas a 37 ° C em atmosfera húmida de 5% CO ₂ incubadoras com camisa de água e sub-cultivados até que as células foram cerca de 90% confluentes.
3. Celulares foram tripsinizados, centrifugado a pelota, contados e semeado em uma concentração de 5x10 ³ células / cm ² em cultura de tecidos tratados plasticware.

3. Coloração peptídeo de células e tecidos

1. D1 ou células da medula foram semeadas em câmara de fibronectina ou gelatina revestidos assim slides contendo DMEM e 10% de soro fetal bovino por 24 horas.
2. Células foram lavadas com PBS. Células / tecidos foram fixados com paraformaldeído 4% por 30 minutos
3. Aldeído excesso foram bloqueados usando 0,5 M Glycine (pH 7,5) por 10 minutos.
4. Receptores endógenos avidina e biotina na superfície celular foi bloqueado pela adição de 5% BSA solução Avidin + bloqueio por 1 hora, lavadas uma vez com PBS por 5 minutos, em seguida, bloqueadas com 5% BSA solução Biotina + bloqueio por 1 hora.
5. De 100 mM biotinilado L7 e peptídeos R1 foram adicionados aos poços por 30 minutos.
6. Células foram lavadas três vezes com PBS por 5 min cada e diluição de 1:1000 Farinha Alexa Estreptavidina foi adicionado e incubado no escuro por 30 minutos.
7. Células foram lavadas e montadas com lamínulas media vectashield montagem e examinada sob um microscópio de fluorescência.

4. Ensaio de Atividade de fosfatase alcalina

1. Fosfatase alcalina colorimetric ensaio foi realizado em monocamadas usando um kit de fosfatase alcalina (BioRad), conforme recomendado pelo fabricante.
2. Células D1 foram semeadas a uma densidade de 5 x 10 ³ células / cm ² em placas de 6-cultura e bem tratados com peptídeo R1, atividade de ALP foi quantificada nos dias 4, 8, 12, 16 e 20.
3. Para preparar o lisados ​​celulares, camadas de células foram lavadas três vezes com tampão PBS e, em seguida, raspado em PBS seguido por sonicação e centrifugação para remover detritos celulares.
4. Volumes iguais de lisado (100 mL) foi misturada com 100 mL do substrato colorimétrico preparada para-nitrofenil fosfato, e incubados a 37 ° C por 30 minutos.
5. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 100 L de 0,2 N NaOH soluções. Atividade de ALP foi medida a 405 nm utilizando leitor de ELISA (Bio-Rad).
6. Concentração de proteína do lisados ​​celulares foi medida com um Kit BioRad Protein Assay, ea atividade AP foi então expressa em par-nitrofenol produzido em nmol / min / mg de proteína.
7. Atividade de ALP foi calculado de acordo com as especificações do fabricante (Sigma, Inc.).
8. Unidades de atividade de ALP foram normalizados a miligramas de teor de proteína total com BCA ensaio (Pierce, Rockford, IL) do lisado celular.

