Summary
Методы использования альфавирус трансдуцирующих системы, чтобы выразить флуоресцентные журналистам в пробирке и у взрослых комаров описаны. Эта техника может быть адаптирована для выражения какого-либо белка интереса вместо или в дополнение к репортеру.
Protocol
Следующий протокол написан для производства и использования АТС на основе вируса Синдбис MRE16. АТС предназначена для выражения GFP в комаров-переносчиков Aedes aegypti. кДНК Инфекционные клоны число alphaviruses (Синдбис вирус, вирус Чикунгунья, O'nyong-nyong вирус, западная конского энцефалита вирус) в настоящее время доступны, которые были разработаны как АТС (таблица 1). Для достижения наилучших результатов ДНК плазмиды усиливается в такие бактерии, как УВЕРЕН компетентных бактерий (Stratagene / Agilent Technologies), чтобы избежать нежелательных рекомбинации и потери вирусной кДНК. Все инфекционные плазмид клона у бактериофага Т7 или SP6 промоутер в непосредственной 5 'концу вирусной кДНК для транскрипции полнометражных РНК геномных и уникальные рестриктазой на 3' конец для стока транскрипции. Для каждой АТС, пользователи должны использовать соответствующий бактериофаг ДНК зависимой РНК-полимеразы и уникальные рестрикции для экстракорпорального транскрипции вирусного генома РНК.
1. Поколение инфекционных РНК из кДНК клонов.
- Линеаризовать 5 мкг инфекционного клона плазмиды (p5'dsMRE16 / GFP) с 20 единиц фермента ограничение XhoI в 100 мкл реакции. Инкубировать 2-3ч при температуре 37 ° C
- Purify линеаризованной ДНК с использованием Qiagen QIAprep Спиновые Miniprep Kit альтернативный протокол очистки, элюируя ДНК из спин колонки, используя 50 мкл РНКазы без воды. Плазмиды концентрация должна быть приблизительно 1,0 мкг / мкл.
- В РНКазы без трубки 0,2 мл ПЦР, настройка 50 мкл реакции транскрипции использованием Амбион MAXIscript комплект в соответствии с протоколом следующим образом.
- 22,5 мкл РНКазы без дН 2 O
- 5,0 мкл линеаризованной ДНК-матрицы (1,0 мкг / мкл)
- 2,5 мкл 10 мМ ATP
- 2,5 мкл 10 мМ CTP
- 2,5 мкл 10 мМ UTP
- 2,5 мкл 1 мМ GTP
- 2,5 мкл 10 мМ шапка аналоговый (м 7 G (5 ') ППС (5') G)
- 5,0 мкл 10х буфера транскрипции
- 5,0 мкл T7 или SP6 полимеразы смеси
- Всего 50,0 мкл
- 22,5 мкл РНКазы без дН 2 O
- Инкубируйте транскрипции реакции в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После инкубации реакция должна быть использована немедленно для электропорации ВНК-21 клеток. Подготовка ВНК-21 ячеек для электропорации должны начаться во время инкубации реакцию транскрипции.
2. Генерация вирусов от инфекционных РНК
- Trypsinize две 70-80% сливной 150 см 2 (Т-150) колбу ВНК-21 клеток на АТС.
- Передача всех клеток в 15 мл коническую трубку центрифуги.
- Гранул клетки центрифугированием при 2000 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С в обычных настольных центрифуг.
- Ресуспендируют клеток в стерильных ФСБ без Mg + + и Са + +. Повторите шаги 2.3 и 2.4, пока клетки были трижды промывали PBS.
- Ресуспендируют гранулированный клетки 0,5 мл MEM, содержащей 10% FBS.
- Развести 10 мкл клеток с 90 мкл MEM с 10% FBS и рассчитывать на hemacytometer. При необходимости, разбавить клетки 2.5-12.5 х 10 7 клеток / мл MEM, содержащей 10% FBS.
- Для ледяной 0,2 кювет электропорации см, добавить 400 мкл клеточной суспензии и 20 мкл реакции транскрипции. Протрите конденсации из кювета.
- Импульсный кювет дважды: 450В, 1200Ω, 150 мкФ. Мы используем Электро Манипулятор Cell, Гарвардский Аппарат Модель ECM630.
- Место все содержимое кюветы в 25 см 2 культуре ткани колбу 5 мл MEM с 10% FBS.
- Инкубируйте колбы (ы) на 37С с 5% CO 2.
