Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Summary

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl gösterir

Abstract

Antimalaryal yanıt ve sıtma parazitleri, patojenite Varyasyon, biyolojik ve tıbbi önemi. Bağlantı haritalama ^1-3 kemirgenler ve insanlarda ^4-6 sıtma parazitleri çeşitli özelliklerin altında yatan gen veya lokusların başarılı tanımlanmasına yol açmıştır. Sıtma paraziti Plasmodium yoelii vahşi Afrika kemirgenler izole birçok sıtma türlerinin biridir ve laboratuvarlarda büyümeye adapte edilmiştir. Bu tür birçok insan sıtma parazitlerinin biyolojik özellikleri yeniden üretmesidir; parazit ^7-9 mikrosatellit ve amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) işaretleyicileri gibi genetik belirteçleri için geliştirilmiştir. Böylece, kemirgen sıtma parazitleri Plasmodium falciparum araştırma tamamlamak için genetik çalışmalar yapılabilir. Burada, P. genetik bir çapraz üretmek için teknikler göstermektedir yoelii ilk kez Dr tarafından öncülük edilmiştir . David Walliker Richard Carter ve arkadaşları ^10, Edinburgh Üniversitesi.

P. de Genetik haçlar yoelii ve diğer kemirgen sıtma parazitleri ilgi fenotipleri ve sivrisinek, 4 gün sonra enfeksiyon enfekte fareler üzerinde beslemek için izin vererek farklı genetik olarak farklı iki klonların gametocytes içeren bir inokulum ile enfekte fareler Mus musculus tarafından yapılmaktadır . Erkek ve dişi fare kan gametocytes varlığı mikroskobik beslemeden önce teyit edilir. Beslenmeden sonra 48 saat içinde, sivrisinek midgut, haploit gametocytes, erkek ve dişi eşey hücrelerinin içine ayırt döller ve diploid zigot formu (Şekil 1). Bir ookinete bir zigot gelişimi sırasında, mayoz ^11. meydana görünür. Zigot genetik olarak farklı iki parazitler, genetik değişim (homolog kromozom çiftinin olmayan kardeş kromatidler arasında kromozomal reassortment ve cross-over; Şekil 2) gamet arasındaki çapraz döllenme yoluyla elde edilen ise, rekombinasyon sonuçlanan oluşabilir homolog lokusların genetik materyal. Her zigot dört haploit çekirdeklerin önde gelen, birbirini izleyen iki nükleer bölünmeler uğrar. Bir ookinete daha bir ookist içine geliştirir. Ookist olgunlaştıkça sonra, sporozoites (çapraz döl) binlerce oluşan ve sivrisinek hemoceal salınır. Sporozoites tükürük bezleri hasat öncesi eritrosit ve eritrosit aşama bir gelişme gerçekleşir yeni bir fare ev sahibi, içine enjekte edilir. Eritrosit formları klonlanmış ve genetik bağlantı haritalama önce ebeveyn hatları ayırt edici karakter bakımından sınıflandırılır. Bireysel ebeveyn klonların Kontrol enfeksiyonlar, genetik çapraz üretim olarak aynı şekilde yapılmaktadır.

Protocol

Farelere deneysel sonuçların bulandırabilir eksojen enfeksiyöz ajanların yanlışlıkla giriş önlemek için hayvanlar içine yönetilmektedir olacak bütün malzemeleri aseptik teknikler uygulanmalıdır.