5. Diferenciação de células mesenquimais usando L7 e R1

1. Confluentes mesenquimais (D1), as células foram cultivadas em cerca de 90% confluência e tratados com 5nm L7 e peptídeo R1.
2. As células foram colhidas a 0,5, 2, 6, 24 e 48 hrs, eo RNA foi preparado usando o kit Qiagen RNeasy usando as instruções do fabricante.
3. Transcriptase reversa (RT) foram reações recozido (37 ° C, 10 minutos) e seguiram pela costa de primeira síntese de cDNA (42 ° C, 30 minutos) e inativação de calor (95 ° C por 5 minutos). O cDNA resultante foi mantido congelado (-70 ° C) até analisadas por PCR em tempo real.
4. Real Time PCR foi realizada utilizando o SYBR Green PCR QuantiTect kit (Qiagen). As reações foram realizadas com 25 mL da mistura mestre kit SYBR Green e para a frente e primers reverso (300 nmol / L) de osso por exemplo, genes específicos para Runx2, Osterix, osteocalcina, sialoproteína Bone, e via de genes Wnt, como b-catenina, LRP6 5a, Wnt, 7b, 10b, DKK1 e OPG e RANKL (ver Tabela 1).
5. O mL de amostra cDNA 3 foi adicionada à mistura de reação final, não diluída a partir da reação RT. Os 96 poços em tempo real formato de PCR incluiu seis de 10 diluições em duplicata dos padrões de DNA plasmidial. Os poços da placa foram selados com capas adesivas óptico (BioRad) e centrifugado a baixa velocidade (300 g, 5 minutos) para assegurar a mistura completa.
6. Cada amostra foi analisada pelo menos em duplicado com o instrumento iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. Os protocolos de PCR utilizado ativação envolvidos de AmpliTaq DNA polimerase Ouro seguida de 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 30 segundos, temperatura de recozimento respectivos por 30 segundos, e extensão a 72 ° C por 30 segundos. A PCR número do ciclo limite (CT) para cada amostra foi calculado no ponto onde a fluorescência excedeu o limite. O limite máximo foi fixado ao longo da fase linear logarítmica das curvas de fluorescência em 10-20 desvios-padrão (SDs) acima da média fluorescência de fundo. Equações da curva padrão foram calculados por análise de regressão da média CT versus o log10 da relação cDNA para o presente RNA total. Expressão relativa dos genes-alvo foi normalizado para 18S para o osso genes específicos e b-actina foi usado para o gene Wnt caminho.

6. Em Preparação vivo de Gelfoam Composite

1. Usando rotinas de assepsia, gelfoam cilindros (Pharmacia & Upjohn cat # 09-0353-01), 3 mm de diâmetro por 8 mm de comprimento, foram criados usando a auto-concebidos instrumento.
2. Vinte e quatro horas antes da cirurgia, os cilindros foram gelfoam embeber-carregado com um L7 ou peptídeo R1 (20 mM em PBS) ou tampão PBS sem peptídeo. Os cilindros gelfoam foram transferidos para placas de cultura estéreis 12 bem e armazenados durante a noite a -4 ° C.
3. No momento da cirurgia, o compósito gelfoam em placas de cultura foram removidos da geladeira e colocar em gelo até a cirurgia.

7. Defeitos ósseos

1. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Sistema de Saúde da Universidade da Virginia, antes de ser executado. Dez nove meses de idade, do sexo masculino adulto singeneicos Fischer 344 ratos (350-400 g) foram anestesiados intraperitonealmente com uma mistura de cetamina (50 g por grama de peso corporal) e xilazina (5 g por grama de peso corporal).
2. A abordagem bilateral cirúrgica foi feita para o aspecto ântero-medial da tíbia. Ratos nessa idade ou mais velhos mostram aumentos insignificantes em área transversal, área cortical óssea, massa óssea, densidade óssea, e comprimento axial do anteromedial aspecto da tíbia. Um grande defeito oblongo unicorticais foi criado, que mede 3 milímetros de largura por 8 mm de comprimento utilizando uma broca pneumática (Drill Hall de Alta Velocidade; Zimmer) sob irrigação salina.
3. O defeito ósseo foi tratado com gelfoam com ou sem peptídeos. Todos os andaimes implantado, medindo 3 mm de largura por 8 mm de comprimento por 1,5 mm de profundidade, foram inseridos tocando suave. Nenhum dispositivo de fixação externa ou interna do membro foram utilizadas no pós-operatório, e os animais autorizados a deambular sem restrição imediatamente após a cirurgia.

8. Histologia e morfometria

Regeneração óssea foi avaliada pela morfologia bruta e imagens digitais tomadas.

