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Immunology and Infection

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

doi: 10.3791/2365 Published: January 3, 2011

Summary

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。

Abstract

抗マラリア薬への応答で、マラリア原虫の病原性の変化は、生物学的および医学的に重要である。リンケージマッピングは4-6 1-3およびヒトのげっ歯類のマラリア原虫の様々な特性の基礎となる遺伝子または遺伝子座の同定に成功につながっている。マラリア原虫yoeliiは野生のアフリカのげっ歯類から分離された多くのマラリアの種の一つであり、実験室で成長するように適応されています。この種は、人間のマラリア原虫の生物学的特性の多くを再現し、そのようなマイクロサテライトや増幅断片長多型(AFLP)マーカーなどの遺伝子マーカーはまた、寄生虫7月9日のために開発されている。従って、げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的研究は、 熱帯熱マラリア原虫の研究を補完するために実行することができます。ここで、我々は、P.の遺伝的交雑を生成するための手法を示します第一博士によって開拓されたyoelii。デビッドWalliker、リチャードカーター、そしてエディンバラ10の大学の同僚。

P.の遺伝的交雑yoeliiと他のげっ歯類のマラリア原虫は、関心の表現型と蚊は4日、感染後に感染したマウスを餌にできるため、異なる2つの遺伝的に異なるクローンのgametocytesを含む接種でマウスのハツカネズミを感染させることによって行われます。マウスの血液中の男性と女性gametocytesの有無を顕微鏡供給する前に確認されている。授乳後48時間以内に、蚊の中腸では、半数体gametocytesは、​​男性と女性の配偶子に分化受精させる、と二倍体の接合子(図1)を形成する。オーキネートへの受精卵の開発中に、減数分裂は11を発生することが表示されます。受精卵は、2つの遺伝的に異なる寄生虫、遺伝的交流(。相同染色体のペアの非姉妹染色分体の間に染色体の再集合し、クロスオーバー、図2)の配偶子間のクロス受精によって派生している場合は、組換えの結果、発生する可能性があります。相同遺伝子座の遺伝物質の。それぞれの接合子は、4倍体の核につながる、二つの連続核分裂を起こす。オーキネートはさらにオーシストに開発しています。オーシストが成熟したら、スポロゾイト(クロスの子孫)の数千人が形成され、蚊のhemocealに放出されています。スポロゾイトが唾液腺から採取し、前赤血球と赤血球ステージの開発が行われる新しいマウス宿主に注入されています。赤血球の形態はクローニングと遺伝子連鎖地図作成の前に親の行を区別する文字に関して分類されます。個々の親のクローンの制御の感染症は、遺伝的交雑の生産と同じ方法で実行されます。

Protocol

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無菌技術は、実験結果を混乱させることができるマウスに外因性の感染性病原体の不注意な導入を避けるために動物に投与されるすべての材料に適用する必要があります。

1。血液ステージマラリア原虫を持つ実験用マウスの感染症

  1. 室温で、交差する冷凍血液ステージマラリア原虫を含む二つのバイアルを解凍。この例では、使用される2つのげっ歯類のマラリア原虫の株は、 マラリアyoelii yoeliiマラリアyoeliiのnigeriensisです。
  2. 22から30ゲージ(G)針と注射器を取り付け、滅菌、医薬品グレードのPBS(pH7.4)を400μLを描く。
  3. 同じ注射器を使用して、解凍した感染血液100μLを立て、内容が均一に混合されるまで上下シリンジを反転させる。 (オプション:ピペットを注入用注射器に転送する前にコレクションチューブにPBSと感染した血液を転送するために使用されることがあります)。
  4. マウスの腹膜に直接溶液を含む寄生虫の200μLを注入する。終了したら、鋭利ビンの注射器を廃棄する。 (また、実験用マウスの維持のための補足資料を参照してください)​​。一般的には、接種の標準サイズは、オリジナルの冷凍材料における寄生虫感染症のレベルに応じて、100〜500μLの間です。
  5. つのマウスそれぞれに交差する二つの寄生虫株を注入する。マウスは、顕微鏡的に3〜5日間注射した後に正となる。 parasitemiasは1-5%の間に到達すると、次の手順に進みます。

