Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Summary

Genetiska korsningar av parasiter gnagare malaria utförs genom att mata två genetiskt skilda parasiter till myggor. Rekombinant avkomma är klonade från mus blodet efter så att myggorna att bita infekterade möss. Denna video visar hur man kan producera genetiska korsningar av

Abstract

Variation i reaktion mot malariamedel och patogenicitet av malariaparasiter är av biologisk och medicinsk betydelse. Koppling kartläggning har lett till framgång i att identifiera gener eller loci bakom olika drag i malariaparasiter av gnagare ^1-3 och människor ^4-6. Malariaparasiten Plasmodium yoelii är en av många malaria arter isolerats från vilda afrikanska gnagare och har anpassats för att växa i laboratorier. Denna art återger många av de biologiska egenskaperna hos den mänskliga malariaparasiter, genetiska markörer som mikrosatellit och förstärkta fragmentet längd polymorfism (AFLP) markörer har också utvecklats för parasiten ^7-9. Således kan genetiska studier i parasiter gnagare malaria utföras som ett komplement till forskning om Plasmodium falciparum. Här visar vi de tekniker för att producera en genetisk kors i P. yoelii som först uppfunnen av Dr. David Walliker, Richard Carter, och kollegor vid University of Edinburgh ^10.

Genetisk kors i P. yoelii och andra gnagare malariaparasiter sker genom att infektera möss Mus musculus med ett inokulat som innehåller gametocyter av två genetiskt distinkta kloner som skiljer sig fenotyper av intresse och genom att låta myggor att livnära sig på den infekterade möss 4 dagar efter infektion. Förekomsten av manliga och kvinnliga gametocyter i musen blodet är mikroskopiskt bekräftas innan utfodring. Inom 48 timmar efter utfodring i midgut av mygga, det haploida gametocyter differentiera till manliga och kvinnliga könsceller, befrukta, och bilda en diploid zygot (bild 1). Under utvecklingen av en zygot till en ookinete verkar meios ske ^11. Om zygoten framställs genom korsbefruktning mellan könsceller från två genetiskt skilda parasiter, genetisk utbyte (kromosomala reassortment och cross-overs mellan de icke-systerkromatider av ett par av homologa kromosomer,. Fig. 2) kan förekomma, vilket resulterar i rekombination av genetiskt material på homolog loci. Varje zygot genomgår två på varandra kärnvapen divisioner, vilket leder till fyra haploida kärnor. En ookinete utvecklas ytterligare i en oocyst. När oocyst mognar, tusentals sporozoites (avkomman av korset) bildas och släpps ut i mygga hemoceal. Sporozoites skördas från spottkörtlar och sprutas in i en ny mus värd, där pre-erytrocyt och erytrocyt stadiet utveckling sker. Erytrocyt former är klonade och klassificeras med avseende på tecken särskilja föräldralinjer innan genetisk koppling kartläggning. Bekämpa infektion av enskilda föräldrarnas kloner utförs på samma sätt som produktionen av en genetisk kors.

Protocol

Aseptiska tekniker måste tillämpas på allt material som kommer att administreras till djur för att undvika oavsiktlig introduktion av exogena smittämnen på möss som kan förbrylla experimentella resultat.

1. Infektion av laboratoriemöss med Blood steg malariaparasiter

1. Vid rumstemperatur, tina två flaskor med de frysta blodparasiter skede malaria ska passeras. I detta exempel två gnagare malariaparasiten används stammar är Plasmodium yoelii yoelii och Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Montera en spruta med en 22-30 gauge (G) nålen och drag upp 400 mikroliter av sterila, farmaceutisk kvalitet PBS (pH 7,4).
3. Med samma spruta upprätta 100 mikroliter av upptinade infekterat blod, Vänd sprutan upp och ner tills innehållet är homogent blandade. (Valfritt: en pipett kan användas för att överföra PBS och infekterat blod i ett provrör innan de överförs i en spruta för injektion).
4. Injicera 200 mikroliter av parasit som innehåller lösningen direkt i bukhinnan som en mus. När du är klar, kassera sprutan i en behållare för vassa föremål. (Se även kompletterande material för underhåll av laboratorie-möss). I allmänhet är standard storleken på inokulatet mellan 100-500 mikroliter, beroende på nivåerna av parasitinfektioner i den ursprungliga frusna material.
5. Injicera två parasiten stammar som korsas i två möss vardera. Möss kommer att bli positiva mikroskopiskt 3 till 5 dagar efter injektioner. När parasitemias uppgå till mellan 1-5%, fortsätter till nästa steg.

