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Immunology and Infection

Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

doi: 10.3791/2365 Published: January 3, 2011

Summary

Croisements génétiques des parasites du paludisme chez les rongeurs sont effectuées en alimentant deux des parasites génétiquement distinctes pour les moustiques. Recombinant progéniture clonée à partir de sang de souris après avoir laissé les moustiques de mordre des souris infectées. Cette vidéo montre comment produire des croisements génétiques

Abstract

Variation de la réponse aux médicaments antipaludiques et dans la pathogénicité des parasites du paludisme est de l'importance biologique et médicale. Cartographie de liaison a conduit à l'identification réussie de gènes ou loci sous différents traits de parasites du paludisme des rongeurs 1-3 et humains 4-6. Le parasite du paludisme Plasmodium yoelii est l'une des nombreuses espèces de paludisme isolé de rongeurs africains sauvages et a été adapté à croître dans les laboratoires. Cette espèce se reproduit de nombreuses caractéristiques biologiques des parasites du paludisme humain; marqueurs génétiques tels que des microsatellites et amplifié fragment length polymorphism (AFLP) ont également été développés pour le parasite 7-9. Ainsi, les études génétiques des parasites du paludisme des rongeurs peuvent être effectués pour compléter les recherches sur Plasmodium falciparum. Ici, nous montrons les techniques de production d'un croisement génétique de P. yoelii qui ont d'abord mis au point par les Drs. David Walliker, Richard Carter, et ses collègues de l'Université d'Edimbourg 10.

Croisements génétiques de P. yoelii et autres parasites du paludisme chez les rongeurs sont menées en infectant les souris Mus musculus avec un inoculum contenant des gamétocytes de deux clones génétiquement distincts qui diffèrent dans les phénotypes d'intérêt et en permettant aux moustiques de se nourrir de souris infectées quatre jours après l'infection. La présence de gamétocytes mâles et femelles dans le sang au microscope de la souris est confirmée avant la tétée. Dans les 48 heures après le repas, dans l'intestin moyen du moustique, les gamétocytes haploïdes se différencier en gamètes mâles et femelles, fertiliser, et forment un zygote diploïde (Fig. 1). Pendant le développement d'un zygote dans un ookinète, méiose semble se produire 11. Si le zygote est dérivée par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux parasites génétiquement distinctes, les échanges génétiques (réassortiment chromosomiques et cross-overs entre les chromatides non-sœurs d'une paire de chromosomes homologues;. Fig 2) peut se produire, résultant en une recombinaison du matériel génétique au locus homologue. Chaque zygote subit deux divisions successives nucléaires, conduisant à quatre noyaux haploïdes. Un ookinète développe davantage dans un oocyste. Une fois l'oocyste mûrit, des milliers de sporozoïtes (la descendance de la croix) sont formés et libérés dans hemoceal moustiques. Les sporozoïtes sont récoltées à partir des glandes salivaires et injecté dans un nouvel hôte murin, où le développement stade pré-érythrocytaire et érythrocytaire a lieu. Formes érythrocytaires sont clonés et classés à l'égard des caractères distinctifs des lignées parentales avant la cartographie de liaison génétique. Contrôle des infections de l'individu clones parentaux sont effectuées de la même manière que la production d'un croisement génétique.

Protocol

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Techniques d'asepsie doivent être appliquées à tous les matériaux qui seront administrés dans des animaux pour éviter l'introduction involontaire d'agents infectieux exogènes dans des souris qui peuvent confondre les résultats expérimentaux.