2。マウスの混合クローン感染

  1. 混合クローンの感染前に、(詳細な手順については補足資料を参照してください)​​ギムザ染色した血液を薄める塗抹標本による顕微鏡検査(図3)、および赤血球の密度の測定のためのさまざまな寄生虫株に感染twoドナーマウスから尾部血を採取する。
  2. 以前取得した寄生虫血と赤血球の密度測定を使用して、生理食塩水(1.5%w / vのクエン酸三ナトリウム二水和物、0.85%(w / v)の塩化ナトリウム)と接種の混合物を生成するために必要なマウスの血液の量を計算します。
  3. 100μlの100万件の感染赤血球の最終濃度に寄生虫ソリューションを調整します。
  4. 混在クローン接種を得るために1:1の比率で2つのドナーから感染した血液を組み合わせる。 2つの親のクローンは、成長率が異なるときは、1:2または1:5の遅い成長している親クローンの親の急成長の割合を調整する。
  5. 感染していることが、各マウスの腹腔内に混合試料の100μLを注入する。 (注入するマウスの数を決定するために3.9をステップも参照)
  6. この方法を使用して、単一の親系統とのそれぞれ2つのマウスに感染する。単一クローンの感染は2つの親系統の正常な伝送の決定が可能になります。

3。摂食蚊

  1. 300から500までの成人(男性と女性)ハマダラカ蚊それぞれ、蛹から年齢5〜7日のポスト出現を備えた三ケージを用意します。容器は、プラスチックまたは金属製の蓋で安全な網で覆われている。二つのケージは、親のクローンに供給するためであり、第三ケージは、遺伝的交雑の準備のためです。
  2. 混在クローン感染後4日以降、感染マウスからギムザ染色した血液を薄めるの尾の塗抹標本を準備する。
  3. 1000X倍率で少なくとも50顕微鏡のフィールドを走査することにより顕微鏡下で塗抹標本を調べ、男性と女性のgametocytesが存在するかどうかを決定する。
  4. 男性と女性のgametocytesは大きな液胞と大型顆粒の存在(図3)に起因する認識です。男性と女性のgametocytesはそれぞれ、ピンクとブルーの細胞質を持っている。 gametocytesが存在する場合は、ステップ3.6に従ってください。
  5. gametocytesが存在しない場合は、表示されるまで、毎日監視をしてください。 gametocytesが存在する場合、次の手順を続けます。
  6. 33 mg / mLのケタミンのと、それぞれ感染したマウスを(20グラムのマウス体重あたり)麻酔マウスの腹膜にキシラジンの3 mg / mLのを含む麻酔薬のカクテルの50μLを注入する。ケタミンとキシラジンの最終的な投与量はそれぞれ82.5と7.5 mg / kgを、です。
  7. マウスは24時間のために砂糖の供給が不足し、蚊が中断することなく30分間供給することを許可されている成人のハマダラカ蚊を含むケージの上に伏せて置きます。
  8. 標準的な条件下での昆虫館で蚊を維持する(温度を24〜26 ° Cの間で維持される;も研究室蚊の維持のための補助メソッドも参照)。
  9. すべての50から100メスの蚊用の感染マウスを使用してください。マウスは、麻酔下にまだある間、給餌後に頚椎脱臼によりすぐにマウスを安楽死させる。

4。解剖モスキートMidgUTSとカウントオーシスト

  1. 九日給餌後、蚊は昆虫の中腸におけるオーシストのために調べられます。単クローン感染マウスでの飼料は2つの親系統のgametocytesが感染していることを示している蚊のオーシストの存在。
  2. 蚊中腸を解剖するために、ケージから徒歩5〜10感染した蚊を収集するための小さな容器に接続されてアスピレーターを使用してください。
  3. CO 2ガスを使用して、蚊を麻酔し、氷の上にガラスシャーレに入れ、それらを転送する。オス蚊を分離して捨てる。男性のアンテナは、女性に比べて著しくbushierです。
  4. PBSで2つのシリンジを記入し、26ゲージ半インチ(G ½)針とそれらをフィット。スライドグラス上にシリンジからのPBS 100μL程度預金。
  5. PBSのドロップに5〜10麻酔メスの蚊を移し、解剖顕微鏡でスライドを配置する。
  6. 同じ針を使用すると、胸部と後腹部に昆虫を持って、その後、各蚊の羽と足を削除、中腸、白い袋状体、リリースされるまでは離れて身体を引っ張る。腸を切り離し、本体の残りの部分を捨てる。
  7. スライドが乾燥している場合腸に多くのPBSを追加。乾燥させる場合腸が退化します。 midgutsにカバースリップを置きます。
  8. 100倍の倍率で、光学顕微鏡下でmidgutsを調べます。 (図3)それぞれの中腸でオーシストの数を数える。オーシストはmidgutsの外面上にある厚肉円形の構造物として認識できます。
  9. 終了したら、注射器、針、そして鋭利ビンのスライド処分する。
  10. オーシストはmidgutsに存在しない場合、gametocytesの高い数と感染したマウスで蚊を供給し、より長い餌の時間を与える。温度は、このステップが重要です。温度が24から26℃に設定されていることを確認