2. Blandade Clone Infektion hos möss

1. Innan blandade klona infektion, samla in svansen blod från två givare möss infekterade med olika parasit stammar för mikroskopisk undersökning av Giemsa färgade tunna blodutstryk (Fig. 3) och för mätning av röda blodkroppar densitet (se kompletterande material för detaljerade förfaranden) .
2. Beräkna volymen av en fysiologisk koksaltlösning (1,5% w / v Trinatriumcitrat dihydrat, 0,85% w / v natriumklorid) och mus blod krävs för att producera ett inokulat blandning, med hjälp av parasitemia och röda blodkroppar mätningar densitet som erhållits tidigare.
3. Justera parasit lösning till en slutlig koncentration på en miljon infekterade röda blodkroppar per 100μl.
4. Kombinera infekterat blod från de två givarna i förhållandet 1:1 för att få en blandad-klon inokulat. När de två föräldrarna kloner skiljer sig i tillväxt, justera proportionerna av en snabbare växande föräldrar till ett mer långsamt växande föräldrarnas klon till 1:2 eller 1:5.
5. Injicera 100 mikroliter av det blandade provet i bukhinnan varje musen för att bli smittade. (Se också steg 3,9 för att bestämma antalet möss som injiceras)
6. Med denna metod, infektera två möss var och en med den enda moderstammarna. Den enda klonen infektioner kommer att kunna bestämma lyckad överföring av de två moderstammarna.

3. Utfodring Myggor

1. Förbered tre burar som innehåller 300-500 vuxna (män och kvinnor) Anopheles stephensi myggor varje, ålder 5-7 dagar efter uppkomst från puppor. Behållarna är täckt av ett nät säkert av en plast eller metall lock. Två burar är för utfodring om föräldraledighet, kloner, den tredje buren är för beredning av en genetisk kors.
2. Från och fyra dagar efter det blandade klon infektion, förbereda Giemsa-färgade tunna blodutstryk svans från den infekterade möss.
3. Undersök utstryk under ett mikroskop genom att skanna minst 50 mikroskopiska områden vid 1000x förstoring och avgöra om manligt och kvinnligt gametocyter är närvarande.
4. Manliga och kvinnliga gametocyter känns igen på grund av närvaron av stora vacuole och stora granulat (Fig. 3). Manliga och kvinnliga gametocyter har rosa och blå cytoplasma, respektive. Om gametocyter finns, följ steg 3,6.
5. Om gametocyter är frånvarande, hålla kontroll dagligen tills de visas. Om gametocyter finns, fortsätter följande steg.
6. Injicera 50 mikroliter av bedövningsmedel drog cocktail som innehåller 33 mg / ml ketamin och 3 mg / ml xylazin i bukhinnan på en mus att söva varje infekterad mus (per 20 gram mus kroppsvikt). Sista dosen av ketamin och xylazin är 82,5 och 7,5 mg / kg, respektive.
7. Placera möss nedåt på toppen av en bur med vuxna Anopheles stephensi myggor som har svultit i sockerförsörjningen i 24 timmar och låt myggor foder till 30 minuter utan avbrott.
8. Bibehåll myggor i en insectary under normala omständigheter (håller en jämn temperatur mellan 24-26 ° C, se även kompletterande metoderna för underhåll av laboratorie-myggor).
9. Använd en infekterad mus för varje 50-100 kvinnliga myggor. Euthanize möss omedelbart halsdislokation efter utfodring, medan möss är fortfarande under narkos.