1. Kan sahne Sıtma Parazitler Laboratuvar Fare Enfeksiyon

1. Oda sıcaklığında çözünme, dondurulmuş kan sahne sıtma parazitleri içeren iki şişeleri geçilebilir. Bu örnekte, iki kemirgen sıtma paraziti suşları Plasmodium yoelii yoelii ve Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Fit bir şırınga ve bir 22-30 gauge (G) iğne ile steril, ilaç sınıf PBS (pH 7.4) 400 mcL hazırlamak.
3. Içerik homojen olarak karıştırılmış kadar şırınga kadar ters ve aşağı aynı şırıngayı kullanarak, 100 mcL çözülmüş enfekte kan hazırlamak. (Opsiyonel: Bir pipet enjeksiyon için bir şırınga içine aktarılmadan önce bir toplama tüpüne PBS ve enfekte kan aktarmak için kullanılır olabilir).
4. Parazit doğrudan bir fare periton içine solüsyon içeren 200 mcL enjekte edilir. Bittiğinde, kavuz bin şırınga atın. (Laboratuar farelerine bakım için Ek Malzemeleri). Genel olarak, standart inokulum boyutu orijinal dondurulmuş malzeme parazit enfeksiyonları düzeyleri bağlı olarak, 100-500 mcL arasında.
5. Iki fareler her geçtiler iki parazit suşları enjekte edilir. Fareler enjeksiyondan sonra 3 ila 5 gün mikroskobik pozitif olacak. % 1-5 arasında parasitemias ulaştığınızda, bir sonraki adıma geçin.

2. Fare Karma Clone Enfeksiyon

1. Karışık klon enfeksiyonu önce, mikroskobik inceleme Giemsa lekeli Kan frotilerinin (Şekil 3) farklı parazit suşları ile enfekte olan iki donör farelerden alınan kuyruk kan toplamak ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) .
2. Daha önce elde edilen parasitemia ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümleri kullanarak, serum fizyolojik (% 1.5 w / v trisodyum sitrat dihidrat, 0.85% w / v sodyum klorür) ve inokulum karışımı üretmek için gerekli fare kan hacmi hesaplayın.
3. 100μl başına bir milyon bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin bir final konsantrasyon parazit çözüm ayarlayın.
4. Karışık bir klonu inokulum elde etmek için iki vericilerden 1:1 oranında enfekte kan birleştirin. Iki ebeveyn klonların büyüme hızında farklılık, oranlarını ayarlamak 1:2 veya 1:5 yavaş büyüyen bir ebeveyn klonu ebeveyn hızlı büyüyen bir.
5. Enfekte olduğu için her fare periton içine karışık örnek 100 mcL enjekte edilir. (3.9 adım enjekte edilen farelerin sayısını belirlemek için ayrıca bkz.)
6. Bu yöntemi kullanarak, tek ebeveyn suşları ile her iki fareleri enfekte. Tek klonu enfeksiyonları iki ebeveyn suşlarının başarılı iletim belirlenmesine olanak sağlayacaktır.

3. Besleme Sivrisinekler

1. 300-500 yetişkin (erkek ve kadın), pupa gelen Anofel stephensi sivrisinekler, her yaş sonrası 5-7 gün ortaya çıkması içeren üç kafesleri hazırlayın. Kapları, plastik ya da metal kapağı güvenli file ile kaplıdır. İki kafesleri ebeveyn klonlar beslemek için; üçüncü kafes genetik bir haç hazırlanması için.
2. Karma klonu enfeksiyon dört gün sonra başlayarak, enfekte olmuş fareler Giemsa lekeli ince kan kuyruk smear hazırlamak.
3. 1000x büyütme en az 50 mikroskobik alanları tarayarak, bir mikroskop altında smear incelemek ve erkek ve kadın gametocytes mevcut olup olmadığını belirlemek.
4. Erkek ve kadın gametocytes büyük vakuol ve büyük granüller (Şekil 3) varlığı nedeniyle dikkatleri üzerine çekiyor. Erkek ve kadın gametocytes sırasıyla, pembe ve mavi sitoplazma var. Gametocytes varsa, 3.6 adım izleyin.
5. Gametocytes yok ise, günlük izleme göründükleri kadar tutun. Gametocytes varsa, aşağıdaki adımla devam edin.
6. 50 mcL ketamin ve 3 mg / ksilizin ml her enfekte fare (20 gram fare vücut ağırlığı başına) uyutmak için bir fare periton içine 33 mg / ml içeren anestezik ilaç kokteyli enjekte edilir. Final doz ketamin ve ksilizin sırasıyla 82.5 ve 7.5 mg / Kg.
7. Fareler 24 saat açlık ve şeker kaynağı sivrisinek kesinti olmadan 30 dakika boyunca beslemek için izin yetişkin Anofel stephensi sivrisinek içeren bir kafesin üstünde yüz aşağı yerleştirin.
8. Standart koşullar (laboratuvar sivrisinek bakım için Ek yöntemleri sıcaklığı 24-26 arasında tutulur ° C) altında bir insectary sivrisinek koruyun.
9. Her 50-100 dişi sivrisinekler için bir enfekte fare kullanın. Fareler anestezi altında iken, beslenme sonrasında servikal dislokasyon farelerin hemen Euthanize.

