Summary
Metodi di impiego di sistemi di trasduzione alfavirus esprimere reporter fluorescente in vitro e in zanzare adulte sono descritti. Questa tecnica può essere adattato per esprimere qualsiasi proteina di interesse in sostituzione o in aggiunta ad un giornalista.
Abstract
Alfavirus sistemi di trasduzione (ATS) sono strumenti importanti per esprimere geni di interesse (GOI) durante l'infezione. ATS sono derivati da cloni di cDNA trasmessa dalle zanzare virus a RNA (alfavirus genere; famiglia togaviridae). Il genere alfavirus contiene circa 30 diverse specie di zanzare virus. Alphaviruses sono virus con involucro e contengono genomi a singolo filamento di RNA (~ 11,7 Kb). Alphaviruses trascrivere un mRNA subgenomic che codifica le proteine strutturali del virus necessario per incapsidazione del genoma e la maturazione del virus. Alphaviruses sono di solito molto litiche nelle cellule dei vertebrati, ma persistente infettare le cellule suscettibili zanzara con un minimo citopatologia. Queste caratteristiche li rendono ottimi strumenti per l'espressione genica in vettori di zanzara. L'ATS più comuni in uso sono derivati da virus Sindbis (SINV). Il tropismo specie gamma di SINV permette di infezione di insetti, uccelli e mammiferi cells8. Tuttavia, ATS sono state derivate da alphaviruses anche altri 9,10,20. L'espressione genica degli Esteri è reso possibile mediante l'inserimento di un ulteriore sito virale subgenomic iniziazione RNA o promotore. ATS in cui è posizionata una sequenza del gene esogeno 5 'al geni virali strutturali viene utilizzata per l'espressione della proteina stabile negli insetti. ATS, in cui è posizionata una sequenza di geni 3 'ai geni strutturali, è utilizzato per attivare l'espressione RNAi e nel silenzio di quel gene in insetti.
ATS hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per la comprensione vettore-patogeno interazioni, i dettagli molecolari di replicazione virale e cicli di manutenzione infettive 3,4,11,19,21. In particolare, l'espressione di giornalisti fluorescenti e bioluminescenti è stato determinante per il tracciamento della infezione virale a trasmissione vettoriale e virus 5,14-16,18. Inoltre, il vettore risposta immunitaria è stata descritta utilizzando due ceppi di SINV progettati per esprimere GFP 2,9.
Qui, vi presentiamo un metodo per la produzione di SINV contenente un reporter fluorescente (GFP) dal clone cDNA infettive. Infettive, full-length RNA trascritto dal clone linearizzato cDNA. Infettive RNA è introdotta all'interno delle cellule bersaglio permissivo mediante elettroporazione. Cellule transfettate generare particelle virali infettive esprimere il governo indiano. Virus raccolto viene utilizzato per infettare le zanzare, come descritto qui, o altre specie ospite (non mostrata qui). Competenza Vector è valutato rilevando fluorescenza al di fuori del midgut o dalla trasmissione di monitoraggio del virus 7. L'uso di un reporter fluorescente come il governo indiano consente per la stima conveniente di diffusione del virus in tutto una coltura cellulare, per la determinazione del tasso di infezione, la diffusione di zanzare esposti, trasmissione del virus dalla zanzara e fornisce un indicatore rapido di competenza vettoriale.
Protocol
Il protocollo che segue è scritto per la produzione e l'uso di un ATS basato sul virus Sindbis MRE16. L'ATS è stato progettato per esprimere la GFP nel vettore zanzara Aedes aegypti. cDNA cloni infettive di un certo numero di alphaviruses (virus Sindbis, virus Chikungunya, O'nyong-nyong virus, virus dell'encefalite equina occidentale) sono attualmente disponibili che sono stati progettati come ATS (Tabella 1). Per ottenere i migliori risultati del DNA plasmidico è amplificato nei batteri come SURE batteri competenti (Stratagene / Agilent Technologies) per evitare indesiderati ricombinazione e la perdita del cDNA virale. Tutti i plasmidi clone infettive hanno un batteriofago T7 o SP6 promotore presso l'immediato 5 'del cDNA virale per la trascrizione del full-length RNA genomico e di una endonucleasi di restrizione unico al 3' per la trascrizione deflusso. Per ogni ATS, gli utenti devono utilizzare il DNA appropriato dipendente batteriofagi RNA polimerasi e endonucleasi di restrizione unico per la trascrizione in vitro del genoma virale RNA.