4. Analysera Mosquito MidgUTS and Counting oocystor

1. Nio dagar efter utfodring, kommer myggen undersökas för oocystor i insekternas midgut. Förekomsten av oocystor i myggorna som livnär sig på en enda klon infekterade möss visar att gametocyter av de två moderstammarna är smittsamma.
2. Att dissekera en mygga midgut, använd en aspirator ansluten till en liten behållare för att samla in 5 till 10 infekterade myggor från buren.
3. Använda CO _2-gas, Bedöva myggor och överföra dem till ett glas petriskål på is. Separata och kasta manliga myggor. Antennerna av männen är märkbart bushier i jämförelse med honorna.
4. Fyll två sprutor med PBS och montera dem med 26 gauge halv tum (G ^½) nålar. Deposition ca 100 mikroliter av PBS från en spruta på en glasskiva.
5. Överföring från 5 till 10 sövda honmyggorna på droppe PBS och placera bilden på en dissekera mikroskop.
6. Genom att använda samma nålar, ta bort varje myggans vingar och ben, sedan hålla insekten på bröstkorgen och bakre delen av buken, dra kroppen isär tills midgut, en vit säckliknande kroppen släpps. Lossa midgut och kassera resten av kroppen.
7. Lägg till fler PBS på midgut om bilderna är torra. Den midgut kommer degenerera om låt torkat. Sätt ett lock glider över midguts.
8. Undersök midguts under ljusmikroskop vid 100x förstoring. Räkna antalet oocystor i varje midgut (Fig. 3). Oocystor känns igen så tjock vägg cirkulära strukturer som ligger på utsidan av midguts.
9. När du är klar, kassera sprutor, kanyler och bild i en behållare för vassa föremål.
10. Om oocystor är frånvarande i midguts, foder myggor med infekterade möss med ökat antal gametocyter och ger en längre matdags. Temperaturen är avgörande för detta steg. Se till att temperaturen är inställd på 24 till 26 ° C.

5. Samla Sporozoites från myggor genom centrifugering

1. Förbered sporozoiter Uppsamlingsrör så här: Klipp locket på en ren 0,5-mL centrifugrör och slå hål (0,1-0,2 mm i diameter) i botten av röret med hjälp av en flammade 19 G-nål.
2. Fyll 1 / 3 av röret med glasull. Sätt in filtret röret i en 1,5-mL provröret (en tub räcker att skörda sporozoites från ~ 100 myggor)
3. På dag 17 efter utfodring, samla in mygg (steg 4) från burar i en liten behållare med ett aspirator.
4. Använd CO _2-gas för att söva myggor.
5. Separera kvinnor från den manliga myggor. Överför sövs honmyggorna från behållaren till ett glas petriskål på is.
6. Förbered två sprutor med 26 G ^½ nålar fyllda med PBS. Deposition ca 100 mikroliter av PBS från en spruta på en glasskiva.
7. Överför myggor på ett objektglas. Ta bort myggor huvud, vingar, ben och mage under en dissekera mikroskop.
8. Använda spetsig pincett överföra thoraxes till 0,5 mL PBS i en 1,5-mL homogeniseringsblandare (mortel). Förvara thoraxes på is (sporozoiter förblir smittsam i 2-3 timmar).
9. Homogenisera thoraxes på is att släppa sporozoites från spottkörtlarna (se figur 3), och överför lysates (homogenat) i röret fyllt med glasull (steg från 5,1 till 5,2) med ett glas pipett.
10. Centrifugera i 10 till 20 sekunder vid 1000 rpm vid rumstemperatur.
11. Samla genomströmning (det renade sporozoiter suspension) med hjälp av en spruta med en 22-30 G-nål. (Valfritt: drop 10-50 mikroliter av genomströmning på en mikroskopisk bild, placera ett täckglas och visualisera lever sporozoites under en standard ljusmikroskop, 400X förstoring, se även figur 3)
12. Injicera ip 0,1-0,5 mL av sporozoiter suspensionen i möss (upp till 200.000 parasiter kan skördas från en enda mygga, se ref 12). I ett lyckat fall kommer djuret smittas 72 timmar efter en injektion.

6. Kloning Progeny med Limited Spädning

1. Sjuttiotvå timmar efter sporozoiter injektioner, samla in svansen blod från två givare möss infekterade med olika parasit stammar för mikroskopisk undersökning efter Giemsa färgning av tunna blodutstryk och för mätning av röda blodkroppar densitet (se kompletterande material för detaljerade förfaranden).
2. Välj en mus som visar ett 0,1 till 1% parasitemia och vars infekterade röda blodkropparna innehåller mestadels enstaka parasiter som givare för kloning förfarande. Upprepa steg 6,1 närmaste dagarna om möss är mikroskopiskt negativa. Om djuren inte är smittade inom 14 dagar, upprepa steg 2 till 5 och fastställa förekomsten av sporozoites i steg 5,11).
3. Späd den skördade svansen blod i en kall 1:01 lösning av kalvserum och däggdjur Ringers lösning (2,7 mM kaliumklorid, 1,8 mm kalciumklorid, 154 mm natriumklorid) i syfte att uppnå en konkoncentration på 0,6 till 1-infekterade röda blodkroppar per 100 mikroliter och lagra inokulatet på is. På detta sätt bör de flesta enskilda mus få antingen ett eller noll parasiter.
4. Intravenöst injicera 100 mikroliter av utspädd infekterat blod i varje 50 till 100 möss.
5. Fem till sju dagar senare, skärmen möss för förekomst av parasiter blod steg genom att undersöka Giemsa-färgade tunna blodutstryk. I ett lyckat experiment, blir 20-50% av de möss som blivit infekterade och kommer att visa parasitemia på 0,1-5,0% vid dag 8 efter infektion.

