Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

Published: November 24, 2010 doi: 10.3791/2363
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University

Summary

ووصف الطرق لاستخدام نظم الفيروسة الألفاوية transducing صحفيين للتعبير عن فلوري في التجارب المختبرية والبعوض البالغ. ويمكن تكييف هذه التقنية للتعبير عن أي مصلحة من البروتين بدلا من أو بالإضافة إلى أحد الصحفيين.

Abstract

الفيروسة الألفاوية نظم transducing (ATSs) هي أدوات مهمة للتعبير عن الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) خلال العدوى. وتستمد من استنساخ [كدنا] ATSs من الفيروسات التي تنتقل عن طريق البعوض الحمض النووي الريبي (جنس الفيروسة الألفاوية ؛ عائلة الفيروسات الطخائية). جنس الفيروسة الألفاوية يحتوي على حوالي 30 نوعا مختلفا فيروس ينقله البعوض. Alphaviruses هي فيروسات يلفها واحدة تحتوي على الحمض النووي الريبي الجينوم الذين تقطعت بهم السبل (~ 11.7 كيلو بايت). Alphaviruses تدوين a مرنا subgenomic التي بترميز البروتينات الهيكلية للفيروس اللازمة لEncapsidation للجينوم ونضوج الفيروس. وعادة ما تكون Alphaviruses lytic عالية في خلايا الفقاريات ، ولكن بإصرار تصيب الخلايا البعوض عرضة الباثولوجيا الخلوية مع الحد الأدنى. هذه الصفات تجعلها أدوات ممتازة للتعبير الجينات في البعوض الناقل. تستمد ATSs الأكثر شيوعا في الاستخدام من فيروس سندبيس (SINV). واسعة من الأنواع tropism SINV يسمح للعدوى من cells8 الحشرات ، والطيور ، والثدييات. ومع ذلك ، فقد استمدت من ATSs alphaviruses 9،10،20 الأخرى أيضا. يرصد الأجنبية التعبير الجيني ممكن عن طريق إدخال إضافي موقع subgenomic الفيروسي RNA أو الشروع المروج. يستخدم ATSs التي يتم وضع تسلسل الجينات الخارجية 5 'إلى الجينات الهيكلية للتعبير البروتين الفيروسي مستقرة في الحشرات. يستخدم ATSs ، الذي يتوضع على تسلسل الجين 3 'إلى الجينات الهيكلية ، لتحريك ورني الصمت تعبيرا عن هذا الجين في الحشرات.

وقد أثبتت ATSs إلى أن تكون أدوات قيمة لفهم التفاعلات ناقلات الممرض ، وتفاصيل الجزيئي للتكاثر الفيروس ودورات الصيانة 3،4،11،19،21 المعدية. على وجه الخصوص ، وقد تم التعبير عن صحفيين الفلورسنت وbioluminescent مفيدة تتبع عدوى فيروسية في انتقال الفيروس وناقلات 5،14-16،18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد وصفت الاستجابة المناعية باستخدام ناقلات سلالتين من SINV هندسيا للتعبير عن 2،9 GFP.

هنا ، فإننا نقدم وسيلة لإنتاج SINV تحتوي مراسل فلوري (GFP) من استنساخ [كدنا] المعدية. هو كتب المعدية ، وكامل طول الحمض النووي الريبي من استنساخ [كدنا] الخطي. هو عرض المعدية RNA في الخلايا المستهدفة المتساهلة التي electroporation. خلايا Transfected توليد جزيئات الفيروس المعدية معربا عن الحكومة العراقية. ويستخدم الفيروس ليصيب البعوض تحصد ، كما هو موضح هنا ، أو الأنواع المضيفة الأخرى (لا يظهر هنا). ويتم تقييم الكفاءة عن طريق الكشف عن ناقلات مضان خارج المعى المتوسط ​​أو عن طريق انتقال الفيروس رصد 7. استخدام مراسل الفلورسنت كما يسمح للحكومة العراقية لتقدير ملاءمة لانتشار الفيروس في جميع أنحاء ثقافة الخلية ، لتحديد معدل نشر ، والعدوى في البعوض المكشوفة ، وانتقال الفيروس من البعوض ، ويوفر مقياسا السريع المتجه من الكفاءة.

