بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Summary

يتم تنفيذ الصلبان الجينية لطفيليات الملاريا من خلال إطعام القوارض two الطفيليات متميزة وراثيا لالبعوض. يتم استنساخ المؤتلف من سلالة الدم الماوس بعد السماح لدغة البعوض الفئران المصابة. هذا الفيديو يبين كيفية إنتاج الصلبان الجينية

Abstract

الاختلاف في الاستجابة للأدوية المضادة للملاريا وتسببها طفيليات الملاريا من بيولوجية والأهمية الطبية. وقد أدى رسم خرائط لتحديد العلاقة ناجحة من الجينات أو الصفات الكامنة مواضع مختلفة في طفيليات الملاريا من القوارض والبشر ^{1-3 و 4-6.} طفيلي الملاريا المنجلية yoelii هي واحدة من العديد من أنواع الملاريا المعزولة من القوارض البرية وأفريقيا وقد تم تكييفها لتنمو في المختبرات. يستنسخ هذا النوع في كثير من الخصائص البيولوجية للطفيليات الملاريا البشرية ، وقد تم أيضا علامات وراثية مثل الصغرية وتضخيم تعدد الأشكال طول جزء علامات (AFLP) وضعت للطفيلي ^7-9. وبالتالي ، يمكن إجراء دراسات الجينية في طفيليات الملاريا القوارض لاستكمال البحث في المنجلية. هنا ، علينا أن نظهر للتقنيات لإنتاج عبر الجينية في P. yoelii التى كانت أول من الدكاترة. Walliker ديفيد كارتر ، ريتشارد ، وزملاؤه في جامعة أدنبرة ^10.

الجينية الصلبان في P. وتجرى yoelii وغيرها من طفيليات الملاريا التي تصيب الفئران القوارض العضلة المصحف مع اللقاح يحتوي على اثنين من الحيوانات المستنسخة gametocytes متميزة وراثيا التي تختلف في الظواهر من الاهتمام والبعوض عن طريق السماح لتتغذى على الفئران المصابة بعد 4 ايام من العدوى. وأكد وجود المجهر gametocytes الذكور والإناث في الدم الماوس قبل التغذية. في غضون 48 ساعة بعد الرضاعة ، في المعي المتوسط ​​من البعوض ، علما gametocytes فرداني تفرق في الأمشاج الذكور والإناث ، وتسميد ، وتشكيل لاقحة مضاعفا (الشكل 1). أثناء وضع البويضة الملقحة إلى ookinete ، ويبدو أن الانقسام الاختزالي تحدث ^11. إذا مشتق اقحة من خلال التلاقح بين الأمشاج من الطفيليات متميزتين وراثيا ، وتبادل الوراثية (الكروموسومات والاندماج تلك المبالغ عبر بين شقا الصبغي غير شقيقة زوج من الكروموزومات المتماثلة ؛ الشكل رقم 2) قد تحدث ، مما أدى إلى إعادة التركيب المادة الوراثية في مواضع مثلي. يخضع كل اقحة شعبتين النووية المتعاقبة ، مما أدى إلى فرداني النوى الأربعة. لمزيد من ookinete يتطور الى البيضة المتكيسة. بمجرد أن تنضج البيوض المتكيسة ، تتشكل من آلاف sporozoites (على سلالة الصليب) وأطلق سراحه في hemoceal البعوض. ويتم حصاد Sporozoites من الغدد اللعابية وحقنها في الفئران استضافة جديدة ، حيث قبل الكريات الحمراء والكريات الحمراء تطوير المرحلة تأخذ مكان. يتم استنساخ أشكال الكريات الحمر وتصنيفها فيما يتعلق الشخصيات المميزة للخطوط الوالدين قبل رسم خرائط الربط الجينية. تتم العدوى من الحيوانات المستنسخة السيطرة الأبوية الفردية في بنفس طريقة إنتاج عبر الجينية.

Protocol

ويجب تطبيق تقنيات التطهير لجميع المواد التي سوف تدار في الحيوانات لتفادي الاستخدام غير المتعمد للعوامل الخارجية في الفئران المعدية التي يمكن أن نخلط النتائج التجريبية.

