Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Summary

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di

Abstract

Variazione di risposta ai farmaci antimalarici e della patogenicità dei parassiti della malaria è di importanza biologica e medica. Mappatura collegamento ha portato alla identificazione di successo di geni o loci sottostante vari tratti di parassiti della malaria di roditori ^1-3 e gli esseri umani ^4-6. Il parassita della malaria Plasmodium yoelii è una delle specie di malaria molti isolato da roditori selvatici africani ed è stato adattato a crescere in laboratorio. Questa specie riproduce molte delle caratteristiche biologiche dei parassiti della malaria umana; marcatori genetici come microsatelliti e amplificato frammento lunghezza polimorfismo (AFLP) i marcatori sono stati sviluppati anche per il parassita ^7-9. Così, gli studi genetici in parassiti della malaria roditori possono essere eseguite per completare le ricerche sul Plasmodium falciparum. Qui, noi dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio in P. yoelii che sono stati pionieri di Drs. David Walliker, Richard Carter, ei suoi colleghi presso l'Università di Edimburgo ^10.

Incroci genetici in P. yoelii e altri parassiti della malaria roditori sono condotte da infettando i topi Mus musculus con un inoculo contenente gametociti di due cloni geneticamente distinte che si differenziano per fenotipi di interesse e permettendo zanzare di nutrirsi di topi infettati 4 giorni dopo l'infezione. La presenza di gametociti maschili e femminili nel sangue mouse è microscopicamente confermato prima della somministrazione. Entro 48 ore dopo il pasto, nel midgut della zanzara, i gametociti aploide differenziarsi in gameti maschili e femminili, fertilizzare, e forma uno zigote diploide (Fig. 1). Durante lo sviluppo di uno zigote in un ookinete, meiosi sembra verificarsi ^11. Se lo zigote è il risultato di fertilizzazione incrociata tra gameti di due parassiti geneticamente distinte, scambi genetici (riassortimento cromosomiche e cross-over tra i non-sorella cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi;. Fig. 2) possono verificarsi, con conseguente ricombinazione di materiale genetico di loci omologhi. Ogni zigote subisce due successive divisioni nucleari, portando a quattro nuclei aploidi. Un ookinete sviluppa in un oocisti. Una volta che il oocisti matura, migliaia di sporozoiti (la progenie della croce) sono prodotti ed emessi in hemoceal zanzara. Sporozoiti vengono raccolte dalle ghiandole salivari e iniettato in un nuovo ospite murino, dove lo sviluppo fase pre-eritrocitaria e eritrocitaria avviene. Forme eritrocitaria sono clonati e classificati in relazione ai caratteri distintivi delle linee parentali prima mappatura linkage genetico. Infezioni controllo dei singoli cloni dei genitori vengono eseguite nello stesso modo come la produzione di un incrocio.

Protocol

Tecniche asettiche devono essere applicati a tutti i materiali che saranno somministrati in animali al fine di evitare l'introduzione accidentale di agenti infettivi esogeni in topi che possono confondere i risultati sperimentali.

1. L'infezione di topi da laboratorio con sangue stadio parassiti della malaria

1. A temperatura ambiente, disgelo due fiale contenenti il ​​sangue congelato parassiti della malaria stadio da attraversare. In questo esempio, due ceppi di roditori parassita della malaria da Plasmodium utilizzati sono yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii.
2. Montare una siringa con un calibro 22-30 (G) l'ago e redige 400 ml di sterile, di grado farmaceutico PBS (pH 7,4).
3. Utilizzando la stessa siringa, elaborare 100 l di sangue infetto scongelati; invertire la siringa su e giù fino a quando il contenuto è omogeneo misto. (Opzionale: una pipetta può essere utilizzato per trasferire PBS e il sangue infetto in un tubo di raccolta prima di trasferire in una siringa per iniezione).
4. Iniettare 200 ul di parassita che contiene la soluzione direttamente nel peritoneo di un mouse. Al termine, scartare la siringa in un contenitore taglienti. (Vedi anche Materiali complementari per la manutenzione di topi di laboratorio). In generale, la dimensione standard del inoculo è compresa tra 100-500 microlitri, a seconda dei livelli di infezioni parassita nei materiali originali congelato.
5. Iniettare i due ceppi di parassiti da attraversare in due topi ciascuno. I topi saranno positivi microscopicamente 3 a 5 giorni dopo le iniezioni. Quando parasitemias raggiungere tra 1-5%, passare alla fase successiva.

