Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Summary

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen produzieren

Abstract

Variation in Reaktion auf Medikamente gegen Malaria und Pathogenität von Malaria-Parasiten ist von biologischen und medizinischen Bedeutung. Linkage Mapping um erfolgreiche Identifizierung von Genen oder loci zugrunde liegenden verschiedenen Eigenschaften in Malaria-Parasiten von Nagetieren ^1-3 und ^4-6 Menschen geführt. Die Malaria-Parasiten Plasmodium yoelii ist eine von vielen Malaria-Arten von wilden afrikanischen Nagetieren isoliert und wurde angepasst, um im Labor wachsen. Diese Art reproduziert viele der biologischen Eigenschaften des menschlichen Malaria-Parasiten, genetischen Markern wie Mikrosatelliten und amplifizierte Fragment-Längen-Polymorphismus (AFLP)-Marker sind auch für die Parasiten ^7-9 entwickelt worden. So können genetische Untersuchungen bei Nagetieren Malaria-Parasiten durchgeführt, um Forschung auf Plasmodium falciparum ergänzen. Hier zeigen wir die Techniken zur Herstellung eines genetischen Kreuz in P. yoelii, die zuerst Pionierarbeit von Dr. wurden. David Walliker, Richard Carter und Kollegen an der University of Edinburgh ^10.

Genetische Kreuze in P. yoelii und andere Nager Malaria-Parasiten sind durch Infizieren Mäusen Mus musculus mit einem Inokulum mit gametocytes von zwei genetisch unterschiedliche Klone, die in Phänotypen von Interesse und indem Mücken auf dem infizierten Mäusen 4 Tage nach der Infektion Vorschub unterscheiden durchgeführt. Die Anwesenheit von männlichen und weiblichen gametocytes in der Maus Blut mikroskopisch vor der Fütterung bestätigt. Innerhalb von 48 Stunden nach der Fütterung, im Mitteldarm der Mücke, die haploid gametocytes in männliche und weibliche Keimzellen zu differenzieren, zu befruchten, und bilden eine diploide Zygote (Abb. 1). Bei der Entwicklung einer Zygote in eine ookinete erscheint Meiose bis ¹¹ auftreten. Wenn die Zygote durch gegenseitige Befruchtung zwischen Gameten von zwei genetisch verschiedene Parasiten, genetischen Austausch (. Chromosomale Reassortierung und Cross-overs zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden eines Paares von homologen Chromosomen; Abb. 2) abgeleitet sind, können auftreten, die bei der Rekombination von genetischem Material an homologen Loci. Jede Zygote durchläuft zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen, was zu vier haploide Kerne. Ein ookinete weiterentwickelt in eine Oozysten. Sobald die Oozysten fällig wird, werden Tausende von Sporozoiten (die Nachkommen des Kreuzes) gebildet und freigesetzt in Mücke hemoceal. Sporozoiten aus den Speicheldrüsen geerntet und in eine neue Maus-Host, wo pre-Erythrozyten und Erythrozyten Entwicklungsphase stattfindet. Erythrozytären Formen sind geklont und klassifiziert in Bezug auf die Charaktere zu unterscheiden elterlichen Linien vor genetische Verknüpfung Mapping. Bekämpfung von Infektionen von einzelnen Eltern Klone sind in der gleichen Weise wie die Herstellung eines genetischen Kreuz durchgeführt.

Protocol

Aseptische Technik ist für alle Materialien, die in Tieren verabreicht werden, um eine versehentliche Einführung von exogenen Krankheitserregern in Mäusen, die experimentellen Ergebnisse zu verwechseln vermeiden können angewendet werden.