Protocol

يتم كتابة بروتوكول التالية للإنتاج واستخدام المنشطات من الفيروس استنادا سندبيس MRE16. تم تصميم للتعبير عن المنشطات في GFP بعوض الزاعجة ناقلات البعوض. [كدنا] يستنسخ المعدية عدد من alphaviruses (سندبيس الفيروس شيكونغونيا الفيروس ، أونيونغ - نيونغ الفيروس ، فيروس التهاب الدماغ الخيلي الغربي) المتوفرة حاليا التي تم تصميمها كما انها المنشطات (الجدول 1). للحصول على أفضل النتائج هو تضخيم الحمض النووي البلازميد في البكتيريا مثل البكتيريا المختصة شور (Stratagene / اجيلنت تكنولوجيز) لتجنب إعادة التركيب غير المرغوب فيه وفقدان [كدنا] الفيروسية. جميع البلازميدات استنساخ المعدية يملك T7 عاثية أو مروج SP6 في 5 فوري "نهاية [كدنا] الفيروسية لنسخ من الحمض النووي الريبي الجينوم كامل طول وتقييد نوكلياز داخلية فريدة من نوعها في 3' نهاية لجريان النسخ. لكل المنشطات ، يجب على المستخدمين على استخدام الحمض النووي الريبي عاثية المناسبة تعتمد بوليميريز نوكلياز داخلية وفريدة من نوعها لتقييد النسخ في المختبر للجينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي.

1. جيل من الحمض النووي الريبي المعدية من استنساخ [كدنا].

  1. يصبح خطي لل5μg من استنساخ المعدية البلازميد (p5'dsMRE16 / GFP) مع 20 وحدة من إنزيم تقييد XhoI في تفاعل 100 ميكرولتر. لاحتضان 3H - 2 في 37 درجة مئوية
  2. تنقية باستخدام الحمض النووي خطي Qiagen QIAprep سبين Miniprep أدوات تنقية بروتوكول بديل ، يبلغ حجمه من الحمض النووي من عمود الدوران باستخدام 50 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه. وينبغي أن يكون تركيز البلازميد حوالي 1،0 ميكروغرام / ميكرولتر.
  3. في ريبونوكلياز خالية من 0.2 مل أنبوب PCR ، انشاء 50 ميكرولتر رد فعل النسخ باستخدام Ambion MAXIscript كيت في البروتوكول على النحو التالي.
    • 22.5 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية درهم 2 O
      • 5.0 ميكرولتر قالب DNA خطي (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر)
      • 2.5 ميكرولتر 10MM ATP
      • 2.5 ميكرولتر 10MM CTP
      • 2.5 ميكرولتر 10MM UTP
      • 2.5 ميكرولتر 1MM GTP
      • 2.5 ميكرولتر 10MM غطاء تمثيلي (م 7 G (5 ') PPP (5') G)
      • 5.0 ميكرولتر العازلة النسخ 10X
      • T7 5.0 ميكرولتر أو SP6 مزيج بوليميريز
    • المجموع 50.0 ميكرولتر
  4. احتضان تفاعل النسخ لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. بعد مرور فترة الحضانة ، يجب أن يستخدم على الفور الحصول على رد فعل من electroporation BHK - 21 الخلايا. وينبغي التحضير للخلايا BHK - 21 لelectroporation تبدأ خلال تفاعل النسخ الحضانة.

