الاستقراء والرصد من أحدث نوع فرط الحساسية المتأخرة (DTH) في الفئران

Summary

تأخر فرط نوع (DTH) هو رد فعل التهابية بوساطة CCR7 - المستجيب الخلايا اللمفية تي الذاكرة. نحن هنا لشرح كيفية حمل DTH النشطة في الفئران لويس ومراقبة الاستجابة للالتهابات.

Abstract

تأخر فرط نوع (DTH) هو رد فعل التهابية بوساطة CCR7 - المستجيب الخلايا اللمفية تي الذاكرة التي اختراق موقع من حقن ضد مستضد التي كانت تستعد للنظام المناعي. ويتسم رد فعل التهابية بواسطة احمرار وتورم في موقع التحدي مستضدي. ذلك هو نموذج مناسب لتحديد فعالية في الجسم الحي للمناعة. يمكن أن يتسبب DTH الجلدي إما عن طريق نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية T مستضد محددة أو عن طريق التحصين النشط مع مستضد ، وتحديا لاحقة مع الأدمة للمستضد للحث على رد فعل التهابية في منطقة الجلد معين. يمكن أن يتسبب ردود DTH لمستضدات مختلفة ، على سبيل المثال ovalbumin ، السلين والتيتانوس توكسويد ، أو ثقب المفتاح هيموسيانين اللزيق (KLH).

نحن هنا لشرح كيفية إحداث تفاعل نشط DTH في الفئران لويس. ونحن نستعد لأول مرة في المياه مستحلب النفط من KLH ، مستضد لدينا مصلحة في استكمال مساعد فرويند وحقن تحت الجلد هذا المستحلب للفئران. وهذا رئيس الجهاز المناعي لتطوير الخلايا التائية الذاكرة الموجهة إلى KLH. بعد سبعة أيام سوف نتحدى الفئران intradermally على الظهر مع KLH على جانب واحد مع ovalbumin ، وهو مستضد غير ذات صلة ، وعلى الجانب الآخر. سيكون رد فعل التهابية تكون مرئية 16-72 ساعة في وقت لاحق ، وسيتم قياس منطقة حمراء ومنتفخة كمؤشر لشدة DTH.

Protocol

1. إعداد مستحلب

1. المستحلب هو مزيج 01:01 من المستضد (يمكن أن يتسبب DTH لمستضدات مختلفة : ovalbumin ، ذوفان الكزاز ، ثقب المفتاح اللزيق هيموسيانين....) في محلول مائي إضافة إلى استكمال مساعد فرويند. من المهم جدا لإضافة المستضد إلى مساعد وليس العكس!
   
   
2. هناك الكثير من النفايات وعندما تقدم عن طريق الحقن مستحلب ، وذلك بإعداد دائما 1.5 أو 2 مرات أكثر مما تحتاج إليه.
   
   
3. مستضد في حل المالحة لإعداد 2 ملغ / مل حل. لا تصفية ، وكنت لا تريد أن تفقد المجاميع!
   
   
4. وضع كامل مساند فرويند H37Ra (Difco ، وأنواع # 231131) في أنبوب والدوامة بسرعة عالية. إضافة قطرة قطرة بينما مستضد vortexing. عند إضافة كل من المستضد ، دوامة لمدة 5 دقائق إضافية. وينبغي أن يتحول الخليط الأبيض.
   
   
5. وضع مستحلب في حقنة والزجاج ، وربطها باستخدام الزجاج حقنة أخرى جسرا 18G (فيشر كتالوج # 14-825 - 17L). إرسال مستحلب من حقنة لأخرى حتى يصبح من الصعب (5-10 دقيقة). فمن الأفضل لاستخدام اثنين من المحاقن 5 مل. إذا كانت هناك حاجة أكثر من 5 مل من مستحلب ، واستخدام عدة مجموعات من 5 مل المحاقن.
   
   
6. ويمكن تخزين مستحلب في الحقن في 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع.

2. تحصين الفئران

1. مزيج مستحلب في المحاقن لبضع دقائق ونقلها إلى الحقنة المستخدمة في الحقن. حقن تحت الجلد 200 مل 1-2 في مواقع عند قاعدة الذيل استخدام الإبر وLuer 23G - لوك طرف الحقنة مل 3.

3. التحدي مع المستضد في الظهر

1. سبعة أيام بعد التطعيم ، ويحلق 2 البقع على ظهورهم من الفئران وحقن intradermally 20 مل من محلول 1 مستضد ملغ / مل في بقعة واحدة والمالحة (أو مستضد غير ذي صلة) في بقعة أخرى. لا تصفية الحل المستضد ، كما كنت قد يفقدون المجاميع التي تعزز رد فعل للالتهابات.
   
   
2. وينبغي anesthesized الفئران لتجنب الحركات. حقن محلول باستخدام intradermally 27G ½ الإبر والمحاقن 1 مل. تغيير الإبر بين الحقن.
   
   ملاحظة : يمكن أن يتم الطعن في الصيوان للآذان الظهر بدلا من لقياسات أكثر دقة. انظر الفيديو في http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=325

4. قياس DTH

1. وسوف تبدأ في موقع الحقن تحول الحمراء وتورم كعلامة على الالتهاب. قياس قطرها من منطقة ملتهبة باستخدام المسطرة ، أو الأفضل من ذلك ، الفرجار ملف. ينبغي أن يحدث تورم القصوى بين 24 و 72 ساعة.

Discussion

لقياس أكثر دقة للتفاعل DTH نوصي تحدي الفئران مع المستضد في الصيوان من الأذن. ويمكن بعد ذلك أن يكون رد الفعل كما يقاس الفارق بين تورم في الأذن بالأذن مستضد تحدى ذات الصلة والأذن الطعن إما مع المياه المالحة وحدها أو مع مستضد غير ذي صلة. ويرد تظاهرة التحدي في الأذن في 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.