1. Generazione di RNA infettive da clone cDNA.
- Linearizzare il 5μg del clone infettivo plasmide (p5'dsMRE16 / GFP) con 20 unità di enzima di restrizione XhoI in una reazione a 100 ul. Incubare per 2-3h a 37 ° C
- Purificare il DNA linearizzato utilizzando Qiagen QIAprep Spin Miniprep protocollo di purificazione alternativi Kit, eluizione di DNA da Spin Column con 50 microlitri di acqua RNasi-free. Concentrazione plasmide dovrebbero essere circa 1,0 mcg / mL.
- In un RNasi-free tubo 0,2 ml PCR, set-up a 50 microlitri reazione di trascrizione utilizzando Ambion Kit MAXIscript per protocollo, come segue.
- 22,5 microlitri RNasi-free dH 2 O
- Modello 5,0 microlitri di DNA linearizzato (1,0 mg / mL)
- 2,5 microlitri 10mM ATP
- 2,5 microlitri 10mM CTP
- 2,5 microlitri 10mM UTP
- 2,5 microlitri 1 mM GTP
- 2,5 microlitri 10mM tappo analogico (m 7 G (5 ') ppp (5') G)
- 5,0 microlitri di buffer trascrizione 10X
- 5,0 microlitri T7 o SP6 mix polimerasi
- Totale 50,0 microlitri
- 22,5 microlitri RNasi-free dH 2 O
- Incubare la reazione di trascrizione per 1 ora a 37 ° C. Dopo l'incubazione, la reazione deve essere utilizzato immediatamente per l'elettroporazione di cellule BHK-21. Preparazione del cellule BHK-21 per l'elettroporazione dovrebbero iniziare durante la reazione di incubazione trascrizione.
2. Generazione di virus da RNA infettive
- Trypsinize due 70-80% confluenti 150 centimetri 2 (T-150) Pallone BHK-21 cellule per ATS.
- Trasferire tutte le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.
- Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in una centrifuga da tavolo tradizionali.
- Risospendere le cellule in PBS sterile senza Mg + + e Ca + +. Ripetere i passi 2.3 e 2.4 fino a quando le cellule sono state lavate tre volte con PBS.
- Risospendere il pellet cellule 0,5 ml di MEM contenente 10% FBS.
- Diluire 10 celle con 90 microlitri MEM microlitri con il 10% FBS e contare su un emocitometro. Se necessario, le cellule diluire a 2,5-12,5 x 10 7 cellule / ml con MEM contenente 10% FBS.
- Per un freddo ghiaccio 0,2 centimetri cuvetta elettroporazione, aggiungere 400 microlitri di sospensione cellulare e 20 microlitri reazione di trascrizione. Pulire condensa cuvetta.
- Pulse la cuvetta due volte: 450V, 1200Ω, 150 uF. Usiamo un manipolatore Electro Cell, Harvard Apparatus modello ECM630.
- Posizionare l'intero contenuto della cuvetta in un centimetro 25 2 fiasco di coltura contenente 5 ml di MEM con il 10% FBS.
- Pallone incubare (s) a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Monitorare l'infezione quotidiano utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con adeguate set di filtri (es. GFP filtro: lunghezza d'onda di eccitazione = 460-490 nm, emissione = lunghezza d'onda di 510-550 nm o DsRed filtro: lunghezza d'onda di eccitazione = 460-560 nm, emissione = lunghezza d'onda> 590 nm).
- Quando fluorescenza suggerisce infezione è confluenti e / o CPE è visibile in tutto il pallone, raccogliere il contenuto del flacone, aggiungere il 30% FBS, aliquota, se necessario, e conservare a -80 ° C. Se lo si desidera, lisati di cellule possono essere cancellati per centrifugazione (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) prima dell'aggiunta di FBS.
- Passaggio del virus almeno una volta attraverso un pallone nuovo di cellule per aumentare il titolo del virus per le analisi successive alimentazione sangue.