2. Clone infezione mista di topi

1. Prima di infezione clone misti, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l'esame microscopico di strisci colorati Giemsa fluidificare il sangue (Fig. 3), e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate) .
2. Calcolare il volume di una soluzione fisiologica (1,5% w / v citrato trisodico biidrato, 0,85% w / v di cloruro di sodio) e il sangue del mouse necessario per produrre una miscela di inoculo, utilizzando la parassitemia e rosso sangue le misurazioni della densità delle cellule ottenute in precedenza.
3. Regolare la soluzione parassita ad una concentrazione finale di un milione di cellule infette rossi del sangue per 100μl.
4. Combina il sangue infetto da due donatori in un rapporto 1:1 per ottenere un misto clone di inoculo. Quando i due cloni parentali si differenziano per il tasso di crescita, regolare le proporzioni di una più rapida crescita dei genitori ad una crescita lenta clone dei genitori per 1:2 o 1:5.
5. Iniettare 100 ul del campione misto nel peritoneo di ogni topo di essere infetti. (Vedi anche punto 3,9 a determinare il numero di topi da iniettare)
6. Utilizzando questo metodo, infettare ogni due mouse con i ceppi singoli genitori. Il singolo-clone infezioni consentirà di determinare la trasmissione di successo dei due ceppi parentali.

3. Le zanzare di alimentazione

1. Preparare tre gabbie contenenti 300-500 adulti (maschi e femmine) le zanzare anofele stephensi ciascuno, età 5-7 giorni dopo l'emergere di pupe. I contenitori sono coperti con una rete sicura da un coperchio di plastica o metallo. Due gabbie sono per l'alimentazione sui cloni dei genitori; la gabbia terzo è per la preparazione di un incrocio.
2. A partire quattro giorni dopo la mixed-clone di infezione, preparare Giemsa macchiato di sottili strisci di sangue dalla coda dei topi infetti.
3. Esaminare il strisci sotto un microscopio attraverso la scansione di almeno 50 campi microscopici ad ingrandimento 1000x e determinare se gametociti maschili e femminili sono presenti.
4. Gametociti maschili e femminili sono riconoscibili per la presenza di grandi granuli vacuolo e di grandi dimensioni (Fig. 3). Gametociti maschili e femminili hanno citoplasma rosa e blu, rispettivamente. Se gametociti sono presenti, seguire passo 3.6.
5. Se gametociti sono assenti, continuare a monitorare ogni giorno fino a che non appaiono. Se gametociti sono presenti, continuare il passo successivo.
6. Iniettare 50 ml di cocktail di farmaci anestetici contenenti 33 mg / ml di ketamina e 3 mg / mL di xylazina nel peritoneo di un mouse per anestetizzare ogni topo infetto (per 20 grammi di peso corporeo del mouse). Ultima dose di ketamina e xilazina è 82,5 e 7,5 mg / kg, rispettivamente.
7. Posizionare i topi a faccia in giù sulla cima di una gabbia contenente adulto zanzare Anopheles stephensi che sono stati affamati di approvvigionamento di zucchero per 24 ore e consentono di alimentare le zanzare per 30 minuti senza interruzioni.
8. Mantenere le zanzare in una insectary in condizioni standard (temperatura è mantenuta tra 24-26 ° C; vedere anche Metodi supplementare per la manutenzione del laboratorio di zanzare).
9. Utilizzare un mouse infetti per ogni 50-100 zanzare femmine. Euthanize i topi immediatamente dislocazione cervicale dopo l'alimentazione, mentre i topi sono ancora sotto anestesia.