1. Die Infektion von Mäusen mit Blut-Stufen-Malaria-Erregern

1. Bei Raumtemperatur auftauen zwei Fläschchen mit dem gefrorenen Blut Bühne Malaria-Parasiten zu überqueren. In diesem Beispiel sind zwei Nagetier Malaria-Parasiten Plasmodium-Stämme verwendet yoelii yoelii und Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Fit eine Spritze mit einer 22-30 Gauge (G) Nadel und erarbeiten 400 ul sterilem, pharmazeutischer Qualität PBS (pH 7,4).
3. Mit der gleichen Spritze, erarbeiten 100 ul des aufgetauten infiziertes Blut, kehren die Spritze auf und ab, bis der Inhalt homogen vermischt wird. (Optional: eine Pipette verwendet werden, um PBS und infiziertes Blut in ein Sammelrohr vor Transfer in eine Spritze zur Injektion übertragen werden).
4. Inject 200 ul von Parasiten enthaltenden Lösung direkt in die Bauchhöhle einer Maus. Wenn Sie fertig sind, werfen Sie die Spritze in einem dafür bin. (Siehe auch Ergänzende Materialien für die Wartung von Labor-Mäuse). Im Allgemeinen ist die Standard-Größe des Inokulums zwischen 100-500 ul, je nach der Höhe der Parasitenbefall in der ursprünglichen eingefroren Materialien.
5. Inject die beiden Parasiten-Stämme in zwei Mäusen gekreuzt werden. Mäuse positiv wird mikroskopisch 3 bis 5 Tage nach den Injektionen. Wenn Parasitämien zwischen 1-5% zu erreichen, mit dem nächsten Schritt fortfahren.

2. Mixed Clone Infektion von Mäusen

1. Vor gemischt Klon-Infektion, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung von Giemsa dünne Blutausstriche (Abb. 3) infiziert sind, und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) .
2. Berechnen Sie das Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung (1,5% w / v Trinatriumcitratdihydrat, 0,85% w / v Natriumchlorid) und Maus Blut benötigt, um ein Inokulum Gemisch zu erzeugen, mit der Parasitämie und der roten Blutkörperchen Dichtemessungen erhaltenen früher.
3. Passen Sie die Parasiten-Lösung auf eine Endkonzentration von einer Million infizierter roter Blutkörperchen pro 100 &mgr;.
4. Kombinieren Sie die infiziertes Blut aus den beiden Spendern in einem Verhältnis von 1:1 zu einem Mixed-Klon Inokulum erhalten. Als die beiden elterlichen Klone in der Wachstumsrate unterscheiden, passen die Proportionen eines schneller wachsenden elterlichen einer langsamer wachsenden elterlichen Klon bis 1:2 oder 1:5.
5. Inject 100 ul der gemischten Probe in das Bauchfell jeder Maus infiziert zu sein. (Siehe auch Schritt 3,9 bis die Anzahl der Mäuse zu bestimmen, die injiziert werden)
6. Mit dieser Methode infizieren zwei Mäuse jeweils mit dem einzigen elterlichen Stämme. Die Single-Klon Infektionen ermöglicht die Bestimmung der erfolgreichen Übertragung der beiden elterlichen Stämme.