1. إصابة فئران المختبر مع طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة

1. في درجة حرارة الغرفة ، وذوبان الجليد أن عبرت two قارورة تحتوي على طفيليات الدم الملاريا مرحلة المجمدة. في هذا المثال ، واثنين من سلالات طفيل الملاريا القوارض المستخدمة هي المتصورة المنجلية وyoelii yoelii nigeriensis yoelii.
2. تناسب المحاقن مع إبرة 22-30 (G) ومقياس رسم 400 ميكرولتر من العقيمة ، برنامج تلفزيوني الصف الصيدلانية (7.4 درجة الحموضة).
3. استخدام الحقنة نفسها ، ووضع 100 ميكرولتر من دم المصابين إذابة ؛ عكس المحقنة صعودا وهبوطا حتى يتم خلط متجانس المحتوى. (اختياري : يمكن استخدام ماصة لنقل الدم الملوث وPBS في أنبوب جمع قبل نقل إلى حقنة لحقن).
4. ضخ 200 ميكرولتر من الطفيليات التي تحتوي على حل مباشرة في الصفاق على فأرة الحاسوب. عند الانتهاء ، رفض بن لحقنة في الحادة. (انظر أيضا مواد تكميلية للصيانة من الفئران المختبرية). عموما ، فإن حجم قياسي من اللقاح ما بين 100-500 ميكرولتر ، اعتمادا على مستويات العدوى الطفيلية في المواد المجمدة الأصلي.
5. حقن سلالات الطفيلي اثنين يتم عبروا الى قسمين كل الفئران. وسوف تصبح إيجابية الفئران المجهر 3 إلى 5 أيام بعد الحقن. عندما تصل إلى ما بين 1-5 parasitemias ٪ ، انتقل إلى الخطوة التالية.

2. العدوى المختلطة استنساخ من الفئران

1. قبل استنساخ عدوى مختلطة ، وجمع الدم من ذيل الفئران المصابة two المانحة مع السلالات المختلفة للطفيلي بواسطة الفحص المجهري ملطخة بالدم مسحات بالغيمزا رقيقة (الشكل 3) ، ولقياس كثافة خلايا الدم الحمراء (انظر المواد التكميلية لإجراءات تفصيلية) .
2. حساب حجم المياه المالحة من الفسيولوجية (1.5 ٪ ث / ت سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدروكسيل ، 0.85 ٪ W / V كلوريد الصوديوم) والدم الماوس المطلوبة لإنتاج خليط قيحة ، وذلك باستخدام تطفلن الدم الحمراء وقياسات كثافة خلايا الدم التي تم الحصول عليها في وقت سابق.
3. ضبط الحل الطفيلي إلى تركيز واحدة أخيرة مليون مصاب في خلايا الدم الحمراء 100μl.
4. تجمع الدم من المتبرعين المصابين اثنين في نسبة 1:1 للحصول على اللقاح مختلط استنساخ. عند استنساخ two الوالدية تختلف في معدل النمو ، وضبط نسب ل. الأسرع نموا الوالدين لاستنساخ تباطؤ النمو أو الوالدين ل01:02 01:05
5. ضخ 100 ميكرولتر من عينة مختلطة في كل البريتوني الماوس لتكون مصابة. (انظر أيضا الخطوة 3.9 لتحديد عدد من الفئران التي حقنت)
6. باستخدام هذا الأسلوب ، تصيب فأرتان مع كل السلالات الأبوية واحد. فإن العدوى واحد استنساخ تسمح بتحديد انتقال الناجح لسلالتين الأبوية.