2. جيل من الفيروسات المعدية من الحمض النووي الريبي

  1. يعرض للتريبسين two 70-80 ٪ متموجة 150 سم 2 (T - 150) قارورة BHK - 21 في الخلايا المنشطات.
  2. نقل كافة الخلايا إلى 15 مليلتر أنبوب الطرد المركزي المخروطية.
  3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 2000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة ، 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة التقليدية.
  4. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة دون المغنيسيوم والكالسيوم + + + +. كرر الخطوات من 2.3 و 2.4 حتى يتم غسلها الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. Resuspend على مكعبات الخلايا التي تحتوي على 0.5 مل MEM 10 ٪ FBS.
  6. تمييع 10 خلايا ميكرولتر مع 90 ميكرولتر MEM مع FBS 10 ٪ والاعتماد على عدادة الكريات. إذا لزم الأمر ، إلى إضعاف الخلايا خلايا 2،5-12،5 7 × 10 / مل مع MEM تحتوي على 10 ٪ FBS.
  7. على الجليد الباردة 0.2 سم كفيت electroporation ، إضافة تعليق 400 خلية و 20 ميكرولتر رد فعل النسخ ميكرولتر. يمسح التكثيف من كفيت.
  8. نبض كفيت مرتين : 450V ، 1200Ω ، 150 μF. نستخدم مناور الخلية الكهربائية ، جامعة هارفارد جهاز ECM630 النموذجي.
  9. وضع محتويات كفيت الى 25 سم 2 الأنسجة قارورة تحتوي على 5 مل الثقافة MEM مع FBS 10 ٪.
  10. احتضان قارورة (ق) في 37C مع 5 ٪ CO 2.
  11. رصد إصابة يوميا باستخدام مجهر مقلوب الفلورسنت مع مجموعة التصفية المناسب (على سبيل المثال GFP التصفية : الطول الموجي الإثارة = 460-490 نانومتر ، والانبعاثات الطول الموجي = 510-550 نانومتر ، أو dsRed التصفية : الطول الموجي الإثارة = 460-560 نانومتر ، والانبعاثات الطول الموجي => 590 نانومتر).
  12. عندما يوحي مضان العدوى متموجة و / أو مرئيا في جميع أنحاء CPE القارورة ، وجمع محتويات القارورة ، إضافة 30 ٪ FBS ، قسامة عند الاقتضاء ، وتخزينها في -80 درجة مئوية. إذا رغبت في ذلك ، قد يتم مسح lysates الخلايا بواسطة الطرد المركزي (2000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة ، 4 درجات مئوية) قبل إضافة FBS.
  13. فيروس مرور ما لا يقل عن مرة واحدة خلال قارورة جديدة من الخلايا لزيادة عيار الفيروس لاحقة المقايسات تغذية الدم.

3. لكل السراج العدوى من البعوض

  1. مزيج معا في الدم (دي شراؤها عادة fibrinated الدم الغنم) وخلية ثقافة تعليق فيروس المستمدة من الخطوة 2.13. نهائي عيار الفيروس في الدم وجبة ينبغي عادة ~ 1x10 7 وحدات اللوحة تشكيل (pfu) / مل للعدوى المعي المتوسط ​​الفعال للبعوض. ويمكن لتحفيز البعوض إلى التهم ، الأدينوساين 5' - ثلاثي الفوسفات (ATP) يمكن ان تضاف الى تركيز 0.02M النهائي.
  2. قد البعوضيجب أن تكون محروم من الماء والسكر قبل الاصابة لتحفيز لهم لتغذية الدم بكفاءة من التغذية الاصطناعية. وينبغي أن مدة الحرمان المقررة من قبل للحد من وفيات. وسوف تعتمد على الأنواع مرات البعوض ، والرطوبة وغير ذلك. insectary كنقطة انطلاق ، وإزالة 24H 12H السكر والماء قبل الغذاء. هذا البروتوكول يستخدم المياه تغلف الزجاج feeders17 مع تعميم المياه 37 درجة مئوية. يتم وضع غشاء الأمعاء الخنازير (أي غسلها جيدا السجق الغلاف المتوفرة في معظم محلات البقالة) عبر الفم من وحدة التغذية وpipetted وجبة في الغرفة. تصاميم مختلفة ، والأغشية والبروتوكولات غير متوفرة للأنواع النواقل المختلفة.
  3. يتم فرز البعوض لتحديد فقط تلك البعوض محتقن بالدم. يتم نقل البعوض محتقن على الكرتون مع الأورجانزا على أعلى ويتم تحضين البعوض عند 28 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية 75-80 ٪ حتى المجهزة للتعبير GFP.

4. داخل الصدر تلقيح البعوض

التلقيح داخل الصدر وسيلة بديلة للاصابة المفصلية. ويستخدم هذا الأسلوب عندما لا يطلب نشرها من خلال المعى المتوسط. (الموصوفة أدناه ولكن الأسلوب لا يظهر الأسلوب في هذه التجربة البصرية).