3. Feeding Moskitos

1. Bereiten Sie drei Käfige mit 300-500 Erwachsenen (männlich und weiblich) Anopheles Mücken stephensi jeden, Alter 5-7 Tage Nachauflauf aus Puppen. Die Behälter sind mit Netzen zu sichern durch eine Kunststoff-oder Metall-Deckel abgedeckt. Zwei Käfige sind für die Fütterung auf die elterliche Klone, die dritte Käfig ist für die Herstellung eines genetischen überqueren.
2. Ab vier Tage nach dem Mixed-Klon Infektion vorbereiten Giemsa-gefärbten dünnen Blut Schwanz Abstriche von den infizierten Mäusen.
3. Untersuchen Sie die Flecken unter dem Mikroskop durch das Scannen von mindestens 50 mikroskopischen Feldern in 1000facher Vergrößerung und festzustellen, ob männliche und weibliche gametocytes vorhanden sind.
4. Männliche und weibliche gametocytes erkennbar sind durch die Anwesenheit von großen Vakuole und große Körner (Abb. 3). Männliche und weibliche gametocytes haben rosa und blau Zytoplasma bzw.. Wenn gametocytes vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 3.6.
5. Wenn gametocytes abwesend sind, halten die Überwachung täglich bis sie erscheinen. Wenn gametocytes vorhanden sind, weiterhin den folgenden Schritt.
6. Inject 50 ul Anästhetika Cocktail mit 33 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin in die Bauchhöhle einer Maus zu jeder infizierten Maus (pro 20 Gramm Maus Körpergewicht) zu betäuben. Finale Dosis Ketamin und Xylazin liegt bei 82,5 und 7,5 mg / kg.
7. Legen Sie die Maus nach unten auf der Oberseite einen Käfig mit erwachsenen Anopheles stephensi Moskitos, die von Zucker liefern wurden für 24 Stunden ausgehungert und damit die Mücken für 30 Minuten ohne Unterbrechung zu ernähren.
8. Pflegen Sie die Mücken in einem Insektarium unter Standard-Bedingungen (Temperatur zwischen 24-26 ° C gehalten, siehe auch ergänzende Methoden für die Wartung von Labor-Moskitos).
9. Verwenden Sie eine infizierte Maus für jeden 50-100 weiblichen Mücken. Euthanize die Mäuse sofort durch Genickbruch nach der Fütterung während die Mäuse noch unter Narkose.

4. Dissecting Mosquito MIDGuts und Counting Oocysten

1. Neun Tage nach der Fütterung werden die Mücken für die Oozysten in das Insekt Mitteldarm untersucht werden. Die Anwesenheit von Oozysten in den Mücken ernähren sich von Single-Klon infizierten Mäusen, dass gametocytes der beiden elterlichen Stämme zeigt infektiös sind.
2. Um sezieren eine Mücke Mitteldarm, verwenden Sie einen Aspirator verbunden mit einem kleinen Behälter auf 5 bis 10 infizierten Mücken aus dem Käfig zu sammeln.
3. Mit CO _2-Gas, betäuben die Mücken und übertragen Sie sie in ein Glas-Petrischale auf Eis. Separate und entsorgen männlichen Mücken. Die Antennen der Männchen sind deutlich buschiger im Vergleich zu den Weibchen.
4. Füllen Sie zwei Spritzen mit PBS und montieren Sie sie mit 26 Gauge halben Zoll (G ^½) Nadeln. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger.
5. Übertragen von 5 bis 10 anästhesierten weibliche Stechmücken auf den Tropfen PBS und legen Sie die Folie auf einem Binokular.
6. Mit der gleichen Nadeln, nehmen Sie jede Mücke die Flügel und Beine, dann hält das Insekt an der Brust und hinteren Bauch, ziehen Sie den Körper auseinander, bis die Mitteldarm, ein weißes sackartige Körper freigesetzt wird. Lösen Sie den Mitteldarm und entsorgen Sie den Rest des Körpers.
7. Fügen Sie weitere PBS auf dem Mitteldarm, wenn die Folien trocken sind. Der Mitteldarm wird entartet, wenn wir getrocknet. Legen Sie ein Deckglas über dem Mitteldärmen.
8. Untersuchen Sie die Mitteldärmen unter einem Lichtmikroskop bei einer 100-facher Vergrößerung. Zählen Sie die Anzahl von Oozysten in jedem Mitteldarm (Abb. 3). Oozysten sind erkennbar als dickwandige kreisförmige Strukturen, die auf der Außenfläche des Mitteldärmen liegen.
9. Wenn Sie fertig sind, von Spritzen, Nadeln, und schieben Sie in einem dafür bin entsorgen.
10. Wenn Oozysten fehlen in der Mitteldärmen sind, Futtermittel Moskitos mit infizierten Mäusen, die mit der höheren Anzahl von gametocytes und geben eine längere Fütterungszeit. Die Temperatur ist entscheidend für diesen Schritt. Vergewissern Sie sich, die Temperatur, bei 24 bis 26 ° C eingestellt

