Biology

प्रेरण और चूहे में सक्रिय विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) के निगरानी

Published: July 19, 2007 doi: 10.3791/237

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

Summary

विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) एक सूजन प्रतिक्रिया CCR7 effector स्मृति टी lymphocytes द्वारा मध्यस्थता है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे लुईस चूहों में सक्रिय डीटीएच प्रेरित करने और भड़काऊ प्रतिक्रिया की निगरानी.

Abstract

विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) एक सूजन प्रतिक्रिया CCR7 effector स्मृति टी lymphocytes कि एक प्रतिजन के खिलाफ जो प्रतिरक्षा प्रणाली primed किया गया है इंजेक्शन के साइट घुसपैठ द्वारा मध्यस्थता है. भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिजनी चुनौती के साइट की लालिमा और सूजन की विशेषता है. यह एक सुविधाजनक मॉडल immunosuppressants के vivo प्रभावकारिता में निर्धारित है. प्रतिजन विशेष टी lymphocytes के दत्तक हस्तांतरण या एक प्रतिजन, और दिया त्वचा के क्षेत्र में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए प्रतिजन के साथ बाद intradermal चुनौती के साथ सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा Cutaneous डीटीएच भी प्रेरित कर सकते हैं. डीटीएच प्रतिक्रियाओं विभिन्न एंटीजन को ovalbumin, ट्यूबरकुलीन, टिटनेस toxoid, या ताली लगाने का छेद लंगड़ाहट hemocyanin (KLH) के उदाहरण के लिए, प्रेरित किया जा सकता है.

यहाँ हम प्रदर्शन कैसे लुईस चूहों में एक सक्रिय डीटीएच प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए. हम पहले Freund सहायक पूरा करने में KLH, ब्याज की हमारे प्रतिजन के पानी में तेल पायस तैयार करेंगे और इस पायसन चूहों को subcutaneously इंजेक्षन. यह प्रतिरक्षा प्रणाली स्मृति टी KLH के लिए निर्देश कोशिकाओं को विकसित प्रधानमंत्री जाएगा. सात दिन बाद हम चूहों intradermally KLH के साथ पीठ पर एक तरफ और ovalbumin, एक अप्रासंगिक प्रतिजन के साथ दूसरी तरफ, चुनौती. भड़काऊ प्रतिक्रिया दिखाई 16-72 घंटे बाद हो जाएगा और लाल और सूजन क्षेत्र डीटीएच गंभीरता का एक संकेत के रूप में मापा जाएगा.

Protocol

1. पायस की तैयारी

ovalbumin, टेटनस toxoid, जलीय घोल में ताली लगाने का छेद लंगड़ाहट hemocyanin ....) Freund सहायक को पूरा करने के लिए कहा: पायस प्रतिजन की एक 1:1 मिश्रण (डीटीएच विभिन्न प्रतिजनों के लिए प्रेरित किया जा सकता है. यह बहुत महत्वपूर्ण है और दूसरे दौर की तरह नहीं सहायक प्रतिजन जोड़ने!
वहाँ कचरे का एक बहुत कुछ है जब बनाने और एक रासायनिक पायस इंजेक्शन, तो हमेशा 1.5 या 2 बार तुम क्या जरूरत से अधिक तैयार.
खारा में प्रतिजन भंग करने के लिए एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है. फिल्टर, के रूप में आप समुच्चय ढीली नहीं करना चाहती! मत!!
Freund सहायक H37Ra (Difco # सूची 231,131) पूर्ण और उच्च गति पर ट्यूब भंवर में रखो. ड्रॉप द्वारा ड्रॉप प्रतिजन जोड़ें जबकि vortexing. जब प्रतिजन के सभी जोड़ा जाता है 5 मिनट के लिए भंवर. मिश्रण सफेद बारी चाहिए.
एक गिलास सिरिंज में पायस रखो और इसे एक गिलास सिरिंज के लिए लिंक एक 18G पुल का उपयोग करते हुए (फिशर 14-825-17L # कैटलॉग). दूसरे के लिए एक सिरिंज से पायस भेजें जब तक यह मुश्किल (5-10 मिनट) हो जाता है. यह सबसे अच्छा है के लिए दो 5 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग कर सकते हैं. यदि पायस के 5 मिलीलीटर से अधिक आवश्यक हैं, 5 मिलीलीटर सीरिंज के कई सेट का उपयोग करें.
पायस 4 ° C पर सीरिंज में 3 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.

2. चूहों के टीकाकरण

कुछ मिनट के लिए सीरिंज में पायस मिक्स और इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता सिरिंज करने के लिए स्थानांतरण. 23g सुइयों और एक Luer लोक टिप 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर पूंछ के आधार पर 1-2 साइटों में 200 मिलीग्राम subcutaneously इंजेक्षन.

3. पीठ में प्रतिजन के साथ चैलेंज

सात दिन के प्रतिरक्षण के बाद, चूहों की पीठ पर 2 स्पॉट दाढ़ी और एक स्थान और अन्य स्थान में खारा (या अप्रासंगिक प्रतिजन) में एक 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान प्रतिजन के intradermally 20 मिली इंजेक्षन. प्रतिजन समाधान फिल्टर, के रूप में आप समुच्चय है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया को बढ़ाने ढीली हो सकता है नहीं है.
चूहों आंदोलनों से बचने के लिए anesthesized होना चाहिए. Intradermally साढ़े 27G सुइयों और 1 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग कर समाधान इंजेक्षन. इंजेक्शन के बीच सुइयों बदलें.

नोट: चुनौती अधिक सटीक मापन के लिए पीछे के बजाय कान के पंख में किया जा सकता है. पर वीडियो देखें http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. डीटीएच के मापन

इंजेक्शन स्थल की ओर लाल और सूजन का एक संकेत के रूप में सूजन शुरू कर देंगे. एक शासक या, बेहतर अभी तक, एक नली का व्यास का उपयोग सूजन क्षेत्र के व्यास उपाय. अधिकतम सूजन 24 और 72 घंटे के बीच हो जाना चाहिए.

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Discussion

डीटीएच प्रतिक्रिया का एक और अधिक सटीक माप के लिए हम कान के पंख में प्रतिजन के साथ चूहों को चुनौती देने की सलाह देते हैं. प्रतिक्रिया तो प्रासंगिक कान प्रतिजन को चुनौती दी है और या तो खारा अकेले के साथ चुनौती दी है या अप्रासंगिक प्रतिजन के साथ कान के बीच सूजन कान में एक अंतर के रूप में मापा जा सकता है. कान में चुनौती से निपटने के लिए एक प्रदर्शन 1 में दिखाया गया है.

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Disclosures

लेखकों Airmid इंक के लिए और सह संस्थापक सलाहकार हैं

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.