쥐에서 Active 지연 유형 과민성 (DTH)의 유도 및 모니터링

Summary

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기 루이스 쥐에 적극적으로 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

지연 유형 과민성 (DTH)은 면역 시스템이 준비하는되어있는 대한 항원의 주사의 사이트를 침투 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 염증 반응은 antigenic 도전의 사이트의 빨갛게과 팽창이 특징입니다. 그것은 면역 억제제의 생체내 효능에 결정하는 편리한 모델입니다. 피부 DTH는 항원에 특정한 T의 lymphocytes의 입양 전송 또는 항원, 그리고 주어진 피부 영역에서 염증 반응을 유발하는 항원과 이후의 intradermal 도전과 적극적인 예방 접종을 통해 유도된 수 있습니다. DTH 반응은 예를 들어 ovalbumin, 투베르쿨린,​​ 파상풍 toxoid, 또​​는 열쇠 림펫 hemocyanin (KLH)에 대한 다양한 항원을 유도하실 수 있습니다.

여기 루이스 쥐에서 활약 DTH 반응을 유도하는 방법을 보여줍니다. 우리가 먼저 프로 인드의 도움이되는을 완료에 KLH,이자 우리의 항원의 물 - 인 - 오일 에멀젼을 준비하고 쥐에 subcutaneously이 유제를 주입합니다. 이것은 KLH로 이동 메모리 T 세포를 개발하는 면역 체계를 주요 것입니다. 세븐 일 후 우리는 반대편에, 한쪽과 ovalbumin,없는 항원과 KLH와 함께 뒷면에 intradermally 쥐에 도전합니다. 염증 반응이 16~72시간 나중에 볼 수 있으며 빨간색과 부풀어 지역은 DTH 심각의 표시로 측정됩니다.

Protocol

1. 유제의 준비

1. ovalbumin는 파상풍 toxoid, 수용액의 열쇠 림펫 hemocyanin ....)은 프로 인드의 도움이되는를 완료하는 데 추가 : 유제는 항원의 1:1 혼합물 (DTH는 다양한 항원을 유도 할 수있다. 그것은 도움이되는가 아닌 다른 방법으로 라운드에 항원을 추가하는 것이 매우 중요합니다!
   
   
2. 결정과 유제를 주입하면 폐기물이 많이있다, 그래서 항상 당신이 필요로했던 것보다 1.5 또는 2 회 이상 준비합니다.
   
   
3. 2 MG / ML 솔루션을 준비하는 호수에서 항원을 디졸브. 당신이 집계를 풀어 싶지 않아으로 필터링하지 않음!
   
   
4. 고속에서 관과 소용돌이에 프로 인드의 도움이되는 H37Ra (Difco, 카탈로그 # 231131)을 넣어 완성. vortexing 동안 드롭하여 항원 드롭을 추가합니다. 5 분 더 항원의 모든 추가, 소용돌이. 혼합물은 흰색으로 바뀝니다해야합니다.
   
   
5. 유리 주사기에 감광 유제를 넣고 (피셔 카탈로그 # 14-825 - 17L) 18G 다리를 사용하여 다른 유리 주사기에 연결합니다. 그것이 (5-10 분) 하드된다 때까지 다른 주사기에서 유제를 보내드립니다. 이 5 ML 주사기를 사용하는 것이 좋습니다. 유제 5 개 이상 ML이 필요한 경우 5 ML 주사기 여러 세트를 사용합니다.
   
   
6. 유제는 3 주 동안 4 ° C에서 주사기에 저장할 수 있습니다.

2. 쥐를 예방 접종

1. 몇 분 동안 주사기에 감광 유제를 혼용하여 주사에 사용되는 주사기로 전송할 수 있습니다. 23G 바늘과 Luer - 록 팁 3 ML의 주사기를 사용하여 꼬리의 기지에서 1-2 사이트에 subcutaneously 200 ML을 주사.

3. 뒤에 항원과 도전

1. 이레 예방 접종 후, 쥐의 백업 2 장소를 면도하고 다른 장소에서 한 자리하고 생리 (또는없는 항원)에 1 MG / ML 항원 솔루션의 intradermally 20 ML을 주입. 당신이 염증 반응을 강화 집계를 느슨한 수 있으므로, 항원 솔루션을 필터링하지 마십시오.
   
   
2. 쥐나는 움직임을 피하기 위해 anesthesized해야합니다. intradermally 27G ½ 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 솔루션을 주사. 주사 바늘 사이를 변경합니다.
   
   참고 : 도전 대신 더 정확한 측정을 위해 다시의 귀를 날개로 이루어 질 수 있습니다. 에서 동영상을 참조 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. DTH 측정

1. 주사 사이트는 빨개과 염증의 신호로 붓기 시작합니다. 통치자 또는 더 나은 아직, 캘리퍼스를 사용하여 염증이 지역의 직경을 측정합니다. 최대 붓기 24 72 시간 사이에 발생한다.

Discussion

DTH 반응보다 정확한 측정을 위해 우리는 귀의 날개에있는 항원과 쥐 도전하는 것이 좋습니다. 반응은 다음 관련 항원 - 도전 귀가하거나, 생리 혼자 또는없는 항원과 도전 귀 사이에 붓기 귀에 차이로 측정할 수 있습니다. 귀에에 도전 데모는 1로 표시됩니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.