3. تغذية البعوض

1. إعداد ثلاثة أقفاص تحتوي على 300-500 الكبار (ذكور واناث) stephensi الأنوفيلة البعوض كل من ، عصر ما بعد 5-7 أيام من ظهور العذراء. وتغطي هذه الحاويات مع المعاوضة آمن بها غطاء من البلاستيك أو المعدن. هي لاثنين من أقفاص الحيوانات المستنسخة التي تتغذى على الوالدين ؛ القفص الثالث لإعداد عبر الجينية.
2. تبدأ بعد أربعة أيام من العدوى المختلطة استنساخ ، وإعداد بالغيمزا الملطخة بالدم الذيل رقيقة مسحة من الفئران المصابة.
3. فحص مسحات تحت المجهر من خلال فحص ما لا يقل عن 50 حقلا المجهرية في التكبير 1000x وتحديد ما إذا gametocytes الذكور والإناث موجودة.
4. gametocytes الذكور والإناث والتمييز بسبب وجود فجوة كبيرة وحبيبات كبيرة (الشكل 3). gametocytes الذكور والإناث والسيتوبلازم الوردي والأزرق ، على التوالي. إذا gametocytes موجودة ، اتبع الخطوة 3.6.
5. إذا gametocytes غائبة ، والحفاظ على الرصد اليومي حتى تظهر. إذا gametocytes موجودة ، والاستمرار في الخطوة التالية.
6. ضخ 50 ميكرولتر من مخدر كوكتيل المخدرات التي تحتوي على 33 ملغ / مل من الكيتامين و 3 ملغ / مل من زيلازين في الصفاق من الماوس لتخدير كل فأر مصاب (20 في المائة جرام من وزن الجسم الماوس). الجرعة النهائية من الكيتامين وزيلازين هي 82.5 و 7.5 ملغ / كلغ على التوالي.
7. مكان الفئران على وجهه على أعلى قفص يحتوي على الكبار الأنوفيلة البعوض stephensi التي تم حرمانها من امدادات السكر لمدة 24 ساعة والسماح للبعوض لتغذية لمدة 30 دقيقة دون انقطاع.
8. الحفاظ على البعوض في insectary في ظل ظروف قياسية (يتم الاحتفاظ درجة الحرارة بين 24-26 درجة مئوية ، وانظر أيضا أساليب تكميلية لصيانة المختبرات البعوض).
9. استخدام واحد عن كل فأر مصاب البعوض 5-10 الإناث. الموت ببطء الفئران مباشرة بعد خلع عنق الرحم في حين أن تغذية الفئران لا يزال تحت التخدير.

4. تشريح البعوض MidgUTS والبيضات العد

1. بعد تسعة أيام من التغذية ، سيتم فحص البعوض للالبيضات في المعي المتوسط ​​للحشرة. وجود البعوض في البيضات التي تتغذى على واحد استنساخ الفئران المصابة يشير إلى أن gametocytes من سلالتين الأبوية معدية.
2. تشريح البعوض المعي المتوسط ​​، استخدام شفاطة متصلة وعاء صغير لجمع 5-10 البعوض المصابة من القفص.
3. باستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون ₂ ، تخدير البعوض ونقلها إلى طبق بيتري الزجاج على الجليد. وتجاهل منفصلة ذكور البعوض. هوائيات من الذكور بشكل ملحوظ bushier بالمقارنة مع الإناث.
4. ملء two المحاقن مع برنامج تلفزيوني ودمجها مع قياس 26 بوصة ونصف ^(½ G) الإبر. الودائع حوالي 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من حقنة على شريحة زجاجية.
5. نقل 5-10 إناث البعوض تخدير على الهبوط من برنامج تلفزيوني ومكان الشريحة على مجهر تشريح.
6. استخدام إبر نفسه ، وإزالة كل أجنحة البعوض والساقين ، وبعد ذلك ، عقد الحشرة في الصدر والبطن الخلفي ، وسحب الجسم بعيدا حتى المعي المتوسط ​​، بيضاء تشبه كيس الجسم ، ويتم تحريرها. فصل المعي المتوسط ​​وتجاهل بقية الجسم.
7. إضافة المزيد من PBS على المعي المتوسط ​​إذا الشرائح جافة. سوف تتدهور إذا ترك المعي المتوسط ​​المجففة. وضع غطاء على زلة midguts.
8. دراسة midguts تحت المجهر في ضوء التكبير 100X. عد الأرقام من البيضات في كل المعى المتوسط ​​(الشكل 3). البيضات يتم التعرف على الجدران سميكة بنية دائرية التي تقع على السطح الخارجي للmidguts.
9. عند الانتهاء ، والتخلص من المحاقن والإبر ، والانزلاق في بن الحادة.
10. إذا البيضات غائبة في midguts والأعلاف البعوض مع الفئران المصابة مع ارتفاع عدد gametocytes وإعطاء وقت أطول للتغذية. درجة الحرارة الحرجة لهذه الخطوة. تأكد من ضبط درجة الحرارة عند درجة مئوية 24-26