3. Per os infezione di zanzare
- Mescolare sangue (di solito acquistata de-fibrinated sangue di pecora) e coltura cellulare sospensione del virus derivato dal punto 2.13. Titolo finale del virus nel sangue pasto tipicamente dovrebbe essere ~ 1x10 7 unità placca formando (PFU) / mL per infezione midgut efficiente della zanzara. Per stimolare le zanzare a congestionare, adenosina 5'-trifosfato (ATP) può essere aggiunto a una concentrazione finale di 0.02M.
- Le zanzare possonodevono essere privato di acqua e zucchero prima dell'infezione per stimolarli ad alimentare in modo efficiente il sangue da un alimentatore artificiale. Durata della privazione dovrebbero essere stabiliti in precedenza per ridurre al minimo la mortalità. Tempi dipenderanno specie di zanzare, l'umidità del ecc insectary Come punto di partenza, togliere 24h 12h zucchero e acqua prima al feed. Questo protocollo utilizza l'acqua con camicia in vetro feeders17 con circolare acqua a 37 ° C. Una membrana intestinale suina (cioè lavati a fondo salsiccia involucro disponibile nei negozi di alimentari più) viene posto sulla bocca di alimentazione e il pasto è pipettato nella camera. Vari disegni, membrane e protocolli sono disponibili per i tipi di vettori differenti.
- Le zanzare sono ordinati per selezionare solo quelle zanzare gonfio di sangue. Engorged zanzare vengono trasferiti in un cartone con organza sulla parte superiore e le zanzare sono incubate a 28 ° C, il 75-80% di umidità relativa fino trattati per l'espressione della GFP.
4. Inoculazione intratoracica delle zanzare
Inoculazione intratoracica è un metodo alternativo per infettare il artropodi. Questo metodo viene utilizzato quando la divulgazione attraverso il midgut non è necessaria. (Metodo descritto di seguito, ma la tecnica non viene mostrato in questo esperimento visivo).
- Un piccolo numero di zanzare (5-10) viene aspirato dalle gabbie un'azienda nella tubi di plastica in mano. I tubi sigillati tenendo verranno messi a 4 ° C per 15 minuti per raffreddare le zanzare.
- 2 5 zanzare sarà versato dal tubo su un piatto di vetro Petri poggia su ghiaccio. Mettere il coperchio sulla piastra Petri quando non in uso o se le zanzare cominciano a muoversi. Durante la movimentazione delle zanzare, è necessario prestare attenzione a contare e tenere traccia del numero di zanzare viene manipolato. Come le zanzare sono rovesciato sul tavolo freddo, il numero totale sarà registrato su un bancone di laboratorio.
- L'ago viene preparato sciogliendo tubo capillare di vetro utilizzando specifici Nanoject e un estrattore ago.
- Impostare il Nanoject II microinjector secondo le istruzioni del produttore per la consegna di 69 nL inoculo. La cura deve essere esercitata quando l'inoculo nel disegno l'ago in modo che l'ago non sia danneggiato.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, inserire l'ago nel torace della zanzara e attivare il Nanoject per l'inoculazione. La cura deve essere esercitata quando inoculare le zanzare in modo che l'ago non penetra completamente la zanzara e uscire dall'altra parte, provocando la successiva morte della zanzara. Controllare ogni zanzara per essere sicuri che l'inoculo è entrato prima di rimuoverla dal ago.
- Dopo l'inoculazione, mentre la zanzara è ancora impalato sul ferro, è posto in una scatola di carta di partecipazione mediante un piccolo foro nel fianco che è collegato con cotone o un tappo di sughero in tutti gli altri.
- Quando le zanzare hanno inoculato e messo in cartone (fino a circa il 50 per scatola), con attenzione nastro il tappo in atto per evitare il rilascio accidentale delle zanzare. Posizionare i cartoni in un bidone presa sicura prima di incubazione ulteriormente nel insectary a 28 ° C e 80% di umidità relativa.
5. Infezione monitoraggio delle zanzare
- Posizionare la scatola di carta mantenimento a 4 ° C per circa 15 minuti per immobilizzare le zanzare.