4. Mosquito Midg dissezioneUTS e oocisti di conteggio

1. Nove giorni dopo la poppata, le zanzare saranno esaminate per oocisti in midgut dell'insetto. La presenza di oocisti nelle zanzare che si nutrono di topi infettati singolo clone indica che gametociti dei due ceppi parentali sono infettive.
2. Di sezionare un midgut zanzara, utilizzare un aspiratore collegato ad un piccolo contenitore per raccogliere 5-10 zanzare infette dalla gabbia.
3. Utilizzando gas CO _2, anestetizzare le zanzare e trasferirli in un piatto di vetro Petri sul ghiaccio. Separare ed eliminare le zanzare maschio. Le antenne dei maschi sono notevolmente più folta rispetto alle femmine.
4. Riempire due siringhe con PBS e in forma con 26 calibro mezzo pollice (G ^½) aghi. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino.
5. Trasferimento 5-10 zanzare femmina anestetizzato sulla goccia di PBS e il luogo di diapositive su un microscopio da dissezione.
6. Utilizzando gli aghi stesso, togliere le ali ogni zanzara e gambe, poi, tenendo l'insetto al torace e l'addome posteriore, estrarre il corpo senza fino alla midgut, un bianco sac-come corpo, viene rilasciato. Staccare il midgut e scartare il resto del corpo.
7. Aggiungere più PBS sulla midgut se le diapositive sono asciutte. Il midgut degenererà se lascia secca. Posizionare un vetrino sulla midguts.
8. Esaminare il midguts sotto un microscopio ottico con un ingrandimento 100x. Contare il numero di oocisti in ogni midgut (Fig. 3). Oocisti sono riconoscibili come strutture circolari spesse pareti che si trovano sulla superficie esterna del midguts.
9. Al termine, disporre di siringhe, aghi e far scorrere in un contenitore taglienti.
10. Se oocisti sono assenti nel midguts, mangimi zanzare con i topi infettati con il maggior numero di gametociti e dare un tempo più lungo di alimentazione. La temperatura è fondamentale per questo passaggio. Assicurarsi che la temperatura è impostata a 24 a 26 ° C.

5. Raccolta sporozoiti da zanzare per centrifugazione

1. Preparare provette sporozoite come segue: tagliare il coperchio di una pulizia di 0,5 ml di tubo di centrifuga, un buco (0,1-0,2 mm di diametro) nella parte inferiore del tubo con una fiammata 19 ago G.
2. Riempire 1 / 3 del tubo con lana di vetro. Inserire il tubo in un filtro da 1,5 mL tubo di raccolta (un tubo è sufficiente per sporozoiti raccolto da circa 100 zanzare)
3. Il giorno 17 di alimentazione messaggio, raccogliere le zanzare (Fase 4) dalle gabbie in un piccolo contenitore con un aspiratore.
4. Utilizzare gas CO ₂ per anestetizzare le zanzare.
5. Separare le femmine dalle zanzare maschio. Trasferire le zanzare femmine anestetizzato dal contenitore per un piatto di vetro Petri sul ghiaccio.
6. Preparare due siringhe con aghi 26 G ^½ pieno di PBS. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino.
7. Trasferire le zanzare su un vetrino da microscopio. Togliere la testa le zanzare ', ali, gambe, addome e sotto un microscopio da dissezione.
8. Utilizzando punta fine pinze trasferire i toraci in 0,5 ml di PBS in un 1,5 mL omogeneizzatore (mortaio e pestello). Conservare il toraci su ghiaccio (sporozoite rimane infettivi per 2-3 h).
9. Omogeneizzare la toraci sul ghiaccio per liberare sporozoiti dalle ghiandole salivari (vedi figura 3), e trasferire i lisati (omogenati) nel tubo riempito di lana di vetro (Fase 5,1-5,2) usando una pipetta di vetro.
10. Centrifugare per 10 a 20 sec a 1000 rpm a temperatura ambiente.
11. Raccogliere il flow-through (la sospensione sporozoite purificato) utilizzando una siringa con un ago 22-30 G. (Opzionale: calo 10-50 microlitri della flow-through su un vetrino da microscopio, posizionare una copertura antiscivolo e visualizzare gli sporozoiti vivere sotto un microscopio ottico standard, ingrandimento 400X, vedi anche Fig. 3)
12. Iniettare ip 0,1-0,5 mL di sospensione sporozoite in topi (fino a 200.000 parassiti può essere raccolto da una zanzara, vedi rif 12). In un caso di successo, l'animale si infetta 72 ore dopo l'iniezione.

6. Clonazione Progeny si utilizza la diluizione limitata

1. Settantadue ore dopo le iniezioni sporozoite, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l'esame microscopico dopo colorazione di Giemsa strisci di sangue sottile e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate).
2. Scegli un mouse visualizzando una parassitemia 0,1-1% e le cui cellule infette globuli rossi contengono parassiti per lo più single, come donatore per la procedura di clonazione. Ripetere il passo 6,1 giorno successivo, se i topi sono microscopicamente negativi. Se gli animali non sono infetti entro 14 giorni, ripetere il passo 2 a 5 e determinare la presenza di sporozoiti al punto 5.11).
3. Diluire il sangue coda raccolte in un freddo 1:01 soluzione di Ringer siero di vitello e dei mammiferi (2,7 mM di cloruro di potassio, 1,8 mM di cloruro di calcio, cloruro di sodio 154 mM) in modo da raggiungere una truffaconcentrazione da 0,6 a 1 cella di sangue infetto rosso per 100 l, e memorizzare l'inoculo sul ghiaccio. In questo modo, la maggior parte del mouse individuo dovrebbe ricevere uno o zero parassiti.
4. Per via endovenosa iniettare 100 ml di sangue infetto diluito in ogni da 50 a 100 topi.
5. Cinque a sette giorni dopo, sullo schermo i topi per la presenza di parassiti fase sangue esaminando Giemsa-macchiate strisci di sangue sottile. In un esperimento riuscito, 20-50% dei topi infettati e mostrerà parassitemia del 0,1-5,0% al giorno 8 l'infezione.

7. Caratterizzazione di Progeny utilizzando marcatori genetici

1. Colleziona 20-40 l di sangue del mouse in una coda di 1,5 mL provetta contenente 0,2 ml di acqua refrigerata soluzione di citrato fisiologica salina, mescolare brevemente nel vortex e centrifugare per 3 min a 3000 rpm a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Estrarre il DNA immediatamente o tenere il pellet a -80 ° C.
2. Preparare DNA parassita utilizzando qualsiasi metodo di estrazione del DNA. Per l'isolamento rapido di DNA, utilizzare un modello ad alta Pure PCR preparazione kit (Roche Applied Bioscience).
3. Ricombinante progenie vengono identificati dopo genotipizzazione mediante microsatelliti (MS) o singoli polimorfismi nucleotidici (SNP) su cromosomi diversi che possono differenziare i due ceppi parentali della croce genetica. Un metodo semplificato utilizzando una singola primer fluorescente marcato per MS genotipizzazione di P. yoelii può essere utilizzato (vedi rif 8,9).

8. Crioconservazione di sangue allo stadio parassiti della malaria

1. Raccogliere 0,5-1 ml di sangue infetto mediante puntura cardiaca da un mouse anestetizzati con parassitemia del 5-20% in 5-10 ml di soluzione fisiologica salina fredda.
2. Centrifugare per 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gettare il surnatante.
3. Aggiungere goccia a goccia il volume di 2x Glycerolyte 57 soluzione (Fenwal Laboratories) sul pellet di sangue e mescolare bene.
4. Trasferire la sospensione in cryotubes (0,2-0,5 ml per provetta).
5. Conservare il sangue criopreservati a -80 ° C (fino a 1 mese) o in azoto liquido.

9. Rappresentante dei risultati:

In un esperimento riuscito, il 5-10% delle linee clonato sarà indipendente progenie ricombinante.

Figura 1. Una rappresentazione schematica del ciclo di vita e gli eventi di ricombinazione genetica nel corso di un incrocio. Eventi di ricombinazione genetica si svolgono durante la fase iniziale di sviluppo nella zanzara. Dopo la fecondazione di "aploidi" gameti maschili e femminili di diverse origini genetiche nel midgut della zanzara, "diploide" zigoti sono formate. Lo zigote rappresenta l'unica tappa diploide del ciclo di vita dei parassiti; meiosi segue entro 12 ore dalla fecondazione, e tutte le fasi successive nella zanzara e mammiferi rimangono aploidi. Gli zigoti risultanti si sviluppano in ookinetes e oocisti. Crescita e la divisione mitotica di ogni oocisti produce migliaia di sporozoiti, che vengono rilasciati in hemoceal zanzare '. Quelli sporozoiti che migrano verso le ghiandole salivari sono in grado di essere trasmessi a un ospite mammifero, dove lo sviluppo del fegato e globuli rossi fasi avviene. Nel corso dei cicli di globuli rossi, alcuni parassiti possono differenziarsi in maturare gametociti maschili e femminili. Il ciclo di vita del parassita si completa quando questi gametociti sono prese da un altro la trasmissione zanzara, perpetuando.

Figura 2. Ereditarietà dei geni nucleari in parassiti della malaria e la produzione di progenie ricombinante. Ricombinazione genetica può essere generato attraverso il riassortimento dei cromosomi o da eventi di crossover. Progenie omozigote prodotto da autofecondazione tra gameti del clone stessi genitori 1 o 2 (A e D), rispettivamente. B) progenie eterozigote prodotto dalla fertilizzazione incrociata tra gameti di due diversi cloni dei genitori, nuclei ricombinante (ovali blu) che è costituita da riassortimento cromosomiche solo. C) progenie eterozigote prodotta da fertilizzazione incrociata tra gameti di due cloni differenti genitore, nuclei ricombinante (ovali rosso) è formata da incroci tra il non-sorella cromatidi dei cromosomi omologhi.

Figura 3. Morfologia della malaria roditore parassita Plasmodium yoelii. A) fase anello, B) trofozoite, C) schizonte, D) merozoiti, E) immaturi gametocyte maschile, F) gametocyte maturo maschio, G) immaturi gametocyte femminile, H) gametocyte Donna matura, I) midgut oocisti con il 10 ° giorno dopo alimentazione (oocisti mature indicato dalle frecce; ingrandimento 200x), J) zanzara ghiandole salivari (ingrandimento 100x), K) sporozoiti (ingrandimento 400x).

Discussion

Dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio nella malaria da Plasmodium yoelii roditore, che è applicabile anche alla produzione di croci genetica in malarie altri roditori. Infezioni di topi con singoli cloni dei genitori sono di solito eseguite per determinare la trasmissione di successo dei parassiti dei genitori per garantire che i genitori sono competenti nel produrre gameti funzionali prima di eseguire una croce.