7. Karakterisering av avkomma med genetiska markörer

1. Samla 20 till 40 mikroliter av mus svans blod i en 1,5-mL mikrocentrifugrör som innehåller 0,2 ml kyld fysiologisk citrat koksaltlösning, vortex kort stund, och centrifugera i 3 min vid 3000 rpm vid rumstemperatur till pellets blodceller. Extrahera DNA omedelbart eller förvara pellets vid -80 ° C.
2. Förbered parasit DNA med en vanlig DNA-extraktion. För snabb isolering av DNA, använda en High Pure PCR kit mall förberedelse (Roche Applied Bioscience).
3. Rekombinant avkomma identifieras efter att genotypning med hjälp mikrosatelliten (MS) eller enstaka nukleotid polymorfism (SNP) på olika kromosomer som kan skilja de två moderstammarna av den genetiska korset. En förenklad metod använder en fluorescerande-märkta grundfärger för MS genotypning av P. yoelii kan användas (se ref 8,9).

8. Frysförvaring av blod steg malariaparasiter

1. Samla 0,5-1 ml av infekterat blod från hjärtat från en sövda mus med parasitemia på 5-20% i 5-10 ml kylt fysiologisk koksaltlösning.
2. Centrifugera i 5 min vid 2000 rpm vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
3. Tillsätt droppvis 2x volym Glycerolyte 57 lösning (Fenwal Laboratories) på blod pellets och blanda väl.
4. Överför suspensionen till cryotubes (0,2-0,5 ml per rör).
5. Förvara frysförvarade blodet vid -80 ° C (upp till 1 månad) eller i flytande kväve.

9. Representativa resultat:

I ett lyckat experiment, kommer 50-10% av de klonade linjer vara oberoende rekombinant avkomma.

Figur 1. En schematisk bild över livscykeln och genetiska händelser rekombination under en genetisk kors. Genetisk rekombination evenemang äger rum under den tidiga fasen av utvecklingen i mygga. Efter befruktningen av "haploida" manliga och kvinnliga könsceller med olika genetisk bakgrund i midgut av mygga, är "diploida" zygotes bildas. Den zygoten utgör det enda diploida stadiet av parasiten livscykel, meios följande inom 12 timmar av gödsling, och alla efterföljande steg i mygga och däggdjur kvar haploida. Den resulterande zygotes utvecklas till ookinetes och oocystor. Tillväxt och mitotiska uppdelning av varje oocyst producerar tusentals sporozoites, som släpps ut i myggor "hemoceal. De sporozoites att migrera till spottkörtlar är i stånd att överföras till ett däggdjur värd, där utvecklingen av levern och röda blodkroppar stadier celler sker. Under den röda cykler blodkroppar, kan vissa parasiter differentiera till mogna manliga och kvinnliga gametocyter. Parasiten livscykeln är klar när dessa gametocyter tas upp av en annan mygga, vidmakthåller överföring.

Figur 2. Arv av nukleära gener i malariaparasiter och produktion av rekombinanta avkomma. Genetisk rekombination kan genereras via kromosomala reassortment eller crossover händelser. Homozygota avkommor som produceras av selfing mellan könsceller av samma föräldra klon 1 eller 2 (A och D), respektive. B) Heterozygot avkommor som produceras av korsbefruktning mellan könsceller av de två olika föräldra kloner, rekombinant kärnor (blå ovaler) som bildas av kromosomal reassortment ensam. C) Heterozygot avkomma produceras från korsbefruktning mellan könsceller av de två olika förälder kloner, rekombinant kärnor (röda ovaler) bildas genom delning mellan de icke-systerkromatider av homologa kromosomer.

Figur 3. Morfologi gnagare malariaparasiten Plasmodium yoelii. A) ring skede B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) omogna män gametocyte, F) mogna män gametocyte, G) omogna kvinnliga gametocyte, H) mogna kvinnliga gametocyte, I) midgut med oocystor på dag 10 efter utfodring (mogna oocystor anges med pilar, 200x förstoring), J) mygga spottkörtlarna (100x förstoring), K) sporozoites (400x förstoring).