5. جمع Sporozoites من البعوض بواسطة الطرد المركزي

1. إعداد أنابيب جمع حيوان بوغي على النحو التالي : قطع غطاء أنبوب الطرد المركزي نظيفة 0.5 مل وكمة ثقب (0،1-0،2 مم) في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام إبرة ملتهب G 19.
2. ملء 1 / 3 من الأنبوب مع الصوف الزجاجي. إدراج أنبوب تصفية في أنبوب جمع 1.5 مل (أنبوب واحد يكفي لsporozoites الحصاد من البعوض 100 ~)
3. على تغذية يوم آخر 17 ، وجمع البعوض (الخطوة 4) من الأقفاص في وعاء صغير باستخدام الشافطة.
4. استخدام غاز ثاني أكسيد الكربون ₂ لتخدير البعوض.
5. فصل الاناث عن الذكور في البعوض. نقل البعوض تخدير الإناث من الحاوية على طبق بيتري الزجاج على الجليد.
6. إعداد two المحاقن مع الإبر 26 ^½ G مليئة برنامج تلفزيوني. الودائع حوالي 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من حقنة على شريحة زجاجية.
7. نقل البعوض على شريحة المجهر. إزالة رأس البعوض "، وأجنحة والساقين والبطن وتشريح تحت المجهر.
8. باستخدام غرامة ذات الرؤوس ملقط نقل الصدور في برنامج تلفزيوني 0.5 مل في الخالط 1.5 مل (هاون ومدقة). تخزين الصدور على الجليد (حيوان بوغي تبقى معدية لمدة 2-3 ساعة).
9. التجانس في الصدور على الجليد لاطلاق سراح sporozoites من الغدد اللعابية (انظر الشكل 3) ، ونقل lysates (الخليط) في أنبوب مملوء الصوف الزجاجي (الخطوة 5،1-5،2) باستخدام ماصة الزجاج.
10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 إلى 20 ثانية في 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
11. جمع التدفق من خلال (تعليق حيوان بوغي المنقى) باستخدام حقنة بإبرة G 22-30. (اختياري : قطرة 10-50 ميكرولتر من التدفق من خلال الشكل ، على شريحة مجهرية ، ضع غطاء الانزلاق وتصور sporozoites يعيشون تحت المجهر الخفيفة القياسية ، 400X التكبير ، وانظر أيضا 3)
12. حقن IP 0،1-0،5 مل من تعليق حيوان بوغي في الفئران (يمكن حصاده تصل إلى 200000 من البعوض طفيليات واحد ، وانظر المرجع 12). في قضية ناجحة ، سوف يصاب الحيوان 72 ساعة بعد الحقن.