1. L'infection de souris de laboratoire avec des parasites du paludisme au stade sanguin

  1. A température ambiante, le dégel deux flacons contenant les parasites du sang congelé stade de la malaria à franchir. Dans cet exemple, deux souches de rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii sont utilisés yoelii et Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Fit une seringue avec une jauge de 22 à 30 (G) l'aiguille et d'élaborer des 400 ul de stériles, des produits pharmaceutiques de qualité PBS (pH 7,4).
  3. En utilisant la même seringue, tirer jusqu'à 100 uL de sang infectés décongelés; inverser la seringue de haut en bas jusqu'à ce que le contenu est mélangés de façon homogène. (Facultatif: une pipette peut être utilisé pour transférer du PBS et du sang infecté dans un tube de collecte avant d'être transférés dans une seringue pour injection).
  4. Injecter 200 ul de parasite contenant une solution directement dans le péritoine d'une souris. Lorsque vous avez terminé, jeter la seringue dans une poubelle les objets tranchants. (Voir aussi Matières supplémentaires pour l'entretien des souris de laboratoire). En général, la taille standard de l'inoculum est entre 100-500 ul, selon les niveaux d'infections parasitaires dans les documents originaux congelés.
  5. Injecter les deux souches de parasites d'être franchi dans deux souris chacun. Les souris deviennent positifs au microscope 3 à 5 jours après les injections. Lorsque parasitémies atteindre entre 1-5%, passez à l'étape suivante.

2. Infection Clone mixte de Souris

  1. Avant l'infection clone mixtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l'examen microscopique par colorées au Giemsa des frottis sanguins minces (Fig. 3), et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées) .
  2. Calculer le volume d'un sérum physiologique (1,5% p / v citrate trisodique dihydraté, 0,85% de chlorure de sodium p / v) et le sang de souris nécessaire pour produire un mélange d'inoculum, en utilisant la parasitémie et le rouge du sang des mesures de densité cellulaire obtenue plus tôt.
  3. Ajuster la solution parasite à une concentration finale d'un million de globules rouges infectés par 100 ul.
  4. Combinez le sang infecté par les deux bailleurs de fonds dans un rapport 1:1 pour obtenir un inoculum mixte-clone. Lorsque les deux clones parentaux diffèrent du taux de croissance, d'ajuster les proportions d'un. Croissance rapide des parents à un clone à croissance plus lente des parents à 1:2 ou 1:5
  5. Injecter 100 ml de l'échantillon mélangé dans le péritoine de chaque souris pour être infecté. (Voir aussi étape 3.9 pour déterminer le nombre de souris pour être injecté)
  6. En utilisant cette méthode, infecter deux souris chacun avec les souches seul des parents. Les infections seul clone permettra de déterminer la transmission réussie des deux souches parentales.

3. Les moustiques alimentation

  1. Préparer trois cages contenant 300 à 500 adultes (hommes et femmes) Anopheles stephensi moustiques chacun, l'âge émergence 5-7 jours après à partir de pupes. Les conteneurs sont recouverts de grillage sécurisé par un plastique ou un couvercle en métal. Deux cages sont à l'alimentation sur les clones parentaux, la cage troisième est pour la préparation d'un croisement génétique.
  2. À partir quatre jours après l'infection mixte-clone, préparer colorés au Giemsa minces frottis de sang de la queue de souris infectées.
  3. Examiner les frottis au microscope à balayage par au moins 50 champs microscopiques à un grossissement de 1000x et déterminer si gamétocytes mâles et femelles sont présents.
  4. Gamétocytes mâles et femelles sont reconnaissables en raison de la présence de gros granules et de grandes vacuoles (fig. 3). Gamétocytes mâles et femelles ont le cytoplasme rose et bleu, respectivement. Si gamétocytes sont présents, suivre l'étape 3.6.
  5. Si gamétocytes sont absents, garder un suivi quotidien jusqu'à ce qu'ils apparaissent. Si gamétocytes sont présents, continuent l'étape suivante.
  6. Injecter 50 ul de cocktail de médicaments anesthésiques contenant 33 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine dans le péritoine d'une souris pour anesthésier chaque souris infectées (par 20 gramme de poids corporel de la souris). Dose finale de kétamine et de xylazine est de 82,5 et 7,5 mg / kg, respectivement.
  7. Placez la souris à l'envers sur le dessus d'une cage contenant les adultes que les moustiques Anopheles stephensi ont été privés de l'approvisionnement en sucre pendant 24 heures et permettre aux moustiques de se nourrir pendant 30 minutes sans interruption.
  8. Maintenir les moustiques dans un insectarium dans des conditions standard (température est maintenue entre 24-26 ° C, voir également des méthodes supplémentaires pour l'entretien du laboratoire de moustiques).
  9. Utilisez une souris infectée par tous les 50-100 moustiques femelles. Euthanasier les souris immédiatement par dislocation cervicale après la tétée alors que les souris sont encore sous anesthésie.