4. Diseksiyon Sivrisinek Midguts ve Sayma ookistleri

1. Besleme dokuz gün sonra, sivrisinek, böcek midgut ookistleri için ele alınacaktır. Tek klonu enfekte fareler üzerinde beslenen iki ebeveyn suşlarının bu gametocytes gösterir sivrisinek ookistleri varlığı bulaşıcıdır.
2. Bir sivrisinek midgut incelemek için, 5-10 enfekte sivrisinek kafes toplamak için küçük bir kapta bağlı bir aspiratör kullanın.
3. CO ₂ gazı kullanılarak, sivrisinek uyutmak ve buz üzerinde bir cam petri kabı içine aktarabilirsiniz. Ayrı ve erkek sivrisineklerin atın. Antenler erkeklerde kadınlara oranla belirgin şekilde bushier vardır.
4. PBS ile iki şırınga doldurun ve 26 göstergesi yarım inç (G ^½) iğne ile bunlara uyan. Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL.
5. PBS damla üzerine aktarın ve 5 ila 10 anestezi dişi sivrisineklerin diseksiyon mikroskobu slayt yerleştirin.
6. Aynı iğneler kullanarak, toraks ve arka karın böcek tutan, daha sonra, her bir sivrisinek kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak dışında vücudun midgut, beyaz bir kese gibi vücut yayınlandı kadar çekin. Midgut ayırın ve vücudun geri kalanı atın.
7. Slaytlar kuru midgut hakkında daha fazla PBS ekleyin. Kurutulmuş izin verirseniz midgut dejenere olacaktır. Midguts üzerinde bir kapak kayma yerleştirin.
8. 100x büyütmede ışık mikroskobunda midguts inceleyin. (Şekil 3) her midgut ookistleri sayıları sayma. Ookistleri midguts dış yüzeyinde yer alan kalın duvarlı yuvarlak yapılar olarak dikkatleri üzerine çekiyor.
9. Tamamlandığında, şırıngalar, iğneler, ve bir dikiş iğnesi bin slayt atmayın.
10. Ookistleri midguts yok ise, yüksek sayıda gametocytes ile enfekte fare ile sivrisinek beslemek ve daha uzun bir beslenme zaman vermek. Sıcaklık bu adım için kritik öneme sahiptir. Sıcaklık 24 - 26 ° C'de ayarlanmış olduğundan emin olun.

5. Santrifüj tarafından Sivrisinekler Sporozoites toplanıyor

1. Aşağıdaki gibi sporozoite toplama tüpleri hazırlayın: 0.5 mL temiz bir santrifüj tüpüne kapağı kesme ve Alevli 19 G iğne kullanılarak tüp dibinde (0.1-0.2 mm çapında) bir delik yumruk.
2. 1 / 3 'tüp cam yünü ile doldurun. (~ 100 sivrisinek hasat sporozoites için yeterli bir tüp), 1.5 ml toplama tüpünün içine filtre tüp takın
3. Gün 17 Mesaj beslenme, küçük bir kap içine bir aspiratör kullanarak kafesleri sivrisinek (Adım 4) toplamak.
4. CO ₂ gaz, sivrisinekler uyutmak için kullanın .
5. Erkek sivrisineklerin dişileri ayırın. Buz üzerinde bir cam petri kabı konteyner anestezi dişi sivrisinekler aktarın.
6. PBS ile dolu, 26 ^G ½ iğne ile iki şırınga hazırlayın . Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL.
7. Sivrisinekler bir mikroskop lamı üzerine aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında sivrisinek 'kafa, kanatlar, bacaklar ve karın çıkarın.
8. Ince uçlu forseps kullanma, 1.5 ml homojenizatör (havanda) 0.5 ml PBS thoraxes transfer. (Sporozoite 2-3 saat için infektif kalır) thoraxes buz üzerinde saklayın.
9. (Bkz. Şekil 3), tükürük bezlerinin sporozoites serbest bırakmak için buz üzerinde thoraxes homojenize ve cam yünü (Adım 5,1-5,2) bir cam pipet kullanarak dolu tüpe ilginçtir (homojenatlarında) aktarmak.
10. Oda sıcaklığında 1000 rpm'de 10 ila 20 saniye boyunca santrifüjleyin.
11. Toplayın akış yoluyla 22-30 G iğne ile (saflaştırılmış sporozoite süspansiyon) bir şırınga kullanarak. (Opsiyonel: damla 10-50 mcL akış ile mikroskopik bir slayt, bir kapak, 400X büyütme standart bir ışık mikroskobu altında canlı sporozoites kayma ve görselleştirmek yer, ayrıca bkz Şekil 3)
12. Fareler (bkz. ref 12 kadar 200.000 parazitler tek bir sivrisinek hasat edilebilir) içine sporozoite süspansiyon ip 0.1-0.5 ml enjekte edilir. Başarılı bir durumda, hayvanın bir enjeksiyondan sonra 72 saat enfekte olacak.