6. النسل الاستنساخ باستخدام التخفيف المحدود

1. اثنان وسبعون ساعة بعد حقن حيوان بوغي ، وجمع الدم من ذيل الفئران المصابة two المانحة مع السلالات المختلفة للطفيلي بعد الفحص المجهري تلطيخ بالغيمزا من مسحات الدم ورقيقة لقياس كثافة خلايا الدم الحمراء (انظر المواد التكميلية لإجراءات تفصيلية).
2. اختيار عرض على الماوس تطفلن الدم 0،1-1 ٪ وإصابة خلايا الدم الحمراء تحتوي على طفيليات واحد وغالبا ما تكون الجهات المانحة لإجراء الاستنساخ. كرر الخطوة 6.1 الأيام المقبلة إذا الفئران هي المجهر سلبية. إذا لم يتم إصابة الحيوانات في غضون 14 أيام ، كرر الخطوة 2 إلى 5 و تحديد وجود sporozoites في الخطوة 5.11).
3. تمييع الدم الذيل المقطوع في حل 01:01 الباردة حل العجل رينغر المصل والثدييات و(2.7 ملي مول كلوريد البوتاسيوم ، كلوريد الكالسيوم 1،8 مم ، 154 مم كلوريد الصوديوم) وذلك للوصول الى يخدعوحدانية من 0،6-1 خلايا الدم الحمراء المصابة لكل 100 ميليلتر ، وتخزين اللقاح على الجليد. في هذه الطريقة ، ينبغي معظم الماوس الفردية تتلقى واحد أو صفر الطفيليات.
4. حقن في الوريد 100 ميكرولتر من الدم الملوث المخفف في كل من 50 إلى 100 الفئران.
5. خمسة إلى سبعة أيام في وقت لاحق ، وشاشة الفئران عن وجود الطفيليات في الدم عن طريق فحص المرحلة بالغيمزا الملطخة بالدم مسحة رقيقة. في تجربة ناجحة ، يصاب 20-50 ٪ من الفئران ، وسوف تظهر تطفلن الدم من 0،1-5،0 ٪ في آخر يوم 8 العدوى.

7. توصيف النسل باستخدام علامات وراثية

1. جمع 20-40 ميكرولتر من الدم ذيل فأر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على 0.2 مل من محلول سترات مبردة الفسيولوجية المالحة ، لفترة وجيزة الدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 3000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لخلايا كريات الدم. استخراج الحمض النووي على الفور أو في الحفاظ على بيليه -80 درجة مئوية.
2. إعداد طفيل DNA باستخدام أي استخراج الحمض النووي القياسية الأساليب. لعزل الحمض النووي السريع ، واستخدام القالب PCR السامية الصرفة إعداد مجموعة (روش العلوم البيولوجية التطبيقية).
3. ويتم تحديد النسل بعد المؤتلف التنميط الجيني باستخدام الصغرية (MS) ، أو تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (SNP) على الكروموسومات المختلفة التي يمكن التفريق بين سلالتين من الوالدين الصليب الجينية. وهناك طريقة واحدة مبسطة باستخدام بادئات الفلورسنت ذات العلامات التنميط الجيني لمرض التصلب العصبي المتعدد من P. ويمكن استخدام yoelii (انظر المرجع 8،9).

8. الحفظ بالتبريد من طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة

1. مبردة جمع 0،5-1 مل من الدم الملوث عن طريق إجراء بزل القلب من الماوس مع تخدير تطفلن الدم من 50-20 ٪ في 50-10 مل محلول ملحي الفسيولوجية.
2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف.
3. إضافة قطرة من الحكمة حجم 2X من حل 57 Glycerolyte (Fenwal مختبرات) على كريات الدم ومزيج جيد.
4. نقل إلى تعليق cryotubes (0،2-0،5 مل في أنبوب).
5. تخزين الدم في cryopreserved -80 درجة مئوية (ما يصل إلى 1 في الشهر) ، أو في النيتروجين السائل.

9. ممثل النتائج :