5。遠心法による蚊からスポロゾイトを収集

  1. 次のようにスポロゾイトコレクションチューブを準備します。クリーンな0.5 mLの遠心管の蓋をカットし、燃え上がる19 Gの針を使用してチューブの底に穴(0.1〜0.2ミリメートルの直径)をパンチ。
  2. グラスウールとチューブの1 / 3を埋める。 1.5 mLのコレクションチューブ(一管が約100蚊からスポロゾイトを収集するのに十分である)にフィルターチューブを挿入します。
  3. 17日目後の給餌では、ケージからアスピレーターを使用して、小さな容器の中に蚊を(ステップ4)を収集。
  4. 蚊を麻酔するためにCO 2ガスを使用してください。
  5. 男性蚊から女性を区切ります。容器から氷の上にガラスシャーレに麻酔したメスの蚊を転送します。
  6. 26 G ½ PBSで満たされた注射針で2つのシリンジを準備します。スライドグラス上にシリンジからのPBS 100μL程度預金。
  7. 顕微鏡スライド上に蚊を転送する。解剖顕微鏡下で蚊の頭、翼、脚、腹部を削除します。
  8. 先の細いピンセットを使用すると、1.5 mLのホモジナイザー(乳鉢と乳棒)の0.5mLのPBS中に胸部を移す。氷の上胸部を保存する(スポロゾイトは2〜3時間感染のまま)。
  9. (図3を参照)唾液腺からスポロゾイトを解放するために氷の上胸部をホモジナイズし、ガラスピペットを用いて、ガラスウール(ステップ5.1から5.2)で満たされたチューブにライセートを(ホモジネート)に転送。
  10. 室温で1000rpmで10〜20秒間遠心します。
  11. フロースルー(精製のスポロゾイトの懸濁液)22から30 Gの針と注射器を使用して収集する。 (オプション:ドロップフロースルーを顕微鏡スライド上に、カバーが標準的な光学顕微鏡、400X倍率下でのライブスポロゾイトをスリップし、視覚に配置、また、参照して図3の10〜50μL)
  12. マウスにスポロゾイトサスペンションのIP 0.1から0.5 mLを注入する(最大200,000寄生虫への単一の蚊から収穫することができる。文献12を参照してください)​​。成功した場合には、動物は注射後72時間を感染します。

6。限界希釈を用いてクローニング子孫

  1. スポロゾイトの注射後の七十二時間、(詳しい手順については補足資料を参照してください)​​薄い血液塗抹標本のギムザ染色後、赤血球の細胞密度の測定のための顕微鏡検査のための別の寄生虫の株に感染twoドナーマウスから尾部血を採取する。
  2. 0.1から1パーセントの寄生虫を表示するマウスを選択し、その感染した赤血球は、クローニングプロシージャのためのドナーとして、主に単一の寄生虫が含まれています。マウスは微視的に負の場合、6.1次の日繰り返します。動物は14日以内に感染していない場合、)5にステップ2を繰り返し、ステップ5.11スポロゾイトの存在を決定する。
  3. CONを達成するように子牛血清と哺乳類リンゲル液の冷1:1溶液(2.7 mMの塩化カリウム、1.8 mMの塩化カルシウム、154 mMの塩化ナトリウム)で収穫された尾の血を薄める100μLあたり0.6から1に感染した赤血球のセンタリング、そして氷の上に接種して保存する。このように、個々のマウスのほとんどは、1または0の寄生虫のいずれかを受信する必要があります。
  4. 静脈内投与50から100のマウスのそれぞれの希釈感染血液100μLを注入する。
  5. 5〜7日後、ギムザ染色した血液を薄めるの塗抹標本を調べることによって、血液ステージ寄生虫の存在のためのマウスをスクリーニングする。成功した実験で、マウスの20〜50%が感染すると8日目、感染後に0.1から5.0パーセントの寄生虫が表示されます。