6. Sınırlı Seyreltme kullanarak Klonlama Döl

1. Sporozoite enjeksiyondan sonra yetmiş iki saat, Kan frotilerinin Giemsa boyama sonrası ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için mikroskobik inceleme için farklı parazit suşları (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) ile enfekte iki donör farelerin kuyruk kan toplamak.
2. % 0.1 ila 1 parasitemia gösteren bir fare seçin ve enfekte kırmızı kan hücreleri, klonlama işlemi için bir bağış olarak çoğunlukla tek parazitleri içerir. Farelerin mikroskobik negatif ise 6.1 önümüzdeki günlerde adımı yineleyin. Hayvanlar 14 gün içinde enfekte değilse) 5 Adım 2 tekrarlayın ve adım 5.11 sporozoites varlığını belirlemek.
3. Buzağı serum ve memeli Ringer solüsyonu (2.7 mM potasyum klorür, 1.8 mM kalsiyum klorür, 154 mM sodyum klorür) soğuk bir çözüm 01:01 hasat kuyruk kan sulandırınız kadar, con ulaşmak1 bulaşmış kırmızı kan 100 mcL başına hücre ve buz üzerinde inokulum saklamak için 0,6 santrasyondan. Bu şekilde, bireysel fare çoğu ya bir veya sıfır parazitler almalıdır.
4. Intravenously, her 50 ila 100 farelerin seyreltilmiş enfekte kan 100 mcL enjekte.
5. Beş ila yedi gün sonra fareler, Giemsa lekeli Kan frotilerinin inceleyerek kan sahne parazitlerin varlığı için ekran. Başarılı bir deneyde, farelerin% 20-50 enfekte olmakta ve% 0,1-5,0 gün 8 yazılan enfeksiyon parasitemia gösterecektir.

7. Genetik Markers kullanarak Döl Karakterizasyonu

1. 0.2 mL soğutulmuş fizyolojik sitrat salin solüsyonu, vorteks kısaca ve pelet kan hücreleri için oda sıcaklığında 3000 rpm'de 3 dakika santrifüj içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 20 ila 40 mcL fare kuyruğu kan toplayın. Hemen DNA özü veya -80 ° C pelet tutmak
2. Parazit DNA herhangi bir standart DNA ekstraksiyonu yöntemleri kullanarak hazırlayın. Hızlı DNA izolasyonu için, bir Yüksek Saf PCR şablon hazırlık seti (Roche Uygulamalı Bioscience) kullanın.
3. Rekombinant döl mikrosatellit (MS) veya farklı kromozomlar üzerinde genetik çapraz iki ebeveyn suşları ayırt tek nükleotid polimorfizmi (SNP) kullanarak genotipleme sonra tespit edilir. P. MS genotipleme için tek floresan etiketli primerler kullanılarak basitleştirilmiş bir yöntem yoelii (bkz. ref 8,9) kullanılmalıdır.