5. Sammeln Sporozoiten von Mücken durch Zentrifugation

1. Bereiten Sporozoiten Sammelröhrchen wie folgt: Schneiden Sie die Deckel von einem sauberen 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und ein Loch (0.1-0.2 mm Durchmesser) an der Unterseite des Rohres mit einer geflammten 19 G Nadel.
2. Füllen Sie 1 / 3 des Rohres mit Glaswolle. Legen Sie die Filter-Tube in ein 1,5-ml-Collection-Tube (eine Tube reicht bis zur Ernte Sporozoiten von ~ 100 Mücken)
3. Am Tag 17 post Fütterung, sammeln Mücken (Schritt 4) aus den Käfigen in einen kleinen Behälter mit einem Staubsauger.
4. Verwenden CO _2-Gas, um Mücken zu betäuben.
5. Separate die Weibchen vom Männchen Mücken. Übertragen Sie die betäubten weiblichen Mücken aus dem Behälter zu einem Glas Petrischale auf Eis.
6. Bereiten Sie zwei Spritzen mit 26 G ^½ Nadeln mit PBS gefüllt. Kaution ca. 100 ul PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger.
7. Übertragen Sie die Mücken auf einen Objektträger. Entfernen Sie die Moskitos Kopf, Flügel, Beine, Bauch und unter einem Binokular.
8. Mit spitzen Pinzette übertragen Brustkörbe in 0,5 ml PBS in einer 1,5-ml-Homogenisator (Mörser und Stößel). Bewahren Sie die Brustkörbe auf Eis (Sporozoiten bleibt infektiös für 2-3 h).
9. Homogenisieren Brustkörbe auf Eis zu Sporozoiten aus Speicheldrüsen freizugeben (siehe Abbildung 3), und übertragen Sie die Lysate (Homogenate) in das Rohr mit Glaswolle (Schritt 5,1 bis 5,2) mit einer Glaspipette gefüllt.
10. Zentrifuge für 10 bis 20 sec bei 1000 rpm bei Raumtemperatur.
11. Sammeln Sie die Flow-Through (die gereinigte Sporozoiten Suspension) mit einer Spritze mit einer 22-30 G Nadel. (Optional: drop 10-50 ul der Flow-Through auf einen Objektträger, legen ein Deckglas und visualisieren die Live-Sporozoiten unter einem Standard-Lichtmikroskop, 400-facher Vergrößerung, siehe auch Abb. 3)
12. Inject ip 0,1-0,5 ml des Sporozoiten-Suspension in Mäusen (bis zu 200.000 Parasiten können von einer einzigen Stechmücke geerntet werden; siehe Lit. 12). In einem erfolgreichen Fall, wird das Tier infiziert 72 Stunden nach der Injektion.