  1. غير أن يستنشق عدد صغير من البعوض (5-10) من أقفاص عقد في أنابيب بلاستيكية القابضة. سيتم وضع أنابيب مغلقة عقد في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة إلى فتور في البعوض.
  2. سيسفك 2 5 البعوض من الأنبوب على طبق بتري زجاجي يستريح على الجليد. وضع غطاء على طبق بيتري عندما لا تكون قيد الاستعمال أو إذا كان البعوض تبدأ في التحرك. أثناء التعامل مع البعوض ، لا بد من الحرص على العد وتتبع عدد من البعوض يجري التلاعب بها. كما انسكبت البعوض على الطاولة البرد ، وسوف يتم تسجيل العدد الكلي في عداد المختبر.
  3. مستعدة الإبرة ذوبان الأنابيب الشعرية Nanoject باستخدام الزجاج محددة ومجتذب الإبرة.
  4. الإعداد الثاني Nanoject microinjector في إرشادات الشركة المصنعة لتسليم قيحة NL 69. يجب توخي الحرص عند رسم قيحة في إبرة بحيث لا تلف الإبرة.
  5. باستخدام مجهر تشريح ، تضاف إبرة في الصدر من البعوض وتفعيل Nanoject للتلقيح. يجب توخي الحرص عند تلقيح البعوض بحيث لا تخترق إبرة تماما البعوض والخروج من الجانب الآخر ، مما أدى إلى وفاة لاحقة من البعوض. التحقق من كل البعوض للتأكد من أن اللقاح دخلت قبل إزالته من الإبرة.
  6. بعد التلقيح ، في حين لا يزال مخوزق البعوض على الإبرة ، وضعه في علبة ورقة الضغط من خلال ثقب صغير في الجانب الذي يتم وصله مع القطن أو سدادة الفلين في كل الأوقات الأخرى.
  7. عندما يلقح البعوض ووضعها في الكرتون (تصل إلى حوالي 50 في الكرتون) ، بعناية الشريط الفلين في المكان لمنع إطلاق عرضي من البعوض. وضع صناديق في عقد بن آمنة قبل حضانة أخرى في insectary على 28 درجة مئوية الرطوبة و 80 ٪ نسبي.

5. العدوى رصد البعوض

  1. وضع ورقة كرتون عقد في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا لشل حركة البعوض.
  2. نقل عدد قليل من البعوض (5-10 في وقت واحد) إلى جدول برودة تكييفها للاستخدام على المجهر الفلورسنت.
  3. فحص وفرز البعوض على أساس وجود أو غياب مضان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفلورسنت قياس كثافة وكمي وكيل للعدوى. البعوض الأنسجة مثل midguts والغدد اللعابية ، يمكن تشريح الجسم من الدهون ومراقبتها لمضان.
  4. إذا كان ذلك مناسبا ، وعودة البعوض المحدد إلى ورقة كرتون على مواصلة احتضان البعوض المصابة.

6. الفحص انتقال (سيلان اللعاب القسري لإظهار انتقال الفيروس)

  1. حرمان البعوض مصدر السكر لمدة 24 ساعة قبل الأعلاف.
  2. إزالة الأرجل والأجنحة
  3. لأنبوب شعري 50 ميكرولتر الذي تم تسخينه ، وسحبت ومقصوص في نهاية واحدة ، إضافة 3-5 ميكرولتر من نوع B Cargille النفط الغمر أو 10 ٪ سكروز المصل الحل.
  4. إدراج خرطوم في الأنبوب. اذا كنت تستخدم النفط ، سوف ينظر إلى قطرات من لعاب تحلب من خرطوم. ويمكن تطبيق واحد ميكرولتر حل pilocarbine 1 ٪ في برنامج تلفزيوني و 0.1 ٪ توين 80 إلى الصدر لتحفيز.
  5. بعد 60-90 دقيقة ، وإزالة البعوض ومخزن للعزل الفيروس إذا لزم الأمر.
  6. إزالة الحل من الأنبوب بواسطة الطرد المركزي في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر 20 ٪ FBS - PBS.
  7. تصفية عقيمة قيحة من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون ثم استخدام تصفية قيحة لتصيب الخلايا المستزرعة.

الأحيائية ملاحظة : يصف هذا البروتوكولطريقة لتوليد ، وتحديد ورصد البعوض المصابة. بناء على المرافق الخاصة بك (أي جدول البرد ، منشأة الاحتواء ، الخ) ، والموافقة IBC ، قد تكون محدودة لك لدراستها إلا بعد إزالة الأجنحة والأرجل لمنعه من الهرب. يمكن أن تتولد SINV مقرها المنشطات واستخدامها في بيئة BSL2. وسوف يعتمد على استخدام المنشطات alphaviruses أخرى مثل فيروس شيكونغونيا أو فيروسات التهاب الدماغ الخيلي الغربي تتطلب BSL3 المرافق.