في تجربة ناجحة ، وسوف 5-10 ٪ من خطوط المستنسخة تكون ذرية المؤتلف مستقلة.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي لدورة الحياة والأحداث خلال بالتعديل الوراثي عبر الجينية. أحداث بالتعديل الوراثي ستجري خلال المرحلة الأولى من التطوير في البعوض. بعد إخصاب الأمشاج "فرداني" من الذكور والإناث من خلفيات وراثية مختلفة في المعي المتوسط ​​في البعوض ، ويتم تشكيل "مضاعفا" بيضات ملقحة. لاقحة يشكل مرحلة ضعفاني فقط من دورة حياة الطفيل ؛ الانقسام الاختزالي في غضون 12 ساعة بعد الإخصاب ، وجميع مراحل لاحقة في البعوض والثدييات يظل فرداني. وأدى تطوير بيضات ملقحة في ookinetes والبيضات. النمو والانقسام الإنقسامية كل البيضة المتكيسة تنتج الآلاف من sporozoites ، والتي تم إصدارها في hemoceal البعوض. sporozoites تلك التي تهاجر إلى الغدد اللعابية هي في وضع يسمح لها أن تنتقل إلى مضيف الثدييات ، حيث تطور الكبد وخلايا الدم الحمراء مراحل تأخذ مكان. أثناء دورات خلايا الدم الحمراء ، يمكن لبعض الطفيليات تفرق في ناضجة gametocytes الذكور والإناث. اكتمال دورة حياة الطفيل عندما تؤخذ هذه gametocytes بنسبة آخر انتقال البعوض إلى إدامته.

الشكل 2. راثة الجينات النووية في طفيليات الملاريا وإنتاج ذرية المؤتلف. يمكن أن تتولد من خلال بالتعديل الوراثي الاندماج تلك الكروموسومات أو الأحداث كروس. نسل متماثل التي تنتجها إخصاب ذاتي الأمشاج بين الوالدين من استنساخ نفسه 1 أو 2 (A و D) ، على التوالي. B) ذرية متخالف التي تنتجها تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأبوية مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الزرقاء) التي يشكلها الاندماج تلك الكروموسومات وحدها. C) التي تنتج من ذرية متخالف تلاقح بين الأمشاج من الحيوانات المستنسخة two الأصل مختلفة ، نوى المؤتلف (الاهليليجات الحمراء) التي يجري تشكيلها من قبل عمليات الانتقال بين شقا الصبغي غير شقيقة الكروموزومات المتماثلة.

الشكل 3. المورفولوجيا من القوارض yoelii الملاريا المنجلية الطفيلي. أ) المرحلة الطوق ، B) أتروفة ، C) المتقسمة ، D) merozoites ، E) العرسية الذكور غير ناضجة ، F) العرسية الذكور الناضجة ، G) العرسية الإناث غير ناضجة ، H) العرسية الإناث الناضجة ، I) المعى المتوسط ​​مع البيضات في آخر 10 يوما تغذية (البيضات الناضجة المشار إليها بواسطة الأسهم ؛ 200X التكبير) ، J) الغدد اللعابية للبعوض (التكبير 100X) ، K) sporozoites (400X التكبير).

Discussion

نبدي تقنيات لإنتاج عبر الجينية في الملاريا المنجلية yoelii القوارض ، وهو ينطبق أيضا على الإنتاج من الصلبان الجينية في malarias القوارض الأخرى. تتم عادة التهابات استنساخ الفئران مع الوالدين واحد لتحديد انتقال ناجحة للطفيليات الوالدين لضمان أن الوالدين هما المختصة في إنتاج الأمشاج وظيفية قبل تنفيذ الصليب.

