אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

Summary

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל לימפוציטים מסוג T זיכרון. כאן אנו מדגימים כיצד לגרום DTH פעיל חולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

Abstract

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-T לימפוציטים מפעיל זיכרון לחדור את האתר של הזרקה של אנטיגן נגד שבו המערכת החיסונית כבר דרוך. התגובה הדלקתית מאופיין אדמומיות ונפיחות של האתר של אתגר antigenic. זהו מודל נוח על מנת לקבוע את ביעילות vivo של מערכת החיסון. DTH עורית יכול להיגרם גם על ידי העברת המאמצת של אנטיגן ספציפי לערמונית לימפוציטים מסוג T או על ידי חיסון פעיל עם אנטיגן, והאתגר intradermal הבאים עם האנטיגן לעורר תגובה דלקתית באזור העור נתון. התגובות DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים, למשל ovalbumin, טוברקולין, טטנוס toxoid, או חור המנעול עלוקה hemocyanin (KLH).

כאן אנו מדגימים כיצד לגרום תגובת DTH פעיל לואיס חולדות. אנחנו יהיה הראשון להכין תחליב מים בתוך שמן של KLH, אנטיגן שלנו של עניין, להשלים adjuvant של פרוינד להזריק תת עורי אמולסיה זו לחולדות. זו תהיה הממשלה את מערכת החיסון לפתח תאים T זיכרון מופנה KLH. שבעה ימים לאחר מכן נוכל לקרוא תיגר על חולדות intradermally על הגב עם KLH בצד אחד עם ovalbumin, אנטיגן רלוונטי, בצד השני. התגובה הדלקתית יהיה גלוי 16-72 שעות לאחר מכן ואזור אדום ונפוח תימדד כאינדיקציה לחומרת DTH.

Protocol

1. הכנת התחליב

1. התחליב הוא תערובת 01:01 של אנטיגן (DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים: ovalbumin, הוסיף טטנוס toxoid, חור המנעול עלוקה hemocyanin ....) בתמיסה מימית כדי להשלים adjuvant של פרוינד. חשוב מאוד להוסיף את אנטיגן כדי adjuvant ולא להיפך!
   
   
2. יש הרבה פסולת בעת ביצוע והזרקת אמולסיה, ולכן תמיד להכין 1.5 או פי 2 יותר ממה שאתה צריך.
   
   
3. ממיסים אנטיגן מלוחים להכין 2 מ"ג / מ"ל ​​פתרון. לא לסנן, כמו שאתה לא רוצה לאבד המצרפים!
   
   
4. שים להשלים adjuvant פרוינד של H37Ra (Difco, קטלוג # 231131) בצינור ואת המערבולת במהירות גבוהה. הוסף את הירידה אנטיגן על ידי ירידה בעוד vortexing. כאשר כל אנטיגן הוא הוסיף, מערבולת במשך 5 דקות נוספות. התערובת צריכה להלבין.
   
   
5. שים את התחליב של מזרק זכוכית ולקשר אותו מזרק עוד כוס באמצעות גשר 18G (קטלוג פישר # 14-825-17L). שלח את התחליב של מזרק לצד השני עד שהוא הופך קשה (50-10 דקות). מומלץ להשתמש בשני מזרקים 5 מ"ל. אם יותר מ -5 מ"ל תחליב נדרשים, השתמש במספר קבוצות של 5 מ"ל מזרקים.
   
   
6. התחליב ניתן לאחסן מזרקים ב 4 ° C למשך 3 שבועות.

2. חיסון של החולדות

1. מערבבים את התחליב של מזרקים במשך כמה דקות ומעבירים מזרק המשמש הזריקה. להזריק 200 מ"ל תת עורי ב 1-2 אתרי בבסיס הזנב באמצעות מחטים 23G ו Luer-Lok קצה מזרק 3 מ"ל.

3. האתגר עם אנטיגן בגב

1. שבעה ימים לאחר חיסון, לגלח 2 נקודות על גבם של החולדות ולהזריק intradermally 20 מ"ל של פתרון מ"ג / מ"ל ​​1 אנטיגן בנקודה אחת מלוחים (או אנטיגן רלוונטי) במקום השני. האם לא לסנן את הפתרון אנטיגן, כפי שאתה עלול לאבד אגרגטים המשפרים את התגובה הדלקתית.
   
   
2. חולדות צריכות להיות anesthesized כדי למנוע תנועות. להזריק את הפתרון באמצעות intradermally 27G ½ 1 מחטים ומזרקים מ"ל. שנה מחטים בין זריקות.
   
   הערה: את האתגר אפשר לעשות פינה של האוזניים במקום האחורי למדידות יותר מדויקות. ראה וידאו http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. מדידה של DTH

1. האתר הזרקת יתחיל מאדימים ונפיחות כסימן של דלקת. מדוד את הקוטר של האזור דלקתי באמצעות סרגל או, עדיף, קליפר. נפיחות המקסימלי אמור להתרחש בין 24 ל 72 שעות.

Discussion

עבור מדידה מדויקת יותר של תגובת DTH אנו ממליצים תיגר על חולדות עם האנטיגן בתוך פינה של האוזן. התגובה אז יכול להיות, כפי שהיא נמדדת הבדל בין נפיחות באוזן האוזן אנטיגן תיגר רלוונטי האוזן תיגר עם מלוחים לבד או עם האנטיגן רלוונטי. הפגנה של האתגר באוזן מוצג 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.