7. ممثل النتائج

ويظهر لمحة عامة عن التعبير عن الجينات علامة (GFP) باستخدام 5'dsMRE16 ATS / GFP في الشكل 1. ويظهر التعبير عن GFP في BHK - 21 وC6/36 (الزاعجة المنقطة بالأبيض) الخلايا في الشكل 2 في أوقات محددة بعد العدوى من الخلايا مع 5'dsMRE16 / GFP الفيروس عند 0.01 تعدد العدوى. الشكل 3 لمحة عامة عن عدوى فيروس الفيروسة الألفاوية والمنشطات في البعوض عندما يتم تسليم هذا الفيروس عن طريق العدوى وجبة الدم. ويبين الشكل 4 إعداد وجبة الدم مع ~ pfu 7 10 / مل من فيروس ATS تليها العدوى عن طريق الفم للبعوض الزاعجة. عرض كامل الجسم من البعوض المصابة وأجزاء الجسم المحدد ب 10 يوما آخر عدوى باستخدام المجهر epifluorescence (الشكل 5). وكشف GFP dsRED في midguts البعوض المصابة بعد العدوى بفيروسات 5'dsMRE16 معربا عن المنشطات في كل الجينات علامة فلوري (الشكل 6). مقايسة انتقال البعوض باستخدام المصابين بفيروس ATS 5'dsMRE16 / GFP (الشكل 7).

الجدول 1. هندسيا في الوقت الحاضر للتعبير عن المنشطات الجينات في البعوض.

 
الفيروسة الألفاوية 		المنشطات بعوض مرجع
فيروس سندبيس TE / 3'2J وTE / 5'2J الزاعجة المصرية 12
Ochlerotatus triseriatus 13
و3'dsMRE16
5'dsMRE16 		ألف بعوض 5
الباعضة tritaeniorhynchus 5
5'dsTR339 ألف AEG ypti 2
فيروس شيكونغونيا و3'dsCHIKV
5'dsCHIKV 		ألف بعوض / A. المنقطة بالأبيض 20
أونيونغ نيونغ الفيروس 5'dsONNV الأنوفيلة الغامبية 1،9
فيروس التهاب الدماغ الخيلي الغربي 5'dsWEEV. ماكميلان الباعضة الرسغاء Stauft وآخرون ، غير منشورة

الجدول 2. مزايا / عيوب استخدام المنشطات لللتعبير الجينات في البعوض.

المزايا :
سرعة الانتاج العالية عيار الفيروس
واسعة النطاق المضيف (SINV)
ارتفاع معدل تكرار الحمض النووي الريبي
مستويات عالية من التحوير التعبير
النسبية سهولة التلاعب الجينات
مستقرة ، والتعبير الجيني المستمر في الحشرات
الحد الأدنى من أمراض في الحشرات
العيوب :
على المدى القصير وضع التعبير في خلايا الفقاريات
الاعتلال الخلوي تأثيرات قوية على خلايا الفقاريات
حجم القيود الجين (<1KB ، من الناحية المثالية)
تتطلب بعض alphaviruses BSL3 الاحتواء

الشكل 1
الشكل 1 : نظرة عامة على إنتاج الفيروس في الخلايا ATS - 21 BHK باستخدام p5'dsMRE / GFP SINV GFP الإعراب. النسخ التالية في المختبر ، هو electroporated الجيني في خلايا الحمض النووي الريبي ATS - 21 BHK حيث تم انقاذ الفيروس. ويمكن بعد ذلك أن الفيروس يمكن استخدام المنشطات لإصابة البعوض. SGP = subgenomic المروج. وكتب ثلاثة أنواع المنشطات RNA في سلليرة سورية ، والجينوم ، subgenomic 1 و 2 subgenomic الرناوات. C (قفيصة) ، ويتم تجميعها E2 E1 جليكوبروتينات مع الجينوم المنشطات لتوليد فيروس المعدية.

الشكل 2
الشكل 2 : التعبير عن GFP في البعوض (C6/36) الخلايا بعد الإصابة بفيروس 5'dsMRE16 / GFP SINV.

الشكل 3
الشكل 3 : نظرة عامة على وجود عدوى فيروس المنشطات في البعوض مما يؤدي إلى انتقال الفيروس.

الشكل 4
الشكل 4 : ATS SINV 5'dsMRE16 العدوى عن طريق تعريض البعوض لمعدية وجبة الدم.

الشكل 5
الشكل 5 : ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP العدوى بنسبة 10 إصابة آخر أيام. الكشف عن كامل جسم GFP تبين أن الفيروس قد نجا من المعي المتوسط ​​وتوزيعها على الأنسجة الثانوية. ويبين الشكل أيضا التعبير GFP في أجزاء الجسم المحددة التي هي أيضا مؤشرا على إصابة نشرها.