8. Kan aşamalı Sıtma Parazitler, Kriyoprezervasyon

1. 5-10 ml% 5-20 parasitemia ile bir anestezi fare kalp ponksiyonu ile enfekte kan toplayın 0.5-1 ml serum fizyolojik solüsyonu soğutulmuş.
2. Oda sıcaklığında 2000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatant atın.
3. Glycerolyte 57 çözüm açılan bilge 2x hacmi (Fenwal Laboratories) kan pelet üzerine ekleyin ve iyice karıştırın.
4. Süspansiyon (tüp başına 0.2-0.5 ml) cryotubes aktarın.
5. -80 ° C'ye kadar (1 ay) sıvı nitrojen ya da Kriyoprezerve kan saklayın.

9 - Temsilcisi Sonuçlar:

Başarılı bir deneyde, klonlanmış hatların% 5-10, bağımsız rekombinant döl olacaktır.

Şekil 1, genetik çapraz sırasında yaşam döngüsü ve genetik rekombinasyon olayları şematik . Genetik rekombinasyon olayları sivrisinek gelişiminin erken aşamasında yer alır. Sivrisinek midgut farklı genetik kökenden "haploid" erkek ve dişi eşey hücrelerinin döllenme sonrasında, "diploid" zigot oluşur. Zigot, parazitin yaşam döngüsünün sadece diploid aşamasını teşkil etmektedir, mayoz bölünme, döllenme 12 saat içinde izler ve sivrisinek ve memeliler sonraki tüm aşamalarında haploid kalır. Ortaya çıkan zigot ookinetes ve ookistleri dönüşebilir. Büyüme ve mitoz bölünme her ookist sivrisinek 'hemoceal salınan sporozoites binlerce üretir. Tükürük bezlerinin göç olanlar sporozoites, karaciğer ve kırmızı kan hücre aşamalarında gelişme gerçekleşir bir konak memeli, iletilebilir konumda bulunmaktadır. Kırmızı kan hücre siklusu seyri sırasında, bazı parazitler, olgun erkek ve kadın gametocytes ayırt edebilirsiniz. Bu gametocytes başka bir sivrisinek, sürdürmekte iletim tarafından alındığında, parazitin yaşam döngüsü tamamlanmış olur.

Şekil 2, sıtma parazitleri ve rekombinant döl üretiminde nükleer genlerin Devralma . Genetik rekombinasyon kromozomal reassortment yoluyla veya çapraz olaylar oluşturulabilir. Homozigot döl aynı ebeveyn klon 1 veya 2 (A ve D), sırasıyla gamet arasında selfing tarafından üretilen. B) İki farklı ebeveyn klonlar, sadece kromozom reassortment tarafından oluşturulan rekombinant çekirdekleri (mavi oval) gamet arasındaki çapraz döllenme tarafından üretilen heterozigot döl. C) homolog kromozomların kardeş olmayan kromatidler arasındaki geçitler tarafından oluşturulan iki farklı ana klonlar, rekombinant çekirdekleri (kırmızı oval) gamet arasındaki çapraz döllenme üretilen heterozigot döl.

Şekil 3 kemirgen sıtma paraziti Plasmodium yoelii morfolojisi. 10 gün sonrası ookistleri A) halka aşaması, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) olgunlaşmamış erkek gametocyte, F) olgun erkek gametocyte G) olgunlaşmamış dişi gametocyte, H) olgun kadın gametocyte, I) midgut besleme (oklarla gösterilen olgun ookistleri, 200x büyütme), J) sivrisinek tükürük bezleri (100x büyütme), K) sporozoites (400x büyütme).

Discussion

Biz, aynı zamanda diğer kemirgen malarias genetik haçlar üretimi için geçerli kemirgen sıtma Plasmodium yoelii, genetik bir haç üretim teknikleri göstermektedir. Tek ebeveyn klonları ile farelerin enfeksiyonları genellikle ebeveynlerin çapraz yapmadan önce fonksiyonel gamet üretiminde yetkin olmalarını sağlamak için ebeveyn parazitlerin başarılı iletim belirlemek için yapılmaktadır.