Trasmissione di successo attraverso una zanzara è influenzata da molteplici fattori tra cui la temperatura del insectary, specie di parassiti della malaria roditori usati, e le dosi di sangue stadio parassita (dimensione dell'inoculo). Mentre la trasmissione di P. berghei è normalmente raggiunta a 19-21 ° C ^13, la trasmissione di P. yoelii e P. chabaudi è eseguita di routine a 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes di P. berghei non riescono a svilupparsi in oocisti a temperature inferiori a 16 ° C o superiori a 24 ° C ^15. Oltre alla temperatura, la dimensione dell'inoculo può influenzare tasso di moltiplicazione dei parassiti della malaria nel sangue. Nonostante le iniezioni di dimensioni dell'inoculo grande (5 x 10 ⁶ iRBC o più) darà maggiore parassitemia in fasi molto precoci dell'infezione, non conduce necessariamente ad un numero maggiore di gametociti o superiore infettività alle zanzare. Gadsby ed altri (2009) ¹⁶ ha mostrato che gametociti di P. chabaudi Adami sono presenti nel sangue dal giorno 3 al giorno 20 (picco al giorno 13) dopo l'infezione di 1 x 10 ⁶ iRBC, tuttavia, al 6 ° giorno post infezione è l'unico giorno in cui le zanzare si infettano. Inoltre, la somministrazione di una dimensione di grande inoculo di ceppi di parassiti in rapida crescita e virulenta come cloni N67 (nigeriensis), 17XL, e YM di P. yoelii, clone di P. ANKA berghei, e DS clone di P. chabaudi Adami si traduce spesso in grave anemia e patologia nei topi, che possono causare un calo significativo della temperatura del corpo del mouse. Come risultato, i topi diventano meno infettivo per le zanzare (osservazioni non pubblicate). Tuttavia, la trasmissione di parassiti della malaria roditore è stato condotto con una dimensione standard di inoculo (10 ⁶ iRBC). E 'stato scoperto che berghei P. e P. yoelii sono trasmissibili alle zanzare da giorni 3 a 5 dopo di sangue fase indotta infezione nei topi ^17, mentre P. chabaudi chabaudi e P. chabaudi Adami sono trasmissibili alle zanzare il giorno 6 dopo il sangue fase infezioni indotte nei topi ^{16, 18.}

Fattori che influenzano la produzione di progenie ricombinante sono le proporzioni di gametociti dei due ceppi parentali nei topi. In teoria, la produzione massima di progenie ricombinante si verifica quando gametociti di entrambi i sessi dei cloni dei genitori sono in numero pari e di auto-fertilizzazione e la fecondazione avvengono alla stessa frequenza. In questa condizione, la metà dei zigoti risultanti saranno ibridi e il resto sarà costituito da parti uguali delle due linee parentali clone. Produzione di cloni progenie ricombinante sarà notevolmente ridotto quando la percentuale di gametociti è sbilanciata verso un clone dei genitori, portando a sproporzionati autofecondazione. Inoltre, i parassiti spesso hanno tassi di crescita diversi e possono avere diverse capacità nella produzione di gametociti ^{16, 19.} Pertanto, è necessario ottimizzare le proporzioni di parassiti dei genitori nella miscela da iniettare in topi per nutrire le zanzare.

Il tempo di clonare i parassiti dal sangue dopo la poppata zanzara è anche un fattore importante da considerare. E 'preferibile clonare la progenie della croce genetica quando parassitemia è compresa tra 0,1-1,0% (prima di troppi cicli di replicazione nel sangue) per evitare la clonazione cloni duplicati. Parassiti rapida o lenta crescita può venire fuori in gran numero in certi periodi di tempo, la clonazione e le cime di parassiti rapida o lenta crescita si concluderà con i cloni che hanno i fenotipi stesso.

In conclusione, l'esecuzione di incroci genetici con parassiti della malaria roditori è relativo facile e molto meno costosa di effettuare un incrocio genetico dell'essere umano parassita della malaria P. falciparum, che richiede l'infezione di un primate non umano. Ricombinante progenie degli incroci genetici sono utili strumenti per la costruzione di mappe di linkage genetico e per la mappatura di importanti tratti della malaria tra cui lo sviluppo del parassita, la resistenza ai farmaci, e virulenza.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.