7。遺伝マーカーを用いて後代の特性評価

  1. チルド生理クエン酸食塩水、ボルテックスを短時間、及びペレットに室温で3000rpmで3分間遠血液細胞の0.2mLを含んでいる1.5 mLのマイクロ遠心チューブにマウスの尾の血液の20〜40μLを収集する。すぐにDNAを抽出または-80ペレット℃を保つ
  2. 任意の標準的なDNA抽出法を用いて寄生虫のDNAを準備します。 DNAの迅速分離のために、高純度PCRテンプレート調製キット(ロシュダイアグノスティックスバイオサイエンス)を使用します。
  3. 組換え子孫は、マイクロサテライト(MS)や遺伝的交雑の2つの親系統を区別できる、異なる染色体上の一塩基多型(SNP)を用いて遺伝子型の後に識別されます。 P.のMS遺伝子タイピングのための単一蛍光標識したプライマーを用いて、簡便法yoeliiは、(REF 8,9を参照)を使用することができる。

8。血液ステージマラリア原虫の凍結保存

  1. 50〜10 mLの50から20パーセントの寄生虫血で麻酔マウスから心臓穿刺による感染血液の0.5〜1 mLを収集するには、生理食塩水を冷やした。
  2. 室温で2000rpmで5分間遠心する。上清を捨てる。
  3. 血液のペレットにGlycerolyte 57ソリューション(Fenwalの研究所)の滴2倍のボリュームを加え、よく混ぜる。
  4. クリオチューブ(試験管当たり0.2から0.5 mL)に懸濁液を移す。
  5. -80 ° C(最大1ヶ月)で、または液体窒素で凍結保存した血液を保管してください。

9。代表的な結果:

成功した実験では、クローン化された行の5〜10%は、独立した組換え子孫になります。

図1
図1。遺伝的交雑の間にライフサイクルと遺伝的組換え現象の概略を表現。遺伝子組換えイベントは、蚊の開発の初期段階で行われる。蚊の中腸の異なる遺伝的背景の"半数体"男性と女性の配偶子の受精に続いて、"二倍"受精卵が形成されています。接合子は、寄生虫のライフサイクルの唯一の二倍のステージを構成し、減数分裂は受精の12時間以内に従っており、蚊や哺乳類のすべての後続の段階では、半数体のまま。結果として得られる受精卵はookinetesとオーシストに開発しています。各オーシストの生育と有糸分裂は、蚊"hemocealに放出されるスポロゾイト、数千を生成します。唾液腺に移行それらのスポロゾイトが肝臓と赤血球の段階の開発が行われる哺乳動物宿主、に送信する立場にあります。赤血球サイクルの過程で、いくつかの寄生虫が成熟したオスとメスgametocytesに分化することができる。これらのgametocytesが伝送を永続させる、別の蚊によって取り込まれる際に寄生虫のライフサイクルは完了です。

図2
図2。マラリア原虫と組換え後代の生産における核遺伝子の継承。遺伝子組換えは、染色体の再集合を介して、またはクロスオーバーのイベントによって生成することができます。ホモ接合性の子孫は、同じ親クローン1または2(AとD)、それぞれの配偶子の間に自殖によって生成。 B)二つの異なる親のクローンを、単独で染色体の再集合によって形成されている組換え核(青い楕円)の配偶子間のクロス受精によって生成されるヘテロ接合子孫。 C)相同染色体の非姉妹染色分体の間に陸橋が形成されている2つの異なる親のクローン、組換え核(赤楕円)の配偶子間のクロス受精から生産ヘテロ接合子孫。

図3
図3。げっ歯類のマラリア原虫yoeliiの形態。 10日目のポストでオーシストを持つA)段リング、B)栄養型、C)シゾント、D)メロゾイト、E)幼若雄生殖母体、F)成熟した雄の生殖母細胞、G)未成熟雌の生殖母体、H)成熟した雌の生殖母体、私は)中腸給餌(矢印で示される成熟したオーシスト、200倍)、J)蚊の唾液腺(100 ×倍率)、K)スポロゾイト(400X倍率)。

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Discussion

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我々はまた、他のげっ歯類malariasの遺伝的交雑の製造に適用可能である齧歯類マラリア原虫yoelii、の遺伝的交雑の生産のための手法を示します。単一の親のクローンを持つマウスの感染は通常、親がクロスを実行する前に、機能的な配偶子の生産で有能であることを保証するために親の寄生虫の転送に成功したことを判断するために実行されます。

蚊を介して転送の成功は、昆虫館の温度、使用される齧歯類のマラリア原虫の種、および血液ステージ寄生虫の投与(接種のサイズ)を含む複数の要因によって影響される。 P. bergheiの伝送は、通常、19〜21 ° C 13、P.の伝送が達成されている間yoeliiとP. chabaudiは日常的に23〜25 ° C 14で実行されます。 P.のOokinetes bergheiは温度でオーシストに開発するために失敗する16℃より低い、または24℃以上15。温度に加えて、接種量は、血液中のマラリア原虫の増殖率に影響を与えることができます。大規模な接種量の注射は(5 × 10 6 iRBC以上)感染の非常に早い段階でより高い寄生虫が得られるものの、それは必ずしもgametocytesや蚊に高い感染力の大きな数字につながるものではない。ガッズビーとその他(2009)16は、P. chabaudiアダミのgametocytesは20日目に3日目(13日目でのピーク)から血液中にiRBC 1 × 10 6の感染後に存在することを示したが、6日目、感染後にのみです。毎日これにより蚊が感染する。また、このようなクローンN67(nigeriensis)、17XL、およびP. yoeliiYM、P.のクローンANKAとして急成長していると病原性原虫株の大規模な接種量の投与マウスの体温の著しい低下を引き起こす可能性マウスの重症貧血と病理のberghei、およびP. chabaudiアダミのクローンDSは、しばしば結果、。その結果、マウスは、蚊が少なく感染(未発表所見)になる。それにもかかわらず、げっ歯類のマラリア原虫の伝送は、標準的な接種量(10 6 iRBC)で行われている。それは見出されているP. bergheiP. P. chabaudi chabaudiとP. chabaudiアダミは、マウス16、18の血液段階誘発性感染症の後、6日目に蚊にのみ感染するのに対しyoeliiは 、マウス17の血液段階誘発性感染後5日間の3から蚊への伝染です。

組換え子孫の生産に影響を与える要因には、マウスの2つの親系統のgametocytesの割合が含まれています。理論的には、組換え後代の最大生産量は親のクローンの両性のgametocytesが同数になると自家受精と他家受精が同じ周波数で発生した場合に発生します。この条件の下で、結果として得られる接合体の半分はハイブリッドになり、残りは2つの親クローンラインの等しい比率で構成されます。 gametocytesの割合は、自家受精不均等につながる、ある親クローンに偏っているときに組換え子孫クローンの生産が大幅に削減されます。また、寄生虫はしばしば異なる成長率を持っているとgametocytes 16、19の生産に異なる能力を持つことができます。したがって、それは蚊餌用マウスに注入される混合物中の親の寄生虫の比率を最適化する必要があります。

蚊の給餌後の血中から寄生虫のクローンを作成する時間も考慮すべき重要な要素です。それは寄生虫がクローニング重複クローンを避けるために、0.1から1.0パーセント(血液中の複製の数が多すぎるのサイクルの前に)の間にあるときに遺伝的交雑の子孫のクローンを作成するのが好ましい。高速または低速成長している寄生虫は、一定期間で大量に出てくる可能性があり、高速または低速成長している寄生虫のピーク時のクローニングは、同じ表現型を有するクローンとなってしまいます。

結論として、げっ歯類のマラリア原虫を用いて遺伝的交雑を実行すると、簡単に相対し、人間のマラリア原虫P.の遺伝的交雑を行うよりはるかに安いです。ヒト以外の霊長類の感染を必要とする熱帯熱マラリア 、。遺伝的交雑の組換え子孫は遺伝的連鎖地図の構築および寄生虫の開発、薬剤耐性、および病原性などの重要なマラリア形質のマッピングのための便利なツールです。

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Disclosures

著者は公務員であり、これは政府の仕事なので、仕事は米国でパブリックドメインのソフトウェアです。その他の契約にかかわらず、NIHは、表示用PubMedCentralに仕事を提供し、公共で使用する権利を留保し、PubMedCentralはその慣習と一貫性のある作業にタグを付けるか修正することができます。あなたは政府の使用ライセンスに米国の対象外の権利を確立することができます。

Acknowledgments

私たちは、原稿の重要な読書のために、博士ランディエルキンズ、ロビンKastenmayer、テッドトーリー、ダンパレとToviリーマンに感謝。この作品は、#2007CB513103、学内研究の部門の学内研究プログラム、アレルギーや国立感染症研究所、国立衛生研究所によって、中国の973国家基礎研究プログラムによってサポートされていました。我々は援助のためにNIAID学内エディタブレンダレイマーシャルに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glyerolyte 57 solution Cenmed 4A7833
Mouse Mus musculus Charles River Laboratories Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum Invitrogen 26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1) MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67 MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer Nexcelom Bioscience Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit Roche Group 11 796 828 001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich GS500
Ketamine hydrochloride Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S4641
Xylazine Akorn Inc 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool VWR international 32848-003
Glass capillary (1 μL) VWR international 53440-001
Hemocytometer VWR international 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer VWR international KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquit–s
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquit–s

Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).
げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル
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Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).More

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

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