6. Cloning Progeny mit Begrenzte Dilution

1. Zweiundsiebzig Stunden nach der Sporozoiten-Injektionen, sammeln Schwanz Blut aus den beiden Spender-Mäuse mit den verschiedenen Parasiten-Stämme für die mikroskopische Untersuchung nach Giemsa-Färbung von dünnen Blutausstrich und für die Messung der roten Blutkörperchen Dichte (siehe ergänzende Materialien für detaillierte Verfahren) infiziert.
2. Wählen Sie eine Maus Anzeige einer 0,1 bis 1% Parasitämie und deren infizierte rote Blutkörperchen enthalten meist einzelne Parasiten als Spender für die Klonierung. Wiederholen Sie Schritt 6.1 nächsten Tagen, wenn die Mäuse mikroskopisch negativ sind. Wenn die Tiere nicht innerhalb von 14 Tagen infiziert sind, wiederholen Sie Schritt 2 bis 5 und bestimmen Sie die Anwesenheit von Sporozoiten in Schritt 5,11).
3. Verdünnen Sie die geernteten Schwanz Blut in einem kalten 1:1-Lösung von Kälberserum und Säugetieren Ringer-Lösung (2,7 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 154 mM Natriumchlorid), um so das Ziel, ein conKonzentration von 0,6 bis 1 infizierte rote Blutkörperchen pro 100 ul, und speichern Sie das Inokulum auf Eis. Auf diese Weise sollten die meisten der einzelnen Maus erhalten entweder Eins oder Null Parasiten.
4. Intravenös injizieren 100 ul verdünnt infiziertes Blut in jeder von 50 bis 100 Mäuse.
5. Fünf bis sieben Tage später, Bildschirm die Mäuse auf das Vorhandensein von Blut Parasiten durch die Untersuchung Giemsa-gefärbten dünnen Blutausstrich. In einem erfolgreichen Experiment, werden 20-50% der Mäuse infiziert und wird Parasitämie von 0,1-5,0% an Tag 8 nach der Infektion zeigen.

7. Charakterisierung von Progeny Hilfe von genetischen Markern

1. Sammeln Sie 20 bis 40 ul der Maus Schwanz Blut in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, dass 0,2 ml gekühlter physiologischer Kochsalzlösung Citrat, kurz vortexen und zentrifugieren für 3 min bei 3000 rpm bei Raumtemperatur zu Pellet die Blutzellen enthält. Auszug DNA sofort oder halten das Pellet bei -80 ° C.
2. Bereiten Parasiten-DNA mit einem beliebigen Standard-DNA-Extraktionsverfahren. Zur schnellen Isolierung von DNA, verwenden Sie ein High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Applied Bioscience).
3. Rekombinante Nachkommen sind nach Genotypisierung mit Mikrosatelliten (MS) oder Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) auf verschiedenen Chromosomen, dass die beiden elterlichen Stämme der genetischen Kreuz unterscheiden kann identifiziert werden. Ein vereinfachtes Verfahren mit einzelnen fluoreszenzmarkierten Primer für MS-Genotypisierung von P. yoelii kann (vgl. Rz 8,9) werden.

8. Kryokonservierung von Blut-Stufen-Malaria-Erregern

1. Sammeln 0,5-1 ml von infiziertem Blut durch Herzpunktion aus einer narkotisierten Maus mit Parasitämie von 5-20% in 5-10 mL gekühlter physiologischer Kochsalzlösung.
2. Zentrifuge für 5 min bei 2000 rpm bei Raumtemperatur. Überstand.
3. Tropfenweise 2x Volumen von Glycerolyte 57-Lösung (Fenwal Laboratories) auf Blut-Pellets und gut mischen.
4. Die Suspension auf Kryoröhrchen (0,2-0,5 mL pro Röhrchen).
5. Bewahren Sie die kryokonservierten Blut bei -80 ° C (bis zu 1 Monat) oder in flüssigem Stickstoff.

9. Repräsentative Ergebnisse:

In einem erfolgreichen Experiment, werden 5-10% der geklonten Linien unabhängige rekombinante Nachkommen sein.

Abbildung 1. Eine schematische Darstellung des Lebenszyklus und der genetischen Rekombination Ereignisse während eines genetischen überqueren. Genetische Rekombination Veranstaltungen finden während der frühen Phase der Entwicklung in der Mücke. Nach der Befruchtung "haploid" männliche und weibliche Keimzellen von verschiedenen genetischen Hintergründen im Mitteldarm der Mücke sind "diploid" Zygoten gebildet. Die Zygote ist der einzige diploide Stadium des Parasiten Lebenszyklus; Meiose folgt innerhalb von 12 Stunden nach der Befruchtung, und alle nachfolgenden Stufen in der Mücke und Säugetiere bleiben haploid. Die daraus resultierenden Zygoten entwickeln sich zu ookinetes und Oozysten. Wachstum und mitotischen Teilung der einzelnen Oozysten produziert Tausende von Sporozoiten, die in der Moskitos hemoceal freigesetzt werden. Diese Sporozoiten, die Speicheldrüsen wandern sind in der Lage, auf einem Säugetierwirt, wo die Entwicklung der Leber und roten Blutkörperchen Stufen erfolgt übertragen werden. Im Laufe der roten Blutkörperchen Zyklen lassen sich einige Parasiten zu reifen männlichen und weiblichen gametocytes unterscheiden. Der Parasit Lebenszyklus ist beendet, wenn diese gametocytes von einem anderen Mücke, verewigen Übertragung ergriffen werden.