الشكل 6
الشكل 6 : ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP و5'dsMRE16 / العدوى من dsRED midguts في أوقات محددة بعد العدوى. Midguts وعادة ما يكون متميزا بؤر العدوى في وقت مبكر بعد تناول وجبة فيروس في الدم التي تحتوي على أن ينتشر في جميع أنحاء المعي المتوسط ​​الخلفي في أوقات لاحقة بعد العدوى.

الشكل 7
الشكل 7 : الكشف عن المنشطات 5'dsMRE16 / في لعاب البعوض GFP في أقرب وقت 8 عدوى آخر أيام. ويهدف الفحص لاظهار انتقال الفيروس من المنشطات ، ويبين أن فيروس 5'dsMRE16 / GFP يستطيعون التعبير عن ستابلي GFP طوال فترة حضانة خارجي في البعوض. اللوحة اليسرى يظهر البعوض الترويل في أنبوب شعري ، لوحة مركز معارض C6/36 الخلايا المصابة مع اللعاب في 1 اليوم واللوحة اليمنى 3 إصابة آخر أيام.

Discussion

قدم هنا طرق تمكين الباحثين من متابعة إصابة الألفاوية في الثقافة خلية البعوض والحشرات البالغات. وفيما يلي موجز لمزايا ومساوئ استخدام الفيروسات المنشطات في الجدول 2. يمكن أن يكون استنساخ ATS المعدية التلاعب وراثيا للتعبير عن أي الحكومة الإسرائيلية والتي استخدمت للتعبير عن الأضداد سلسلة واحدة ، من المكثفات رني ، الرناوات العقاقير استهداف الجينات الذاتية ، والبروتينات الموالية لأفكارك. إذا لم يتم استخدام مراسلة ، ثم جزء من التصوير هذه الطريقة ليست ذات الصلة. ومع ذلك ، فإن العديد من البروتوكولات ذاتها ضرورية لانقاذ فيروس المنشطات ، ونشر ، والعدوى من البعوض. هناك قيود في حجم القصوى من التحوير عند إدراجها في نظام الألفاوية transducing. المعوقات تختلف تبعا لحجم السلالة الأبوية المستخدمة لتوليد المنشطات ، ولكن عادة ما تكون حول 1KB على الرغم من استخدام الجينات أكبر مراسل luciferase مثل يراعة في بناء المنشطات لاستخدامها في البعوض. وينبغي أن مختبرات الأبحاث مع مبلغ متواضع من الفيروسات الخلفية تكون قادرة على استخدام المنشطات عقب هذه البروتوكولات. وقد قام عدد من المختبرات البحثية بالفعل باستخدام SINV القائم على المنشطات و.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH R01 AI46435) وRMRCE (NIH AI065357).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
MAXIscript Kit Ambion AB1312 Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.
Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) Ambion AM8050
Nanoject II nanoliter injector Drummond Scientific 3-000-204
Electro Cell Manipulator Harvard Apparatus ECM 630

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brault, A. C. Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).
  2. Campbell, C. L. Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection. BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).
  3. Cirimotich, C. M. Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes. BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).
  4. Capurro, deL. ara, M, Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).
  5. Foy, B. D. Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species. Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).
  6. Foy, B. D., Olson, K. E. Alphavirus transducing systems. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).
  7. Franz, A. W. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).
  8. Hahn, C. S. Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).
  9. Keene, K. M. RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).
  10. Lundstrom, K. Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors. Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).
  11. Myles, K. M. Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).
  12. Olson, K. E. Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes. Science. 272, 884-884 (1996).
  13. Olson, K. E. The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus. Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).
  14. Olson, K. E. Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection. Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).
  15. Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. A haemocyte tropism for an arbovirus. J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).
  16. Pierro, D. J. Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).
  17. Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosq. News. 24, 407-407 (1964).
  18. Sanders, H. R. Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).
  19. Uhlirova, M. Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).
  20. Vanlandingham, D. L. Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).
  21. Wang, H. Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells. J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).

Tags

الأمراض المعدية ، العدد 45 ، الفيروسة الألفاوية ، المفصلية ، والبعوض ، bloodmeal ، مراسل ، والتصوير
نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, A., Mossel, E.,… More

Phillips, A., Mossel, E., Sanchez-Vargas, I., Foy, B., Olson, K. Alphavirus Transducing System: Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2363, doi:10.3791/2363 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter