Summary
Metoder för att använda alfaviruset transducing att uttrycka fluorescerande reportrar in vitro och hos vuxna myggor beskrivs. Denna teknik kan anpassas för att uttrycka något protein av intresse i stället för eller som tillägg till en reporter.
Abstract
Alfaviruset transducing system (ATSS) är viktiga verktyg för att uttrycka gener av intresse (indiska) under infektion. ATSS härrör från cDNA kloner av myggor RNA virus (släktet alfaviruset, familj Togaviridae). Den alfaviruset släktet innehåller ca 30 olika myggor virus arter. Alphaviruses är höljeförsedda virus och innehåller enstaka RNA genom (~ 11,7 Kb). Alphaviruses återge en subgenomic mRNA som kodar de strukturella proteiner av viruset krävs för encapsidation av genomet och mognad av viruset. Alphaviruses är vanligtvis mycket lytisk i ryggradsdjur celler, men ihärdigt infektera mottagliga mygga celler med minimal Cytopathology. Dessa attribut gör dem utmärkta verktyg för genuttryck i mygga vektorer. Den vanligaste ATSS i bruk härrör från Sindbis virus (SINV). Den breda arter tropism av SINV tillåter infektion av insekter, fåglar och däggdjur cells8. Dock har ATSS härstammar från andra alphaviruses samt 9,10,20. Utländska genuttryck görs möjligt genom införandet av ett ytterligare virus subgenomic RNA initiering webbplats eller promotor. ATSS som en exogen gensekvens är placerad 5 "att den virala strukturella gener används för stabil protein uttryck i insekter. ATSS, i vilken en gensekvens är placerad 3 "till den strukturella gener används för att utlösa RNAi och tystnad uttryck för denna gen i insekt.
ATSS har visat sig vara värdefulla verktyg för att förstå vektor-patogen interaktioner, molekylära detaljerna i virusreplikation och underhåll smittsamma cykler 3,4,11,19,21. I synnerhet har uttryck för lysrör och självlysande reportrar varit avgörande för att spåra virus-infektion i vektor och virus överförs 5,14-16,18. Dessutom har vektorn immunförsvaret har beskrivits med hjälp av två stammar av SINV konstruerad för att uttrycka GFP 2,9.
Här presenterar vi en metod för tillverkning av SINV innehåller en fluorescerande reporter (GFP) från det cDNA smittsamma klon. Smittsamma, fullängds RNA transkriberas från linjäriserade cDNA klon. Smittsamma RNA införs i tillåtande målceller av elektroporation. Transfekterade cellerna genererar infektiösa viruspartiklar som uttrycker de indiska myndigheterna. Skördade virus används för att infektera myggor, som beskrivs här, eller andra arter värd (visas inte här). Vector kompetens bedöms genom att upptäcka fluorescens utanför midgut eller genom att övervaka virusöverföring 7. Användning av en fluorescerande reporter som den indiska regeringen gör för bekväm uppskattning av viruset sprids en cellkultur, för bestämning av graden av infektion, spridning i utsatta myggor, virus överförs från mygg och ger en snabb mätare på vektor kompetens.
Protocol
Följande protokoll är skriven för produktion och användning av en ATS bygger på Sindbis viruset MRE16. ATS är utformad för att uttrycka GFP i mygga vektor Aedes aegypti. cDNA Smittsamma kloner av ett antal alphaviruses (Sindbis virus, Chikungunya virus, O'nyong-nyong virus, västra hästencefalitvirus virus) är för närvarande tillgängliga som har utformats som ATS: s (tabell 1). För bästa resultat plasmid-DNA förstärks i bakterier som SURE behöriga bakterier (Stratagene / Agilent Technologies) för att undvika oönskade rekombination och förlust av viralt cDNA. Alla smittsamma klon plasmider har en bakteriofag T7 eller SP6 promotorn på omedelbar 5 "slutet av virala cDNA för transkription av full längd genomiska RNA och en unik begränsning endonuclease vid 3" slutet för avrinning transkription. För varje ATS måste användarna använda rätt bakteriofag DNA-beroende RNA-polymeras och unika begränsning endonuclease för in vitro transkription av viralt RNA-genom.
1. Generation av infektiös RNA från cDNA klon.
- Linjärisera den 5 mikrogram av den smittsamma klon plasmiden (p5'dsMRE16 / GFP) med 20 enheter XhoI restriktionsenzymanalys i en 100 mikroliter reaktion. Inkubera i 2-3h vid 37 ° C
- Rena linjäriserade DNA med Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternativa rening protokoll eluerande DNA från spinn kolumn med 50 mikroliter RNase-fritt vatten. Plasmid koncentration bör vara ungefär 1,0 mikrogram / mikroliter.
- I en RNas-fri 0,2 ml PCR-rör, set-up en 50 mikroliter transkription reaktion med Ambion MAXIscript Kit per protokoll enligt följande.
- 22,5 mikroliter RNas-fria dH 2 O
- 5,0 mikroliter Linjäriserad DNA-mall (1,0 mikrogram / l)
- 2,5 mikroliter 10 mM ATP
- 2,5 mikroliter 10 mM CTP
- 2,5 mikroliter 10 mM UTP
- 2,5 mikroliter 1mm GTP
- 2,5 mikroliter 10 mM cap analoga (m 7 G (5) PPP (5 ') G)
- 5,0 mikroliter 10X transkription buffert
- 5,0 mikroliter T7 eller SP6 polymeras mix
- 50,0 mikroliter Totalt
- 22,5 mikroliter RNas-fria dH 2 O
- Inkubera transkription reaktionen för 1 timme vid 37 ° C. Efter inkubation, bör reaktionen användas omedelbart för elektroporering av BHK-21 celler. Beredning av BHK-21 celler för elektroporation bör inledas under inkubationstiden transkription reaktion.
2. Generation av virus från Smittsamma RNA
- Trypsinize två 70-80% konfluenta 150 cm 2 (T-150) kolv BHK-21 celler per ATS.
- Överför alla celler till ett 15 ml koniskt centrifugrör.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 2000 rpm, 10 min, 4 ° C i en vanlig bordsskiva centrifug.
- Resuspendera cellerna i sterila PBS utan Mg + + och Ca + +. Upprepa steg 2,3 och 2,4 tills celler har sköljs tre gånger med PBS.
- Resuspendera pelleterat cellerna 0,5 ml MEM innehåller 10% FBS.
- Späd 10 mikroliter celler med 90 mikroliter MEM med 10% FBS och räkna med en hemacytometer. Om nödvändigt, späd celler till 2,5-12,5 x 10 7 celler / ml med MEM innehåller 10% FBS.
- För att en iskall 0,2 cm elektroporation kyvett, tillsätt 400 mikroliter cellsuspension och 20 mikroliter transkription reaktion. Torka kondens kyvett.
- Puls kyvetten två gånger: 450V, 1200Ω, 150 uF. Vi använder en Electro Cell Manipulator, Harvard Apparatus modell ECM630.
- Placera hela innehållet i kyvetten i en 25 cm 2 vävnadsodling kolven som innehåller 5 ml MEM med 10% FBS.
- Inkubera kolv (s) vid 37C med 5% CO 2.
- Övervaka infektionen dagligen med ett inverterat fluorescerande mikroskop med lämpligt filter in (t.ex. GFP filter: excitationsvåglängden = 460-490 nm, emission våglängd = 510-550 nm, eller dsRed filter: excitationsvåglängden = 460-560 nm, emission våglängd => 590 nm).
- När fluorescens tyder på infektion är konfluenta och / eller CPE är synlig i hela kolven, samla innehållet i kolven, tillsätt 30% FBS, uppmätt vid behov, och förvara vid -80 ° C. Om så önskas kan cellen lysates tas bort genom centrifugering (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) före tillägg av FBS.
- Passage virus minst en gång genom en ny kolv av celler för att öka virus titer för senare analyser blod utfodring.
3. Per os Infektion av myggor
- Blanda samman blod (oftast köps de-fibrinated får blodet) och cellodling härrör virussuspension från steg 2,13. Final virus titer i blodet måltiden normalt bör vara ~ 1x10 7 plack bildas enheter (PFU) / ml för effektiv midgut infektion i mygga. För att stimulera myggor att uppsluka, adenosin 5'-trifosfat (ATP) kan läggas till en slutlig koncentration av 0.02M.
- Myggor kanmåste berövas vatten och socker innan infektionen att stimulera dem att effektivt blod foder från en artificiell mataren. Varaktighet av fattigdom bör tidigare fastställda för att minimera dödligheten. Gånger beror på myggarter, fuktighet insectary etc. Som en utgångspunkt, ta bort socker 24h och 12h vatten före fodret. Detta protokoll använder vattenmantlad glas feeders17 med cirkulerande 37 ° C vatten. Ett svin intestinal membran (dvs. noggrant tvättas korv hölje finns på de flesta livsmedelsbutiker) placeras över mynningen av mataren och måltiden är pipetteras till kammaren. Olika utföranden, membran och protokoll finns för olika vektor typer.
- Myggor sorteras väljer endast de myggor svullna av blod. Svullna myggor överförs till en kartong med organdi på toppen och myggorna inkuberas vid 28 ° C, 75-80% relativ luftfuktighet tills behandlas för GFP uttryck.
4. Intratorakalt Inokulering av myggor
Intratorakalt inympning är en alternativ metod för att angripa de leddjur. Denna metod används när spridning genom att midgut inte behövs. (Metod som beskrivs nedan men tekniken är inte visas i denna visuella experiment).
- Ett litet antal myggor (5-10) sugs från anläggningen burar i plast håller rör. Den förseglade hålla Rören kommer att placeras vid 4 ° C i 15 minuter för att kyla myggor.
- 2 5 myggor kommer att spillas ur tuben på ett glas petriskål vilar på isen. Placera locket på petriskålen när den inte används eller om myggorna börjar att flytta runt. Under hanteringen av myggor, måste man räkna och hålla koll på antalet myggor manipuleras. Som myggor spills på kylan bordet, kommer det totala antalet spelas in på ett lab disk.
- Nålen är beredd genom smältning kapillär slang med Nanoject specifika glas och en nål avdragare.
- Ställ in Nanoject II microinjector per tillverkarens anvisningar för leverans av 69 nL inokulat. Försiktighet måste iakttas vid utarbetandet av inokulatet in nålen så att nålen inte är skadad.
- Med hjälp av en dissekera mikroskop, för in nålen i bröstkorgen av mygg och aktivera Nanoject för ympning. Försiktighet måste iakttas vid inokulering av myggor, så att nålen inte helt tränga in i myggans och avsluta den andra sidan, vilket resulterar i den efterföljande död mygga. Kontrollera varje mygga att vara säker på att inokulatet in innan du tar bort det från injektionsnålen.
- Efter vaccinationen, medan mygga fortfarande spetsas på nålen, placera den i ett papper att hålla kartong genom ett litet hål i sidan som är ansluten med bomull eller en kork vid alla andra tillfällen.
- När myggorna har inokulerade och placeras i kartong (upp till cirka 50 per kartong), försiktigt tejpen korken för att förhindra oavsiktliga utsläpp av myggor. Placera kartonger på ett säkert hålla bin innan ytterligare inkubering i insectary vid 28 ° C och 80% relativ fuktighet.
5. Övervakning Infektion av myggor
- Placera papperet håller kartongen vid 4 ° C i ca 15 minuter att immobilisera myggor.
- Överför ett litet antal myggor (5-10 i taget) till en kyla bord anpassat för användning på en fluorescerande mikroskop.
- Undersök och sortera mygg baserade på närvaro eller frånvaro av fluorescens. Dessutom kan fluorescerande intensitet användas som en proxy kvantitativ mätning av infektion. Mosquito vävnader som midguts, spottkörtlar, kan fett kropp dissekeras och övervakas för fluorescens.
- Om det är lämpligt, återvänder utvalda myggor till papper kartong för att fortsätta inkubation av infekterade myggor.
6. Transmission-analys (Tvingad Salivation att demonstrera virusöverföring)
- Beröva myggor av socker källa för 24 timmar före foder.
- Ta bort ben och vingar
- Att en 50 mikroliter kapillärrör som har uppvärmd, dras och klippt i ena änden, lägg 3-5 mikroliter av Cargille typ B immersionsolja eller 10% serum-sackaroslösning.
- Sätt in snabel i röret. Om du använder olja, kommer droppar av saliv ses att andas från snabel. En mikroliter av en 1% pilocarbine lösning i PBS och 0,1% Tween 80 kan tillämpas på bröstkorgen för att stimulera.
- Efter 60-90 minuter, ta bort myggor och lagra för virusisolering vid behov.
- Ta bort lösning från röret genom centrifugering i en tub som innehåller 100 mikroliter 20% FBS-PBS.
- Sterila filtrera inokulat genom ett 0,2 ìm spruta filtret och sedan använda den filtrerade inokulatet att infektera odlade celler.
Biosäkerhet OBS: Detta protokoll beskriveren metod för att generera, identifiera och övervakning infekterade myggor. Baserat på dina anläggningar (dvs. en chill bord, inneslutning anläggning, etc.) och IBC godkännande, kan du vara begränsad till att granska dem först ta bort vingar och ben för att förhindra flykt. SINV-baserade ATS är kan genereras och användas i en BSL2 miljö. Användningen av ATS är baserad på andra alphaviruses som Chikungunya virus eller western häst virus encefalit kräver BSL3 anläggningar.
7. Representativa resultat
En översikt av uttrycket av en markör gen (GFP) med ATS 5'dsMRE16 / GFP visas i figur 1. Redovisning av GFP i BHK-21 och C6/36 (Aedes albopictus) celler visas i Figur 2 på bestämda tider efter infektion av celler med 5'dsMRE16 / GFP virus på 0,01 mångfald av infektion. Figur 3 är en översikt över alfaviruset och ATS-virusinfektion i mygga när viruset levereras genom ett smittsamt blodmjöl. Figur 4 visar förbereda en blodmjöl med ~ 10 7 PFU / ml ATS virus följt av oral infektion i Aedes aegypti. Hela kroppen bakgrund av infekterade myggor och valda kroppsdelar på 10 dagar efter infektion med en epifluorescensmikroskop (Figur 5). Upptäckt av GFP och dsRED i midguts av infekterade myggor efter infektion med ATS 5'dsMRE16 virus som uttrycker varje fluorescerande markör genen (Figur 6). Överföring analysen med myggor infekterade med 5'dsMRE16 / GFP ATS-virus (Figur 7).
Tabell 1. ATS är för närvarande konstruerats för genuttryck i myggor.
| Alfaviruset | ATS | Mosquito | Referens |
| Sindbis Virus | TE / 3'2J och TE / 5'2J | Aedes aegypti | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16 och 5'dsMRE16 | A. aegypti | 5 | |
| Culex tritaeniorhynchus | 5 | ||
| 5'dsTR339 | A. AEG ypti | 2 | |
| Chikungunya virus | 3'dsCHIKV och 5'dsCHIKV | A. aegypti / A. albopictus | 20 |
| O'nyong nyong virus | 5'dsONNV | Anopheles gambiae | 1,9 |
| Western hästencefalitvirus virus | 5'dsWEEV. McMillan | Culex tarsalis | Stauft et al. Opublicerad |
Tabell 2. Fördelar / nackdelar med att använda ATS är för genuttryck i myggor.
| Fördelar: |
| Snabb produktion av hög-titer virus |
| Brett spektrum av värdorganismer (SINV) |
| Hög RNA replikering takt |
| Höga transgenen uttryck nivåer |
| Relativt lätt att manipulera gener |
| Stabil, ihållande genuttryck hos insekter |
| Minimal patologi hos insekter |
| Nackdelar: |
| Kortsiktiga uttryck läge i ryggradsdjur celler |
| Starka cytopatisk effekter på ryggradsdjur celler |
| Gene storlek begränsningar (<1Kb, helst) |
| Vissa alphaviruses kräver BSL3 inneslutning |
Figur 1: Översikt av ATS-virus produktion i BHK-21 celler med p5'dsMRE / GFP SINV uttrycka GFP. Efter in vitro transkription är genomisk ATS RNA electroporated i BHK-21 celler där viruset är räddad. ATS Viruset kan sedan användas för att infektera myggor. STP = subgenomic promotor. Tre ATS-RNA arter transkriberas i CELLS, den genomiska, subgenomic 1 och subgenomic 2 RNA. C (kapsid), är E2 och E1 glykoproteiner monterad med ATS genomet för att generera smittsamt virus.
Figur 2: Redovisning av GFP i mygga (C6/36) celler efter infektion med SINV 5'dsMRE16 / GFP viruset.
Figur 3: Översikt över ett ATS-virusinfektion i myggor som leder till virusöverföring.
Figur 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infektion genom att utsätta myggor till en smittsam blodmjöl.
Figur 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infektion vid 10 dagar efter infektion. Hela kroppen upptäckt av GFP visar att viruset har undgått midgut och spridas till sekundära vävnader. Figuren visar också GFP uttryck i utvalda kroppsdelar som också är ett tecken på en disseminerad infektion.
Figur 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP och 5'dsMRE16 / dsRED infektion midguts på bestämda tider efter infektion. Midguts brukar ha olika fokus för infektion tidigt efter intag av en blodmjöl som innehåller virus som sprider sig i hela bakre midgut på senare tid efter infektion.
Figur 7: Upptäckt av ATS 5'dsMRE16 / GFP i myggans saliv så tidigt som 8 dagar efter infektion. Testet är designat för att visa överföring av ATS virus och visar att 5'dsMRE16 / GFP viruset stabilt kan uttrycka GFP hela yttre inkubationstid i mygga. Den vänstra panelen visar en mygga dregla i ett kapillärrör, visar mittpanelen C6/36 celler infekterade med saliv på en dag och högra panelen 3 dagar efter infektion.
Discussion
Metoderna som presenteras här möjligt för forskare att följa infektion av en alfaviruset i mygga cellkultur och den vuxna honan mygga. För-och nackdelar med att använda ATS virus sammanfattas i Tabell 2. En ATS smittsamma klon kan vara genetiskt manipulerade för att uttrycka någon indiska myndigheterna och har använts för att uttrycka samma kedja antikroppar, stötvågsfilter av RNAi, RNA antisense inriktning endogena gener, och pro-apoptotiska proteiner. Om en reporter inte används, då avbildning del av denna metod inte är relevant. Men många av de protokoll som är nödvändiga för ATS virus räddning, förökning, och mygga infektion. Det finns begränsningar i den maximala storleken på transgenen när de sätts in en alfaviruset transducing system. Storleken begränsningar varierar beroende på moderstammen används för att generera ATS, men är vanligtvis cirka 1 KB men större reporter gener som eldfluga luciferas har använts för att konstruera ATS för användning i myggor. Forskningslaboratorier med ett blygsamt belopp för virologi bakgrund bör kunna använda ATS har efter dessa protokoll. Ett antal forskningslaboratorier redan har gjort det med hjälp av SINV-baserade ATS-talet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) och RMRCE (NIH AI065357).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
References
- Brault, A. C. Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).
- Campbell, C. L. Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection. BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).
- Cirimotich, C. M. Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes. BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).
- Capurro, deL. ara, M, Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).
- Foy, B. D. Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species. Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).
- Foy, B. D., Olson, K. E. Alphavirus transducing systems. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).
- Franz, A. W. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).
- Hahn, C. S. Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).
- Keene, K. M. RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).
- Lundstrom, K. Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors. Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).
- Myles, K. M. Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).
- Olson, K. E. Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes. Science. 272, 884-884 (1996).
- Olson, K. E. The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus. Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).
- Olson, K. E. Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection. Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).
- Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. A haemocyte tropism for an arbovirus. J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).
- Pierro, D. J. Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).
- Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosq. News. 24, 407-407 (1964).
- Sanders, H. R. Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).
- Uhlirova, M. Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).
- Vanlandingham, D. L. Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).
- Wang, H. Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells. J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).