Başarılı bir sivrisinek yoluyla aktarımı insectary sıcaklığı, kullanılan kemirgen sıtma parazitleri türleri, ve kan-aşamalı parazit dozlarda (inokulum büyüklüğü) de dahil olmak üzere bir çok faktör tarafından etkilenmektedir. P. berghei iletimi normal olarak 19-21 ° ^C 13, P. iletim elde edilmesine rağmen yoelii ve P. chabaudi rutin olarak 23-25 ​​° C ¹⁴ yapılır. P. Ookinetes berghei sıcaklıklarda ookistleri geliştirmek için başarısız 16 daha düşük ° C 24 veya daha yüksek ° C ^15. Sıcaklığına ek olarak, inokulum büyüklüğü kan sıtma parazitlerinin çarpma hızı etkileyebilir. Büyük bir inokulum büyüklüğü enjeksiyonu (5 x 10 ⁶ iRBC veya daha fazla), enfeksiyon çok erken aşamalarda daha yüksek parasitemia verim olsa da, mutlaka sivrisinekler için daha yüksek enfektivite gametocytes veya daha fazla sayıda yol değildir. Gadsby ve diğerleri (2009) ¹⁶ P. chabaudi adami gametocytes gün 3 gün 20 gün 13 pik kan iRBC 1 x 10 ⁶ sonrası enfeksiyon olduğunu gösterdi, ancak 6. günde yazılan enfeksiyon sadece gün bunun üzerine sivrisinek enfekte olur. Ayrıca, örneğin klonları N67 (nigeriensis), 17XL ve P. yoelii YM, klon ANKA P. gibi hızlı büyüyen ve öldürücü parazit suşlarının büyük bir inokulum büyüklüğü yönetimi berghei ve P. chabaudi adami klon DS genellikle fare vücut sıcaklığında önemli bir düşüşe neden olabilir farelerde ciddi anemi ve patoloji sonuçları. Sonuç olarak, fareler, sivrisinekler için daha az infektif (yayınlanmamış gözlemler) haline gelir. Bununla birlikte, kemirgen sıtma parazitlerinin şanzıman standart bir inokulum büyüklüğü (10 ⁶ iRBC) ile yapılmıştır. Bulunamadığını P. berghei ve P. yoelii P. chabaudi chabaudi ve P. chabaudi adami, ^{farelere 16,} 18 sahne kaynaklı enfeksiyonlar kan gün sonra 6 sivrisinekler sadece bulaşıcı ise, farelerin ^kan 17 sahne bağlı enfeksiyondan sonra 3 - 5 gün sivrisinek geçebilecek .

Rekombinant döl üretimi etkileyen faktörler, farelerde iki ebeveyn suşlarının gametocytes oranlarda içerir. Teorik olarak, rekombinant döl maksimum üretim gametocytes ebeveyn klonların her iki cinste eşit sayıda ve kendi kendine döllenme ve çapraz döllenme aynı frekansta meydana geldiğinde oluşur. Bu şartlar altında, ortaya çıkan zigot yarısı hibritler olacak ve geri kalan iki ebeveyn klon hatları eşit oranlarda oluşacaktır. Gametocytes oranı kendi kendine döllenme orantısız önde gelen bir ebeveyn klon karşı önyargılı zaman rekombinant döl klonların üretimi büyük ölçüde azaltılmış olacaktır. Ayrıca, parazitler genellikle farklı büyüme oranları ve gametocytes ^{16, 19} üretiminde farklı bir yeteneğe sahip olabilir . Bu nedenle, ebeveyn parazitler, sivrisinek beslenmesi için farelere enjekte edilecek karışım oranlarını optimize etmek için gereklidir.

Sivrisinek beslenme sonrasında kan parazitleri clone süresi de dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Parasitemia klonlama çoğaltılamaz klonlar önlemek için% 0.1-1.0 (kan çoğaltma çok sayıda döngüleri önce) arasındaki genetik haç döl clone tercih edilir. Hızlı veya yavaş büyüyen parazitler zaman belirli dönemlerde çok sayıda çıkıp, hızlı veya yavaş büyüyen parazitler doruklarına klonlama aynı fenotipleri olan klonlar ile sona erecek.

Sonuç olarak, kemirgen sıtma parazitleri kullanarak genetik haçlar yapılması kolay, göreceli ve genetik bir insan sıtma paraziti P. çapraz yapmak çok daha ucuza falciparum, insan dışı primat enfeksiyon gerektirir. Genetik haçlar Rekombinant döl parazit geliştirme, ilaç direnci ve virülans dahil olmak üzere önemli sıtma özelliklerin genetik bağlantı haritalarının yapımı için ve haritalama için yararlı araçlardır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.