- Монитор инфекции ежедневно с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа с соответствующим набор фильтров (например, GFP фильтр: длина волны возбуждения = 460-490 нм, длина волны излучения = 510-550 нм, или DsRed фильтр: длина волны возбуждения = 460-560 нм, длина волны излучения => 590 нм).
- При флуоресценции предполагает инфекция сливной и / или CPE виден абсолютно во всем колбу, собирать содержимое колбы, добавляют 30% FBS, аликвоту по мере необходимости, и хранить при температуре -80 ° C. При желании, клеточные лизаты могут быть удалены путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту, 10 мин, 4 ° С) перед добавлением ФБС.
- Прохождение вирус не реже одного раза через новую колбу клеток к увеличению титра вируса для последующих анализов кормления кровью.
3. Перорально Заражение комаров
- Смешать крови (обычно покупается де-fibrinated овечьей крови) и клеточной культуры производных суспензии вируса, начиная с шага 2.13. Заключительный титр вируса в крови еды обычно должна быть ~ 1x10 7 бляшкообразующих единиц (БОЕ) / мл для эффективного инфекции средней кишке комара. Чтобы стимулировать комары жадно и много есть, аденозин-5'-трифосфата (АТФ) могут быть добавлены в конечной концентрации 0,02 М.
- Комары могутдолжны быть лишены воды и сахара до заражения, чтобы стимулировать их к эффективной крови ленты из искусственной подачи. Срок лишения должны быть предварительно созданы, чтобы минимизировать смертность. Времена, будет зависеть от видов комаров, влажность insectary т.д. В качестве отправной точки, удалить сахара и воды 24 часа 12 часов до подачи. Этот протокол использует водяной рубашкой стекла feeders17 с циркулирующим 37 ° С воду. Свиной кишечной мембраны (т.е. тщательно промывают колбасной оболочки доступны в большинстве продуктовых магазинов) находится над устьем фидера и еда пипеткой в камеру. Различные конструкции, мембраны и протоколы, которые доступны для различных типов вектор.
- Комары сортируются, чтобы выбрать только те комары наливается кровью. Налиты кровью комаров передается коробка с органди на верхней и комаров инкубируют при 28 ° С, 75-80% относительной влажности до обработаны для выражения GFP.
4. Внутригрудного Прививка от комаров
Внутригрудного прививка является альтернативным методом для заражения членистоногими. Этот метод используется, когда распространение через кишки не требуется. (Метод, описанный ниже, но техника не показано в этом визуальный эксперимент).
- Небольшое количество комаров (5-10) всасывается из холдинга клетки в пластиковые трубы проведения. Запечатанных проведение трубы будут размещены на 4 ° С в течение 15 минут, чтобы охладить комаров.
- 2 5 комаров прольется из тюбика на стеклянном блюде Петри отдыха на льду. Место крышку чашки Петри, когда он не используется или если комары начинают передвигаться. Во время обработки комаров, необходимо позаботиться рассчитывать и отслеживать количество комаров манипулируют. Как комары пролитой на холод таблицы, общее число будет записано в лаборатории счетчика.
- Игла подготовленный плавления капиллярная трубка использованием Nanoject конкретных стекла и иглы съемника.
- Установка Nanoject II microinjector в соответствии с инструкциями изготовителя на поставку 69 нл посевной. Следует быть внимательным при составлении посевной в иглу так, чтобы игла не была повреждена.
- Использование рассекает микроскоп, вставить иглу в грудную клетку от комаров и активировать Nanoject для прививки. Следует быть внимательным, когда прививки комаров таким образом, чтобы игла не полностью проникнуть комаров и выйти с другой стороны, в результате последующей гибели комара. Проверьте каждый комаров, чтобы быть уверенным, что посевной введен до удаления его от иглы.
- После прививки, а комар все еще насаженные на иглу, поместите его в бумаги холдинга картонной через небольшое отверстие в боковой, который подключен с хлопком или корковой пробкой во все другие времена.
- Когда комары прививку и помещаются в картонные (примерно до 50 в упаковке), тщательно ленты пробки в месте, чтобы предотвратить случайное высвобождение комаров. Место коробок в безопасное проведение бен перед дальнейшей инкубации в insectary при 28 ° C и 80% относительной влажности.
5. Мониторинг Заражение комаров
- Положите бумагу проведения упаковке при 4 ° С в течение примерно 15 минут, чтобы обездвижить комаров.
- Передача небольшого количества комаров (5-10 за раз), чтобы холод таблица адаптирована для использования на флуоресцентный микроскоп.
- Изучить и комаров рода на основе наличия или отсутствия флуоресценции. Кроме того, люминесцентные интенсивности может быть использован в качестве прокси-количественного измерения инфекции. Mosquito тканей, таких как midguts, слюнные железы, жир можно разрезать и контроль за флуоресценцию.
- В случае необходимости, вернуть выбранные комаров на бумагу картон для продолжения инкубации инфицированных комаров.
6. Передача анализ (Принудительное Слюноотделение для демонстрации передачи вируса)
- Лишить комаров сахара источника в течение 24 ч до подачи.
- Удалить ногами и крыльями
- Для 50 мкл капиллярной трубке, которая была разогрета, вытащил и отрезал на одном конце, добавить 3-5 мкл Cargille типа B нефти погружения или 10% от сыворотки раствором сахарозы.
- Вставьте хоботок в трубку. При использовании масла, капельки слюны будет видно, чтобы источать с хоботком. Один мкл 1% раствора в pilocarbine PBS и 0,1% Твин-80 может быть применен к грудной клетке, чтобы стимулировать.
- После 60-90 минут, снимите комаров и хранить для выделения вируса, если требуется.
- Удалить раствор из трубки с помощью центрифугирования в пробирку, содержащую 100 мкл 20% FBS-би-эс.
- Стерильный фильтр посевной через 0,2 мкм фильтр шприца, а затем использовать фильтруется посевной заразить культуру клеток.
БИОБЕЗОПАСНОСТИ Примечание: Этот протокол описываетметод генерации, идентификации и мониторинга инфицированных комаров. Основываясь на ваших объектах (например, холод стол, локализации и т.д.), и утверждение IBC, Вы можете быть ограничены рассматривая их только после их удаления крылья и ноги, чтобы предотвратить побег. SINV основе АТС могут быть получены и использованы в BSL2 окружающей среды. Использование АТС, основанные на других alphaviruses, таких как вирус Чикунгунья или западной вирусов конского энцефалита потребует BSL3 объектов.
7. Представитель Результаты
Обзор выражение маркерный ген (GFP) с использованием АТС 5'dsMRE16 / GFP показано на рисунке 1. Экспрессия GFP в ВНК-21 и C6/36 (Aedes albopictus) клетки показано на рисунке 2, в определенное время после заражения клеток с 5'dsMRE16 / GFP вируса на 0,01 множественности заражения. На рисунке 3 приведен обзор вирусной инфекции альфавирус и ОВД в организме комара, когда вирус передается через еду крови инфекционный. Рисунок 4 показывает, подготовка крови еду с ~ 10 7 БОЕ / мл вируса АТС с последующим пероральным заражения Aedes aegypti. Всего зрения организма инфицированного комара и отдельных частей тела в 10 дней после инфекции использованием epifluorescence микроскоп (рис. 5). Обнаружение GFP и DsRed в midguts инфицированных комаров после заражения с АТС 5'dsMRE16 вирусов выражения каждый флуоресцентный ген маркера (рис. 6). Передача методом с использованием инфицированных комаров 5'dsMRE16 / GFP АТС вируса (рис. 7).
Таблица 1. ОВД, в настоящее время разработан для экспрессии генов в комаров.
| Альфавирус | АТС | Комар | Ссылка |
| Синдбис вирусов | TE / 3'2J и TE / 5'2J | Aedes aegypti | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16 и 5'dsMRE16 | A. aegypti | 5 | |
| Culex tritaeniorhynchus | 5 | ||
| 5'dsTR339 | А. AEG ypti | 2 | |
| Чикунгунья Вирус | 3'dsCHIKV и 5'dsCHIKV | A. aegypti / A. albopictus | 20 |
| O'nyong nyong вирус | 5'dsONNV | Anopheles gambiae | 1,9 |
| Западные лошадиного энцефалита | 5'dsWEEV. Макмиллан | Culex tarsalis | Stauft и соавт., Неопубликованные |
Таблица 2. Преимущества / Недостатки использования АТС для экспрессии генов в комаров.