- Trasferire un piccolo numero di zanzare (5-10 alla volta) a un tavolo freddo adattati per essere utilizzati su un microscopio a fluorescenza.
- Esaminare e ordinare le zanzare in base alla presenza o assenza di fluorescenza. Inoltre, fluorescente di intensità può essere utilizzato come una misura quantitativa procura di infezione. Tessuti zanzara come midguts, ghiandole salivari, di grasso corporeo può essere sezionato e monitorati per fluorescenza.
- Se del caso, il ritorno zanzare selezionati al cartone carta per continuare l'incubazione di zanzare infette.
6. Trasmissione Assay (salivazione Costretto a dimostrare la trasmissione del virus)
- Privare le zanzare di fonte zucchero per 24 ore prima da sfamare.
- Rimuovere le gambe e le ali
- Per un tubo di 50 microlitri capillare che è stato riscaldato, tirato e tagliato ad una estremità, aggiungere 3-5 ml di olio di immersione Cargille tipo B o 10% di siero-soluzione di saccarosio.
- Inserire la proboscide nel tubo. Se si utilizza l'olio, le goccioline di saliva si vedrà a trasudare dalla proboscide. Un ml di una soluzione pilocarbine 1% in PBS e Tween 80 0,1% può essere applicato al torace per stimolare.
- Dopo 60-90 minuti, togliere le zanzare e conservare per l'isolamento del virus, se necessario.
- Rimuovere la soluzione dal tubo per centrifugazione in un tubo contenente 100 ul 20% di FBS-PBS.
- Filtro sterile l'inoculo attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e quindi utilizzare il filtrato l'inoculo di infettare le cellule in coltura.
BIOSICUREZZA NOTA: Questo protocollo descriveun metodo per la generazione, l'identificazione e il monitoraggio zanzare infette. Sulla base delle vostre strutture (ad esempio un tavolo freddo, impianto di contenimento, ecc) e l'approvazione IBC, si può essere limitata ad esaminarle solo dopo aver rimosso le ali e le gambe per evitare la fuga. SINV a base di ATS può essere generata e utilizzata in un ambiente BSL2. L'uso di ATS, basata su alphaviruses altri come la Chikungunya virus o virus dell'encefalite equina occidentale richiederà BSL3 strutture.
7. Rappresentante Risultati
Una panoramica di espressione di un gene marcatore (GFP) utilizzando il 5'dsMRE16 ATS / GFP è mostrata in Figura 1. Espressione della GFP in BHK-21 e C6/36 (Aedes albopictus), le cellule è mostrato nella Figura 2 in determinati momenti dopo l'infezione di cellule con 5'dsMRE16 / GFP virus a 0,01 molteplicità di infezione. Figura 3 è una panoramica di infezione da virus alfavirus e ATS nella zanzara, quando il virus è espresso attraverso un pasto di sangue infettiva. La Figura 4 mostra la preparazione di un pasto di sangue con ~ 10 7 pfu / ml di virus ATS seguita da infezione orale di Aedes aegypti. Corpo vista intera di zanzara infetta e parti del corpo selezionato a 10 giorni dall'infezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza (Figura 5). Rilevazione di tali pratiche e DsRed in midguts di zanzare infette dopo l'infezione con virus ATS 5'dsMRE16 esprimere ogni gene marcatore fluorescente (Figura 6). Test di trasmissione con zanzare infette con 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (Figura 7).
Tabella 1. ATS attualmente progettati per l'espressione genica nelle zanzare.
| Alfavirus | ATS | Zanzara | Riferimento |
| Sindbis Virus | TE / 3'2J e TE / 5'2J | Aedes aegypti | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16 e 5'dsMRE16 | A. aegypti | 5 | |
| Culex tritaeniorhynchus | 5 | ||
| 5'dsTR339 | A. aeg ypti | 2 | |
| Virus Chikungunya | 3'dsCHIKV e 5'dsCHIKV | A. aegypti / A. albopictus | 20 |
| O'nyong nyong virus | 5'dsONNV | Anopheles gambiae | 1,9 |
| Encefalite equina occidentale virus | 5'dsWEEV. McMillan | Culex tarsalis | Stauft et al. Inediti |
Tabella 2. Vantaggi / svantaggi di usare ATS per l'espressione genica nelle zanzare.
| Vantaggi: |
| Produzione rapida di virus ad alto titolo |
| Ospitare un'ampia gamma (SINV) |
| Alto tasso di replicazione RNA |
| Elevati livelli di espressione del transgene |
| Relativa facilità di manipolare geni |
| Stabile, l'espressione genica persistente negli insetti |
| Patologia minima negli insetti |
| Svantaggi: |
| A breve termine la modalità di espressione nelle cellule dei vertebrati |
| Forte effetto citopatico sulle cellule dei vertebrati |
| Gene restrizioni di dimensione (<1Kb, idealmente) |
| Alcuni alphaviruses richiedono BSL3 contenimento |
Figura 1: Panoramica della produzione di virus ATS in cellule BHK-21 utilizzando p5'dsMRE / GFP GFP SINV esprimere. Seguendo la trascrizione in vitro, genomica ATS RNA è elettroporate in cellule BHK-21, dove viene salvato virus. Il virus ATS può quindi essere utilizzato per infettare le zanzare. PSC = promotore subgenomic. Tre ATS specie di RNA sono trascritti nel cells, la genomica, subgenomic 1 e 2 subgenomic RNA. C (capside), glicoproteine E1 ed E2 sono assemblati con ATS genoma per generare virus infettivo.
Figura 2: L'espressione di GFP in zanzara (C6/36), le cellule dopo l'infezione con SINV 5'dsMRE16 / GFP virus.
Figura 3: Panoramica di una infezione da virus ATS nelle zanzare porta alla trasmissione del virus.
Figura 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infezione esponendo le zanzare per un pasto di sangue infettiva.
Figura 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infezione a 10 giorni dall'infezione. Rilevamento intero corpo di GFP mostra che il virus è sfuggito midgut e diffuso ai tessuti secondari. La figura mostra anche l'espressione della GFP in parti del corpo scelto che è anche indicativo di una infezione disseminata.
Figura 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP e 5'dsMRE16 / infezione DsRed di midguts in momenti specifici di post-infezione. Midguts di solito hanno diversi focolai di infezione precoce dopo aver ingerito un pasto di sangue contenente virus che si diffonde in tutto il midgut posteriore in tempi successivi post-infezione.
Figura 7: Riconoscimento di ATS 5'dsMRE16 / GFP nella saliva della zanzara a partire da 8 giorni dall'infezione. Saggio è stato progettato per mostrare la trasmissione del virus ATS e mostra che il 5'dsMRE16 / GFP virus può esprimere stabilmente GFP per tutto il periodo di incubazione estrinseca nella zanzara. Il pannello di sinistra mostra una zanzara salivazione in un tubo capillare, il pannello centrale mostra C6/36 cellule infette con la saliva a 1 giorno e pannello di destra 3 giorni dopo l'infezione.
Discussion
I metodi qui presentati consentono ai ricercatori di seguire l'infezione di un alfavirus in colture cellulari di zanzara e la zanzara femmina adulta. I vantaggi e gli svantaggi di usare virus ATS sono riassunti nella Tabella 2. Un clone ATS infettive possono essere geneticamente manipolate per esprimere qualsiasi governo indiano e sono stati utilizzati per esprimere gli anticorpi a catena singola, soppressori di RNAi, RNA antisenso targeting dei geni endogeni, e pro-apoptotici proteine. Se un giornalista non viene utilizzato, allora la parte di imaging di questo metodo non è rilevante. Tuttavia, molti degli stessi protocolli sono necessari per il soccorso virus ATS, propagazione e infezione zanzara. Ci sono limiti nella dimensione massima del transgene, quando inserito in un sistema di trasduzione alfavirus. I vincoli dimensioni variano a seconda del ceppo parentale utilizzato per generare l'ATS, ma di solito sono circa 1kb anche se geni reporter più grandi come lucciola luciferasi sono stati utilizzati nella costruzione di ATS per l'uso in zanzare. Laboratori di ricerca con una modesta quantità di virologia di fondo dovrebbe essere in grado di utilizzare ATS in seguito questi protocolli. Una serie di laboratori di ricerca hanno già fatto con SINV basato ATS.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) e la RMRCE (NIH AI065357).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
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