يتأثر انتقال ناجحة من خلال البعوض عن عوامل متعددة بما في ذلك درجة حرارة insectary ، نوعا من طفيليات الملاريا القوارض المستخدمة ، وجرعة من الدم في مرحلة الطفيلي (قيحة الحجم). بينما حققت عادة انتقال berghei P. 19-21 درجة مئوية في ¹³ ، ونقل P. تتم بشكل روتيني وyoelii chabaudi P. 23-25 ​​درجة مئوية في ^14. Ookinetes من P. berghei لا تتطور إلى البيضات في درجات حرارة أقل من 16 درجة مئوية أو أعلى من 24 درجة مئوية ^15. بالإضافة إلى درجة الحرارة ، ويمكن أن تؤثر على حجم قيحة معدل تكاثر طفيليات الملاريا في الدم. على الرغم من حقن اللقاح من حجم كبير (5 × 10 ⁶ iRBC أو أكثر) سيحقق أعلى تطفلن الدم في مراحل مبكرة جدا من المرض ، فإنه لا يؤدي بالضرورة إلى أعداد أكبر من gametocytes العدوى إلى أعلى أو البعوض. وأظهرت Gadsby وآخرون (2009) أن ¹⁶ من gametocytes P. chabaudi آدمي موجودة في الدم من يوم 3 إلى يوم 20 (الذروة في اليوم 13) إصابة آخر من 1 × 10 ⁶ iRBC ، ولكن العدوى يوم آخر 6 هو فقط اليوم الذي يصبح البعوض المصابة. أيضا ، وإدارة حجم كبير من سلالات قيحة الطفيليات التي تنمو بسرعة وشراسة مثل استنساخ N67 (nigeriensis) ، 17XL ، وYM من yoelii P. ، أنكا من استنساخ P. berghei ، ونسخة من DS P. chabaudi آدمي غالبا ما يؤدي إلى فقر الدم الحاد وأمراض في الفئران ، والذي يمكن ان يؤدي الى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم الماوس. نتيجة لذلك ، تصبح أقل الفئران المعدية للبعوض (الملاحظات غير منشورة). ومع ذلك ، لم يجر انتقال طفيليات الملاريا القوارض بحجم قيحة القياسي (10 ⁶ iRBC). وقد وجد أن P. berghei وP. yoelii تنتقل إلى البعوض من 3 إلى 5 أيام بعد الإصابة التي يسببها المرحلة الدم في الفئران ¹⁷ ، في حين P. chabaudi chabaudi وP. آدمي chabaudi تنتقل فقط على البعوض في يوم 6 بعد مرحلة العدوى التي يسببها الدم في الفئران ^{16 ، 18.}

العوامل التي تؤثر على إنتاج ذرية المؤتلف وتشمل نسب gametocytes من سلالتين الوالدية في الفئران. من الناحية النظرية ، لإنتاج أقصى ذرية المؤتلف يحدث عندما gametocytes من كلا الجنسين من الحيوانات المستنسخة الأبوية في عدد متساو الذاتي والتسميد والتلاقح تحدث في نفس التردد. تحت هذا الشرط ، سيكون من نصف الناتج بيضات ملقحة الهجينة والباقي سوف تتكون من نسب متساوية من سطرين استنساخ الأبوية. وسيتم إنتاج نسل الحيوانات المستنسخة المؤتلف تقلص إلى حد كبير عند نسبة منحازة gametocytes في اتجاه واحد استنساخ الوالدين ، مما يؤدي إلى غير متكافئ الذاتي الإخصاب. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون الطفيليات معدلات النمو المختلفة ، وربما مختلفة في القدرة المنتجة gametocytes ^{16 و 19.} لذا ، فمن الضروري لتحسين نسب الطفيليات الأبوية في الخليط ليتم حقنه في الفئران لتغذية البعوض.

الوقت لاستنساخ الطفيليات من الدم بعد الرضاعة البعوض هو أيضا عامل هام للنظر فيها. فمن الأفضل أن استنساخ سلالة الصليب عند تطفلن الدم الوراثية بين 0،1-1،0 ٪ (قبل دورات كثيرة جدا من النسخ المتماثل في الدم) لتجنب تكرار استنساخ الحيوانات المستنسخة. قد الطفيليات سريعة أو بطيئة النمو الخروج بأعداد كبيرة في فترات معينة من الزمن ، والاستنساخ في قمم الطفيليات سريعة أو بطيئة النمو في نهاية المطاف مع الحيوانات المستنسخة لديها نفس الظواهر.

في الختام ، وأداء الصلبان الوراثية باستخدام طفيليات الملاريا القوارض نسبية سهلة وأرخص بكثير من أداء عرضية الوراثية للطفيلي الملاريا P. الإنسان المنجلية ، وهو ما يتطلب وجود عدوى الرئيسيات غير البشرية. المؤتلف سلالة الصلبان الجينية هي أدوات مفيدة لبناء الخرائط الجينية والربط لرسم خرائط للملاريا الصفات الهامة بما في ذلك تطوير الطفيلي ، ومقاومة العقاقير ، والفوعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.