1. Ratos foram sacrificados e as tíbias foram coletados em 3, 5 e 12 semanas para quantificar a quantidade de osso novo gerado em resposta à lesão.
2. Depois de verificar o defeito ósseo com cuidado, a tíbia colhidas foram fixadas em 10% neutro tamponado, descalcificadas em RDO rápida descalcificante por 72 horas, em seguida, processadas rotineiramente e incluídas em parafina e seccionados longitudinalmente.
3. Regeneração óssea foi avaliada pela bruta e luz exame microscópico.
4. Dez animais foram utilizados em cada condição (ou seja, defeito vazio, gelfoam sozinho, e mais gelfoam R1 peptídeo). O defeito 8 milímetros unicorticais foi representada em todo ~ 40 cortes de tecido, cada um dos quais foi de 8 mm de espessura. Desses 40 seções, foi utilizado um mínimo de 6 seções para quantificar a quantidade de osso novo.
5. Todos os cortes de tecidos foram corados com hematoxilina / eosina (H & E), que rotula matriz osteóide.
6. Todas as lâminas foram avaliadas por microscopia.

9. Reparação óssea

Visão global

Reparação óssea é claramente uma área muito importante de consideração no campo da regeneração de tecidos músculo-esqueléticos. Os peptídeos que o osso alvo poderia ter utilidade significativa na prática de Cirurgia Ortopédica, especialmente no uso de próteses que podem ser residente há anos se não décadas. As propriedades biomimético de fatores trópico osso poderia criar um passo tecnológico para a frente no campo da engenharia de tecidos, bem como para a cirurgia de prótese do osso. Inclusão de osso segmentação fatores em polímeros sintéticos ou naturais podem ajudar a especificidade de adesão celular, assim a limpeza células endógenas dentro dos tecidos que estão em reparação e regeneração. Um objetivo adicional foi o de estabelecer se o nosso osso único alvo peptídeos identificados por in vivo biopanning de uma biblioteca phage mostrar que se ligam a células isoladas do osso e da medula óssea, e têm o potencial de modular a osteogênese in vitro e regeneração óssea in vivo.

Em nossos experimentos, entregamos os peptídeos em defeitos femorais em ratos utilizando matrizes de polímeros naturais e sintéticos e regeneração óssea examinadas por histologia, bioquímica, expressão gênica, micro-CT e biomecânica, a fim de elucidar detalhes da atividade de peptídeos na regeneração óssea. Maior desenvolvimento desta abordagem pode levar à descoberta e desenvolvimento de compostos biologicamente ativos que o osso alvo e potencializar, através de mecanismos de reparo que estão bem caracterizados biologicamente a nível celular e molecular.

Coloração

Os peptídeos foram sintetizados com biotina-etiquetas, a fim de determinar vinculação e localização para as células mesenquimais. Isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado com avidina foi usado para localizar microscopicamente a ligação de peptídeos em células cultivadas in vitro. Os peptídeos se ligam a células mesenquimais em cultura, bem como para os ossos e medula em seções do mouse costela tecido in vitro (Figura 1).

Von Kossa coloração

Uma célula mesenquimal (D1) foi clonada a partir de medula óssea e usado para determinar o efeito osteogênico de peptídeos nas células in vitro. As células foram tratadas com peptídeos L7 e R1 para determinar as mudanças na morfologia celular e expressão gênica. No dia 4, as células começaram a se agregar, e os agregados alargada com o tempo a formar nódulos, um padrão de comportamento de células semelhantes às células ósseas em cultura (Figura 2).

A adição de peptídeo L7 ou R1 para a coloração de células maior das culturas com von Kossa. As células foram então tratadas com diferentes concentrações de peptídeo L7 ou R1 para até 16 dias em cultura. Determinou-se que 5 peptídeo nM foi mais eficaz in vitro. Atividade da fosfatase alcalina nas culturas que foram tratados com peptídeo aumentou de entre 2 e 3,5 vezes. O aumento vezes dependia da concentração de peptídeo eo tempo de tratamento em cultura.

PCR em tempo real

Células tratadas com L7 e peptídeos R1 foram analisados ​​usando Real-Time PCR para a expressão de genes para dois conhecidos fatores de células ósseas de transcrição (Osterix e Runx2) e três proteínas da matriz óssea (osso sialoproteína, osteocalcina e colágeno tipo I). Tratamento com R1 apresentaram aumentos em Osterix e expressão gênica Runx2. Colágeno tipo de expressão gênica 1 permaneceu inalterado. Tratamento com L7 mostrou um aumento no BSP e osteocalcina expressão gênica, bem como expressão do gene do colágeno tipo I. Isso demonstra que ambos os peptídeos têm um efeito sobre os genes que estão relacionados com o aparecimento e progressão da osteogênese em culturas de células mesenquimais.