4. Midg Mosquito dissectionuts et des oocystes de comptage

  1. Neuf jours après la tétée, les moustiques seront examinés pour des oocystes dans l'intestin moyen des insectes. La présence d'oocystes dans les moustiques qui se nourrissent sur un seul clone souris infectées indique que les gamétocytes des deux souches parentales sont infectieuses.
  2. Pour disséquer un intestin des moustiques, l'utilisation d'un aspirateur relié à un petit récipient pour recueillir 5 à 10 moustiques infectés de la cage.
  3. L'utilisation du gaz CO 2, anesthésier les moustiques et les transférer dans un plat en verre de Pétri sur la glace. Séparée et jetez les moustiques mâles. Les antennes des mâles sont nettement plus touffu en comparaison avec les femelles.
  4. Remplir deux seringues avec du PBS et les adapter aux calibre 26 demi-pouce (G ½) des aiguilles. Caution de 100 ul de PBS à partir d'une seringue sur une lame de verre.
  5. Transfert de 5 à 10 anesthésiés moustiques femelles sur la goutte de PBS et de placer la lame sur un microscope à dissection.
  6. En utilisant la même aiguille, enlever les ailes de chaque moustique et les jambes, puis, tenant l'insecte à l'abdomen du thorax et postérieur, tirez le corps de l'autre jusqu'à l'intestin moyen, un blanc en forme de sac du corps, est libéré. Détachez l'intestin moyen et jeter le reste du corps.
  7. Ajouter plus de PBS sur l'intestin moyen, si les lames sont sèches. L'intestin moyen va dégénérer si les laissez sécher. Placer une lamelle sur la estomacs.
  8. Examiner les estomacs sous un microscope optique à un grossissement 100x. Comptez le nombre d'oocystes dans chaque intestin moyen (Fig. 3). Les oocystes sont reconnaissables comme à paroi épaisse structures circulaires qui se trouvent sur la surface extérieure de la estomacs.
  9. Lorsque vous avez terminé, jeter les seringues, aiguilles, et glisser dans une poubelle les objets tranchants.
  10. Si les oocystes sont absents dans les estomacs, nourrir les moustiques avec des souris infectées avec le plus grand nombre de gamétocytes et donner un plus long temps d'alimentation. La température est critique pour cette étape. Assurez-vous que la température est fixé à 24 à 26 ° C.

5. Collecte sporozoïtes de moustiques par centrifugation

  1. Préparer des tubes de prélèvement sporozoïte comme suit: couper le couvercle d'un tube à centrifuger de 0,5 ml propre et percer un trou (0,1-0,2 mm de diamètre) au fond du tube en utilisant une aiguille de 19 G flambé.
  2. Remplir 1 / 3 du tube avec de la laine de verre. Insérez le tube du filtre dans un tube de collecte de 1,5 mL (un tube est suffisante pour la récolte sporozoïtes de ~ 100 moustiques)
  3. Sur l'alimentation après 17 jours, de recueillir les moustiques (étape 4) de la cage dans un petit récipient à l'aide d'un aspirateur.
  4. Utilisez gaz CO 2 à anesthésier les moustiques.
  5. Séparez les femelles des moustiques mâles. Transférer les moustiques femelles anesthésiées par le conteneur pour un plat en verre de Pétri sur la glace.
  6. Préparer deux seringues avec des aiguilles 26 G ½ remplis avec du PBS. Caution de 100 ul de PBS à partir d'une seringue sur une lame de verre.
  7. Transférer les moustiques sur une lame de microscope. Retirez la tête des moustiques, des ailes, des jambes et l'abdomen sous un microscope à dissection.
  8. En utilisant une pince à pointe fine transférer le thorax dans 0,5 ml de PBS dans un homogénéisateur de 1,5 mL (mortier et un pilon). Stocker le thorax sur glace (sporozoïte reste infectieux pendant 2-3 h).
  9. Homogénéiser le thorax sur la glace pour libérer les sporozoïtes des glandes salivaires (voir Figure 3), et le transfert des lysats (broyats) dans le tube rempli de laine de verre (étape 5.1 à 5.2) en utilisant une pipette en verre.
  10. Centrifuger pendant 10 à 20 sec à 1000 rpm à température ambiante.
  11. Recueillir l'écoulement continu (la suspension de sporozoïtes purifiés) à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 22 à 30 G. (Facultatif: chute de 10 à 50 uL de l'écoulement continu sur une lame de microscope, placer une lamelle et visualiser les sporozoïtes vivre sous un microscope optique standard, 400X grossissement, voir aussi Fig 3)
  12. Injecter ip de 0,1 à 0,5 ml de la suspension de sporozoïtes chez des souris (jusqu'à 200 000 parasites peuvent être récoltés à partir d'un seul moustique, voir réf 12). Dans un cas de succès, l'animal sera infecté 72 heures après une injection.