Discussion

Vi visar tekniker för produktion av en genetisk kryss i gnagare malaria Plasmodium yoelii, som även gäller för produktionen av genetisk kors i andra gnagare malarias. Infektioner i möss med samma föräldrapenning kloner är vanligen utförs för att bestämma en framgångsrik överföring av föräldrarnas parasiter att se till att föräldrarna är kompetenta att producera funktionella könsceller innan du utför ett kors.

Framgångsrik överföring via en mygga påverkas av flera faktorer, inklusive temperatur insectary, arter av gnagare används malariaparasiter, och de doser av blod steg parasit (inokulat storlek). Även överföring av P. berghei uppnås normalt vid 19-21 ° C ^13, överföring av P. yoelii och P. chabaudi rutinmässigt utförs vid 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes av P. berghei misslyckas med att utvecklas till oocystor vid temperaturer lägre än 16 ° C eller högre än 24 ° C ^15. Förutom temperatur kan inokulatets storlek påverka förökningshastighet av malariaparasiter i blodet. Även injektioner av ett stort inokulatets storlek (5 x 10 ⁶ iRBC eller fler) kommer att ge högre parasitemia i mycket tidiga stadier av infektion, är det inte nödvändigtvis leda till större antal gametocyter eller högre smittsamhet till myggor. Gadsby m.fl. (2009) ¹⁶ visade att gametocyter av P. chabaudi Adami finns i blodet från dag 3 till dag 20 (topp vid dag 13) efter infektion med 1 x 10 ⁶ iRBC, men det är dag 6 efter infektion är den enda dag då myggor smittas. Även administrationen av ett stort inokulat storlek på snabbväxande och virulenta parasit stammar som kloner N67 (nigeriensis), 17XL och YM av P. yoelii, klon ANKA av P. berghei, och DS klon av P. chabaudi Adami resulterar ofta i svår anemi och patologi på möss, vilket kan leda till en betydande minskning av mus kroppstemperatur. Som ett resultat, möss blir mindre infektiös för mygg (opublicerade observationer). Ändå har överföring av parasiter gnagare malaria utförts med en standard inokulatets storlek (10 ⁶ iRBC). Det har konstaterats att P. berghei och P. yoelii kan överföras till myggor från dagar från 3 till 5 efter blod skede framkallade infektion hos möss ^17, medan P. chabaudi chabaudi och P. chabaudi Adami är endast överföras till myggor på dag 6 efter blod steg-inducerade infektioner hos möss ^{16, 18.}

Faktorer som påverkar produktion av rekombinanta avkomma inkluderar proportioner gametocyter av de två moderstammarna hos möss. I teorin uppstår den maximala produktion av rekombinanta avkomma när gametocyter av båda könen i föräldrarnas kloner är lika många och självbefruktning och korsbefruktning sker vid samma frekvens. Enligt detta villkor, kommer hälften av den resulterande zygotes vara hybrider och resten kommer att bestå av lika delar av de två föräldrarnas klon linjer. Produktion av rekombinanta avkomma kloner kommer att kraftigt reduceras när andelen gametocyter är partisk mot en föräldra klon, vilket leder till oproportionerliga självbefruktning. Dessutom parasiter har ofta olika tillväxttakt och kan ha olika förmåga att producera gametocyter ^{16, 19.} Därför är det nödvändigt att optimera proportionerna av föräldrarnas parasiter i blandningen som ska sprutas in i möss mygga utfodring.

Tiden att klona parasiter från blodet efter mygga utfodring är också en viktig faktor att beakta. Det är bättre att klona avkomman av den genetiska korset när parasitemia är mellan 0,1-1,0% (innan alltför många cykler av replikering i blodet) för att undvika kloning dubbla kloner. Snabbt eller långsamt växande parasiter kan komma ut i stort antal vid vissa perioder, och kloning vid toppar i snabbt eller långsamt växande parasiter kommer att sluta med kloner med samma fenotyper.

Sammanfattningsvis utföra genetiska korsningar av parasiter gnagare malaria är relativt enkelt och mycket billigare än att genomföra en genetisk korsning av det mänskliga malariaparasiten s. falciparum, som kräver infektion i en icke-mänskliga primater. Rekombinant avkomma av den genetiska korsningar är användbara verktyg för konstruktion av genetisk koppling kartor och för kartläggning av viktiga malaria egenskaper inklusive parasit utveckling, läkemedelsresistens och virulens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.