Abbildung 2. Vererbung von nuklearen Genen in Malaria-Parasiten und Produktion von rekombinanten Nachkommen. Genetische Rekombination kann durch chromosomale Reassortierung oder Crossover-Ereignisse erzeugt werden. Homozygote Nachkommen durch Selbstbefruchtung zwischen Gameten der gleichen elterlichen Klon 1 oder 2 (A und D), bzw. produziert. B) Heterozygote Nachkommen durch Befruchtung zwischen Gameten der beiden unterschiedlichen elterlichen Klone, rekombinante Kerne (blau Ovale) durch chromosomale Reassortierung allein gebildet produziert. C) Heterozygote Nachkommen aus der gegenseitigen Befruchtung zwischen Gameten der beiden anderen übergeordneten Klone, rekombinante Kernen (rot Ovale) durch Übergänge zwischen den Nicht-Schwesterchromatiden der homologen Chromosomen gebildet produziert.

Abbildung 3. Morphologie der Nager Malariaparasiten Plasmodium yoelii. A) Ring Bühne, B) Trophozoiten, C) Schizonten, D) Merozoiten, E) unreifen männlichen gametocyte, F) reifen männlichen gametocyte, G) unreife weibliche gametocyte, H) ausgewachsene weibliche gametocyte, I) Mitteldarm mit Oozysten am Tag 10 post Fütterung (reifen Oozyten durch Pfeile angedeutet; 200-facher Vergrößerung), J) Mücke Speicheldrüsen (100fache Vergrößerung), K) Sporozoiten (400-facher Vergrößerung).

Discussion

Wir zeigen die Techniken für die Herstellung eines genetischen Kreuz in das Nagetier Malaria Plasmodium yoelii, die auch für die Produktion von genetischen Kreuzungen in andere Nager malarias. Infektionen von Mäusen mit einzelnen Eltern Klone sind in der Regel durchgeführt, um eine erfolgreiche Übertragung der elterlichen Parasiten zu bestimmen, um sicherzustellen, dass die Eltern kompetent bei der Herstellung von funktionellen Gameten vor der Durchführung eines Kreuzes sind.

Erfolgreiche Übertragung durch eine Mücke wird von mehreren Faktoren ab, einschließlich Temperatur des Insektarium, Arten von Nagetieren Malaria-Parasiten verwendet, und die Dosen von Blut-Stufen-Parasiten (Infektionsdosis) beeinflusst. Während Übertragung von P. berghei ist in der Regel bei 19-21 ° C ^13, Übertragung von P. erreicht yoelii und P. chabaudi wird routinemäßig bei 23-25 ​​° C ¹⁴ durchgeführt. Ookinetes von P. berghei nicht in Oozysten bei Temperaturen entwickeln niedriger als 16 ° C oder höher als 24 ° C ^15. Neben der Temperatur kann Inokulumgröße Vermehrungsrate von Malaria-Parasiten im Blut beeinflussen. Obwohl Injektionen von einem großen Inokulum Größe (5 x 10 ⁶ iRBC oder mehr) werden höhere Parasitämie in sehr frühen Stadien der Infektion ergeben, bedeutet dies nicht zwangsläufig eine größere Anzahl von gametocytes oder höher Infektiosität für Stechmücken führen. Gadsby und andere (2009) ¹⁶ zeigte, dass gametocytes von P. chabaudi adami vorhanden sind in das Blut von Tag 3 bis Tag 20 (Peak bei Tag 13) nach der Infektion von 1 x 10 ⁶ iRBC, jedoch ist Tag 6 nach der Infektion die einzige Tag, an dem Mücken infiziert. Auch die Verabreichung einer großen Inokulum Größe der schnell wachsenden und bösartigen Parasiten-Stämme, wie Klone N67 (nigeriensis), 17XL und YM von P. yoelii, Klon ANKA von P. berghei und Klon DS von P. chabaudi Adami führt oft zu einer schweren Anämie und Pathologie in Mäusen, die einen deutlichen Rückgang der Maus Körpertemperatur verursachen kann. Als Ergebnis, Mäuse weniger ansteckend, um Stechmücken (unveröffentlichte Beobachtungen) zu werden. Dennoch hat Übertragung von Nagetier Malaria-Parasiten mit einem Standard-Inokulum Größe (10 ⁶ iRBC) durchgeführt worden. Es hat sich gezeigt, dass P. berghei und P. yoelii übertragbar sind, um Mücken von den Tagen 3 bis 5 nach Blut stage-induzierten Infektion bei Mäusen ^17, während P. chabaudi chabaudi und P. chabaudi adami nur übertragbare Mücken am Tag 6 nach der Blut-stage-induzierte Infektionen bei Mäusen ^{16, 18} sind.

Faktoren, die Produktion von rekombinanten Nachkommen beeinflussen, gehören die Anteile von gametocytes der beiden elterlichen Stämme in Mäusen. In der Theorie tritt die maximale Produktion von rekombinanten Nachkommen, wenn gametocytes beiderlei Geschlechts der elterlichen Klone in gleicher Zahl und Selbst-Befruchtung und der gegenseitigen Befruchtung kommen auf der gleichen Frequenz. Unter dieser Bedingung wird die Hälfte des entstandenen Zygoten Hybriden und der Rest wird von gleichen Anteilen der beiden elterlichen Klon Linien bestehen. Die Produktion von rekombinanten Nachkommen Klone stark reduziert werden, wenn der Anteil der gametocytes in Richtung einer elterlichen Klon vorgespannt ist, was zu unverhältnismäßig Selbst-Befruchtung. Darüber hinaus Parasiten haben oft unterschiedliche Wachstumsraten und können unterschiedliche Fähigkeiten in der Herstellung von gametocytes ^{16, 19} haben. Daher ist es notwendig, die Proportionen der elterlichen Parasiten in der Mischung in die Mäuse für Mücke injiziert werden zu optimieren.

Die Zeit, um Parasiten aus dem Blut nach der Mücke Klon ist auch ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Es ist besser, den Nachkommen der genetischen Kreuzung Klon, wenn Parasitämie zwischen 0,1-1,0% (vorher zu viele Zyklen der Replikation im Blut), um das Klonen vervielfältigt Klone zu vermeiden. Fast-oder langsam wachsende Parasiten kommen in großer Zahl auf bestimmte Zeiträume, und das Klonen zu den Gipfeln der Fast-oder langsam wachsende Parasiten wird am Ende mit Klone mit den gleichen Phänotypen.

Im Ergebnis der Durchführung genetischer Kreuze mit Nagetier Malaria-Parasiten ist relativ einfach und viel billiger als die Durchführung einer genetischen Kreuz der menschlichen Malaria-Parasiten P. falciparum, die Infektion einer nicht-menschlichen Primaten erfordert. Rekombinante Nachkommen der genetischen Kreuze sind nützliche Werkzeuge für den Bau der genetische Verknüpfung Karten und für die Zuordnung von wichtigen Malaria-Eigenschaften einschließlich Parasiten Entwicklung, Arzneimittel-Resistenz und Virulenz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.