6. Progeny clonage en utilisant une dilution limitée

  1. Soixante-douze heures après les injections de sporozoïtes, collecter sang de la queue des deux souris donneuses infectées par les souches de parasites différents pour l'examen microscopique après coloration de Giemsa de frottis sanguins minces et pour la mesure de la densité des globules rouges (voir Matériaux supplémentaires pour les procédures détaillées).
  2. Choisissez une souris affichant une parasitémie 0,1 à 1% et dont les globules rouges infectés contiennent des parasites souvent seule en tant que donateur pour la procédure de clonage. Répétez l'étape 6.1 prochains jours si les souris sont microscopiquement négatifs. Si les animaux ne sont pas infectés dans les 14 jours, répétez l'étape 2 à 5 et de déterminer la présence de sporozoïtes dans l'étape 5.11).
  3. Diluer le sang de la queue récoltés dans un froid 1h01 solution de Ringer sérum de veau et de mammifères (2,7 mM de chlorure de potassium, chlorure de calcium 1,8 mM, 154 mM de chlorure de sodium) afin d'atteindre un conconcentration de 0,6 à 1 globule rouge infecté par 100 ul, et de stocker l'inoculum sur la glace. De cette manière, la plupart des souris individu doit recevoir soit un ou zéro parasites.
  4. Par voie intraveineuse, injecter 100 ml de sang infecté diluée dans chaque de 50 à 100 souris.
  5. Cinq à sept jours plus tard, l'écran les souris de la présence de parasites au stade sanguin en examinant colorés au Giemsa des frottis sanguins minces. Dans une expérience réussie, 20-50% des souris infectées et montrera parasitémie de 0,1 à 5,0% à 8 jours après l'infection.

7. Caractérisation de Progeny aide de marqueurs génétiques

  1. Recueillir 20 à 40 ul de sang de la queue de la souris dans un microtube de 1,5 ml contenant 0,2 ml de solution de citrate de sérum physiologique refroidi, brièvement au vortex et centrifuger 3 min à 3000 rpm à température ambiante pour obtenir un culot des cellules sanguines. Extraire l'ADN immédiatement ou garder la pastille à -80 ° C.
  2. Préparer l'ADN du parasite en utilisant n'importe quel des méthodes standard d'extraction d'ADN. Pour l'isolation rapide de l'ADN, utiliser un High Pure PCR préparation template kit (Roche Applied Bioscience).
  3. Recombinant descendance sont identifiés après le génotypage à l'aide de microsatellites (MS) ou single nucleotide polymorphism (SNP) sur différents chromosomes qui peuvent différencier les deux souches parentales de la croix génétique. Une méthode simplifiée utilisant une seule des amorces fluorescentes marquées pour MS génotypage de P. yoelii peut être utilisé (voir réf 8,9).

8. La cryoconservation des parasites du paludisme au stade sanguin

  1. Recueillir 0,5-1 ml de sang infecté par ponction cardiaque à partir d'une souris anesthésiés avec une parasitémie de 5-20% 5-10 mL dans le sérum physiologique refroidi.
  2. Centrifuger pendant 5 min à 2000 rpm à température ambiante. Rejeter le surnageant.
  3. Ajouter goutte à goutte 2x volume de la solution de Glycerolyte 57 (Fenwal Laboratories) sur pastilles de sang et bien mélanger.
  4. Transférer la suspension dans des cryotubes (0,2-0,5 ml par tube).
  5. Stocker le sang cryoconservés à -80 ° C (jusqu'à 1 mois) ou dans l'azote liquide.