O tratamento dos em culturas de células in vitro com o R1 peptídeos e L7 revelou um efeito anabólico relacionadas com a formação óssea usando células mesenquimais. Um aumento na proporção de osteoprotegerina para RANKL indica uma diminuição no recrutamento das células ósseas reabsorção que são conhecidas como osteoclastos. Tratamento das células com os peptídeos também leva a um aumento na expressão de genes que estão associados com a formação óssea e diminui os fatores que inibem a osteogênese.

Histologia

Para determinar a quantidade de osso, foram expostas as fatias de osso à luz μLtraviolet produzindo autofluorescência. Isso proporciona maior contraste entre osso e osso não-tecidos para fins de quantificação ^2. As seções foram fotografadas usando tanto de campo claro e luz UV (Figura 3) uma Nikon e luz UV por um sistema de imagem digital da Nikon com a mesma ampliação (x10 objetivo). As imagens digitais resultantes foram analisados ​​com Metavue software de imagem (dispositivos Molecular). Nós escolhemos uma região, fixa retangular de interesse (ROI) que continham o defeito de 8 mm unicorticais. O local da lesão foi sempre representado dentro deste ROI manualmente colocando a caixa na posição correta em cada imagem. Os pixels H & E-positivos foram parcialmente automatizados usando a ferramenta varinha mágica para definir uma tolerância de cor. Esta configuração de tolerância resultou em pixels destaque com uma gama de verdes que correspondia exatamente com a aparência histológica do tecido ósseo na H & E-corados. O número total de H & E-positivos pixels para cada seção foi gravado. A contagem de pixels de seções individuais foram calculados para cada amostra tibial e as diferenças dentro e entre os grupos de tratamento foram calculados com base nessas médias. As áreas para todas as amostras foram então comparados com base na quantidade de osso cortical novas (Figura 4).

A presença de osso nas seções foi quantificada para determinar a reparação óssea nos defeitos tratados com gelfoam peptídeo + em comparação com gelfoam sozinho. Defeitos que foram preenchidos com gelfoam + R1 peptídeo mostrou a maior quantidade de reparo cortical com a 10, 7 e aumento de 2 vezes em 3, 5, 12 semanas, respectivamente. As diferenças na reparação óssea cortical na gelfoam + peptídeo comparação com gelfoam só foram mais perceptíveis aos 3 e 5 semanas, demonstrando que o peptídeo promove a regeneração óssea cortical (Figura 5).

10. Efeito anabólico da Peptídeos Osteogênica

A relação de OPG / RANKL é maior do que a proporção RANKL / OPG, o que sugere que os peptídeos podem ter um efeito direto sobre os osteoblastos e regular a reabsorção óssea.

Peptídeos sintéticos podem ter vantagens sobre moléculas maiores, como a velocidade de preparação, a estabilidade molecular, vida útil longa e aplicações potencialmente terapêuticas. Progressos significativos foram feitos na tentativa de modular a perda óssea e regeneração por citocinas controle e fatores de crescimento. Estes peptídeos osteotropic pode oferecer alternativas atraentes para as terapias existentes que estimulam o anabolismo ósseo e regeneração óssea.

Figura 1. Peptide ligação a medula óssea em rato e secção de tecido costela in vitro.

Figura 2. Células mesenquimais (D1) formar nódulos após o tratamento peptídeo.

Figura 3. Histologia da reparação óssea utilizando peptídeos osteogênico, L7 e R1.

Seções óssea Figura 4. Corados com H & E sob a luz UV que causa autofluorescência. Isso proporciona maior contraste entre osso e osso não-tecidos para fins de quantificação.

Figura 5. Quantitativa de osso nas seções histologia mostrou a maior quantidade de reparo cortical foi em 5 semanas, comuma mudança de 10 vezes, 7 e 2 vezes em 3 e 5 semanas, demonstrando que o peptídeo promove a regeneração óssea cortical.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S