| Преимущества: |
| Быстрое производство с высоким титром вируса |
| Широкий спектр хост (SINV) |
| Высокая скорость репликации РНК |
| Высокие уровни экспрессии трансгенов |
| Относительная легкость манипулирования генами |
| Стабильная, постоянная экспрессия генов у насекомых |
| Минимальная патология у насекомых |
| Недостатки: |
| Краткосрочные выражение в режиме клеток позвоночных |
| Сильные цитопатического воздействия на клетки позвоночных |
| Гена ограничения размера (<1Кб, в идеале) |
| Некоторые alphaviruses требуют BSL3 сдерживания |
Рисунок 1: Обзор АТС вирус производства в ВНК-21 ячеек с помощью p5'dsMRE / GFP SINV выражения GFP. После в пробирке транскрипции, геномная РНК АТС электропорации в ВНК-21 ячеек, в которые вирус спасены. Вирус АТС могут быть использованы для заражения комаров. ПМГ = субгеномных промоутера. Три АТС РНК видов переписаны челЛ.С., геномные, субгеномных 1 и 2 субгеномных РНК. С (капсид), E2 и E1 гликопротеины собираются с АТС генома для создания инфекционного вируса.
Рисунок 2: Выражение GFP в комара (C6/36) клеток после инфицирования SINV 5'dsMRE16 / GFP вируса.
Рисунок 3: Обзор инфекции вируса в ОВД, комары, ведущих к передаче вируса.
Рисунок 4: АТС SINV 5'dsMRE16 инфекции, подвергая комары еды крови инфекционный.
Рисунок 5: АТС SINV 5'dsMRE16 / GFP инфекции в 10 дней после инфекции. Всего обнаружения тела GFP показывает, что вирус бежал кишки и распространены среди вторичных тканей. Рис также показывает, GFP выражение в отдельных частях тела, что также свидетельствует о диссеминированной инфекции.
Рисунок 6: АТС SINV 5'dsMRE16 / GFP и 5'dsMRE16 / DsRed заражения midguts в определенное время после заражения. Midguts как правило, имеют различные очаги инфекции в ранние сроки после проглатывания крови пищи, содержащей вирус, который распространяется по всей задней кишки в более поздние сроки после заражения.
Рисунок 7: Обнаружение АТС 5'dsMRE16 / GFP в слюне комаров еще 8 дней после инфекции. Анализ предназначен для демонстрации передачи вируса АТС и показывает, что 5'dsMRE16 / GFP вирус может стабильно выразить GFP всей внешней инкубационный период в организме комара. Левая панель показывает комаров слюноотделение в капиллярной трубке, панель показывает C6/36 центре клетки, инфицированные слюной на 1 день и правой панели через 3 дня после заражения.
Discussion
Методы, представленные здесь, позволяют исследователям следить заражения комаров альфавирус в культуре клеток и взрослая самка комара. Преимущества и недостатки использования АТС вирусов приведены в таблице 2. АТС инфекционных клон может быть генетически манипулировать, чтобы выразить любую ГОИ и были использованы для выражения одноцепочечные антитела, супрессоры RNAi, антисмысловые РНК ориентации эндогенных генов, и про-апоптотических белков. Если репортер не используется, то часть изображения этого метода не имеет значения. Тем не менее, многие из тех же протоколов необходимы для АТС вирус спасения, распространения и комаров инфекции. Существуют ограничения в максимальный размер трансгенов при вставке в системе трансдуцирующих альфавирус. Ограничений по размеру различаются в зависимости от родительского штамма используется для создания АТС, но, как правило, около 1 КБ, хотя больше репортер генов, таких как люциферазы светляков были использованы в построении АТС для использования в комаров. Исследовательские лаборатории со скромным количеством фоне вирусологии должны быть в состоянии использовать в следующих АТС этих протоколов. Ряд научно-исследовательских лабораториях уже сделали это, используя SINV основе АТС в.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Национального института здоровья (NIH R01 AI46435) и RMRCE (NIH AI065357).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
References
- Brault, A. C. Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).
- Campbell, C. L. Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection. BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).
- Cirimotich, C. M. Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes. BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).
- Capurro, deL. ara, M, Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).
- Foy, B. D. Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species. Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).
- Foy, B. D., Olson, K. E. Alphavirus transducing systems. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).
- Franz, A. W. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).
- Hahn, C. S. Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).
- Keene, K. M. RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).
- Lundstrom, K. Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors. Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).
- Myles, K. M. Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).
- Olson, K. E. Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes. Science. 272, 884-884 (1996).
- Olson, K. E. The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus. Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).
- Olson, K. E. Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection. Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).
- Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. A haemocyte tropism for an arbovirus. J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).
- Pierro, D. J. Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).
- Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosq. News. 24, 407-407 (1964).
- Sanders, H. R. Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).
- Uhlirova, M. Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).
- Vanlandingham, D. L. Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).
- Wang, H. Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells. J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).