9. Les résultats représentatifs:

Dans une expérience réussie, 5-10% des lignes cloné sera indépendant progéniture recombinantes.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique du cycle de vie et des événements de recombinaison génétique lors d'un croisement génétique. Événements de recombinaison génétique ont lieu durant la phase précoce de développement dans le moustique. Après la fécondation de "haploïde" gamètes mâles et femelles de différentes origines génétiques dans l'intestin du moustique, "diploïde" zygotes sont formées. Le zygote diploïde constitue l'étape seulement du cycle de vie du parasite; méiose suit dans les 12 heures de la fécondation, et toutes les étapes ultérieures dans le moustique et les mammifères restent haploïdes. Les zygotes résultant développer en ookinètes et des oocystes. La croissance et la division mitotique de chaque oocyste produit des milliers de sporozoïtes, qui sont libérées dans hemoceal moustiques. Ceux sporozoïtes qui migrent vers les glandes salivaires sont en position d'être transmis à un hôte mammifère, où le développement du foie et rouge stades cellulaires du sang a lieu. Au cours des cycles de globules rouges, certains parasites peuvent se différencier en maturité gamétocytes mâles et femelles. Le cycle de vie du parasite est terminée lorsque ces gamétocytes sont repris par un autre moustique, la transmission perpétuer.

Figure 2
Figure 2. Héritage des gènes nucléaires des parasites du paludisme et de la production de la descendance recombinante. La recombinaison génétique peuvent être générés par réassortiment chromosomique ou par des événements croisé. Progéniture produite par autofécondation homozygote entre les gamètes d'un même clone parental 1 ou 2 (A et D), respectivement. B) la descendance hétérozygote produit par la fertilisation croisée entre les gamètes des deux différents clones parentaux, les noyaux recombinante (ovales bleu) étant formé par réassortiment chromosomiques seul. C) la descendance hétérozygote produit à partir de la fertilisation croisée entre les gamètes des deux clones parent différent, les noyaux recombinante (ovales rouge) étant formé par les croisements entre les chromatides non-sœurs des chromosomes homologues.

Figure 3
Figure 3. Morphologie du rongeur parasite du paludisme Plasmodium yoelii. A) stade anneau, B) trophozoïte, C) schizonte, D) mérozoïtes, E) immatures gamétocytes mâle, F) gamétocytes mâles matures, G) immatures gamétocytes femelles, H) gamétocytes femelles matures, I) l'intestin moyen avec des oocystes au jour 10 après l'alimentation (oocystes matures indiquées par des flèches; 200x de grossissement), J) les glandes salivaires des moustiques (grossissement 100x), K) sporozoïtes (400x de grossissement).

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Discussion

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Nous démontrer les techniques pour la production d'un croisement génétique chez le rongeur le paludisme à Plasmodium yoelii, qui est également applicable à la production des croisements génétiques dans les paludismes autres rongeurs. Infections des souris avec une seule clones parentaux sont généralement effectués pour déterminer la transmission réussie des parasites des parents pour s'assurer que les parents sont compétents dans la production de gamètes fonctionnels avant d'effectuer une croix.

Transmission réussie par un moustique est influencé par plusieurs facteurs, dont la température de l'insectarium, les espèces de parasites du paludisme des rongeurs utilisés, et les doses de sang-stade parasitaire (taille de l'inoculum). Alors que la transmission de P. berghei est normalement réalisé à 19-21 ° C 13, la transmission de P. yoelii et P. chabaudi est systématiquement réalisée à 23-25 ​​° C 14. Ookinètes de P. berghei ne parviennent pas à se développer en oocystes à des températures inférieures à 16 ° C ou supérieure à 24 ° C 15. En plus de la température, la taille de l'inoculum peut influencer le taux de multiplication des parasites du paludisme dans le sang. Bien que des injections d'une grande taille de l'inoculum (5 x 10 6 CISR ou plus) donnera plus parasitémie à des stades très précoces de l'infection, il ne conduit pas nécessairement à un plus grand nombre de gamétocytes ou plus infectieux pour les moustiques. Gadsby et autres (2009) 16 a montré que les gamétocytes de P. chabaudi Adami sont présents dans le sang du jour 3 au jour 20 (pic à 13 jours) après l'infection de 1 x 10 6 CISR, mais six jours après l'infection est le seul jour où les moustiques sont infectés. En outre, l'administration d'une grande taille de l'inoculum des souches de parasites en croissance rapide et virulent, comme des clones N67 (nigeriensis), 17XL, et YM de P. yoelii, clone de P. ANKA berghei, et DS clone de P. chabaudi Adami se traduit souvent par une anémie sévère et de la pathologie chez la souris, ce qui peut provoquer une baisse significative de la température corporelle de souris. En conséquence, les souris deviennent moins infectieux pour les moustiques (observations non publiées). Néanmoins, la transmission des parasites du paludisme des rongeurs a été menée avec une taille standard de l'inoculum (10 6 CISR). Il a été constaté que P. berghei et P. yoelii sont transmissibles à moustiques de jours 3 à 5, après le sang en scène induit une infection chez la souris 17, tandis que P. chabaudi chabaudi et P. chabaudi Adami ne sont transmissibles aux moustiques le jour 6 après l'étape de sang provoquée par les infections chez la souris 16, 18.

Les facteurs qui influencent la production de recombinants descendance comprend les proportions des gamétocytes des deux souches parentales chez la souris. En théorie, la production maximale de la descendance recombinante se produit lorsque les gamétocytes des deux sexes des clones parentaux sont en nombre égal et l'auto-fécondation et la fertilisation croisée se produisent à la même fréquence. Sous cette condition, la moitié des zygotes résultant seront des hybrides et le reste sera composé de proportions égales des deux lignes de clone parental. La production de clones de la descendance recombinante sera considérablement réduite lorsque la proportion des gamétocytes est biaisé en faveur des parents un clone, conduisant à disproportionnée autofécondation. Par ailleurs, les parasites ont souvent des taux de croissance différents et peuvent avoir des capacités différentes dans la production de gamétocytes 16, 19. Par conséquent, il est nécessaire d'optimiser les proportions de parasites parentale dans le mélange à être injecté dans la souris pour se nourrir des moustiques.

Le temps de cloner les parasites du sang après le repas des moustiques est aussi un facteur important à considérer. Il est préférable de cloner la descendance du croisement génétique lorsque la parasitémie est entre 0,1-1,0% (avant les cycles de réplication de trop nombreux dans le sang) pour éviter le clonage des clones dupliqués. Les parasites rapide ou lente croissance peut venir en grand nombre à certaines périodes de temps, et le clonage à des sommets de parasites rapide ou lente croissance va se retrouver avec des clones ayant les phénotypes mêmes.

En conclusion, l'exécution des croisements génétiques utilisant des parasites du paludisme des rongeurs est relativement facile et beaucoup moins cher que d'effectuer un croisement génétique de l'humain parasite du paludisme P. falciparum, ce qui nécessite l'infection d'un primate non humain. Recombinant descendance des croisements génétiques sont des outils utiles pour la construction de cartes génétiques et pour la cartographie des traits importants du paludisme, y compris le développement du parasite, la résistance aux médicaments, et la virulence.

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Disclosures

Parce que les auteurs sont des employés du gouvernement et c'est un travail du gouvernement, le travail est dans le domaine public aux États-Unis. Nonobstant toute autre entente, le NIH se réserve le droit de fournir du travail à PubMedCentral pour l'affichage et l'utilisation par le public, et peut PubMedCentral tag ou modifier le travail compatible avec ses pratiques habituelles. Vous pouvez établir des droits de l'extérieur de la réserve américaine d'une licence d'utilisation du gouvernement.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Paré et Tovi Lehman pour une lecture critique des manuscrits. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche intra-muros de la Division de la recherche intra-muros, l'Institut national des allergies et maladies infectieuses, National Institutes of Health, et par le Programme national de recherche de base 973 de la Chine, # 2007CB513103. Nous remercions le NIAID intra-muros éditeur de Brenda Marshall Rae pour l'assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glyerolyte 57 solution Cenmed 4A7833
Mouse Mus musculus Charles River Laboratories Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum Invitrogen 26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1) MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67 MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer Nexcelom Bioscience Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit Roche Group 11 796 828 001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich GS500
Ketamine hydrochloride Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S4641
Xylazine Akorn Inc 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool VWR international 32848-003
Glass capillary (1 μL) VWR international 53440-001
Hemocytometer VWR international 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer VWR international KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquit–s
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquit–s

Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

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References

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).
Protocole pour la production d'un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs
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Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).More

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

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