Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos

Summary

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7 efetuador linfócitos T de memória. Aqui demonstramos como induzir DTH ativa em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Abstract

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, por exemplo ovalbumina, tuberculina, toxóide tetânico, ou limpet keyhole hemocianina (KLH).

Aqui demonstramos como para induzir uma reação ativa DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro preparar uma emulsão de água em óleo de KLH, nosso antígeno de interesse, em completa adjuvante de Freund e injetar este emulsão por via subcutânea a ratos. Isso vai preparar o sistema imunológico para desenvolver células de memória T direcionado para KLH. Sete dias mais tarde, vai desafiar os ratos por via intradérmica na parte traseira com KLH de um lado e com ovalbumina, um antígeno irrelevante, do outro lado. A reação inflamatória será visível 16-72 horas mais tarde, a área vermelha e inchada será medida como uma indicação da gravidade da DTH.

Protocol

1. Preparação da emulsão

1. A emulsão é uma mistura 1:1 do antígeno (DTH pode ser induzida a vários antígenos: ovalbumina, toxóide tetânico, limpet keyhole hemocianina ....) em solução aquosa adicionado ao adjuvante completo de Freund. É muito importante adicionar o antígeno ao adjuvante e não o contrário!
   
   
2. Há uma grande quantidade de resíduos ao fazer e injetando uma emulsão, por isso sempre preparar 1,5 ou 2 vezes mais do que o que você precisa.
   
   
3. Dissolver antígeno em solução salina para preparar uma solução de 2 mg / ml. Não filtro, que você não quer perder os agregados!
   
   
4. Coloque completa adjuvante de Freund H37Ra (Difco, catalogo 231.131) em um tubo de vórtice e em alta velocidade. Adicionar a gota a gota, enquanto o antígeno vórtex. Quando todos o antígeno é adicionada vórtice, por mais 5 minutos. A mistura deve ficar branco.
   
   
5. Coloque a emulsão em uma seringa de vidro e vinculá-lo a outra seringa de vidro usando uma ponte de 18G (Fisher catálogo # 14-825-17L). Enviar a emulsão de uma seringa para o outro até que se torne rígido (5-10 min). É melhor usar duas seringas 5 ml. Se mais de 5 ml de emulsão são necessários, use vários conjuntos de 5 ml seringas.
   
   
6. A emulsão pode ser armazenada nas seringas a 4 ° C por 3 semanas.

2. Imunização dos ratos

1. Misture a emulsão nas seringas por alguns minutos e transfira para a seringa utilizada para a injeção. Injetar 200 ml por via subcutânea em 1-2 locais na base da cauda usando agulhas 23G e uma ponta Luer-Lok seringa de 3 ml.

3. Desafio com o antígeno na parte de trás

1. Sete dias após a imunização, a barba duas manchas nas costas dos ratos e injetar por via intradérmica de 20 ml de uma solução de antígeno 1 mg / ml em um ponto e salina (ou antígeno irrelevante) no outro ponto. Não filtrar a solução de antígeno, como você pode perder agregados que aumentam a reação inflamatória.
   
   
2. Os ratos devem ser anestesiado para evitar movimentos. Injectar a solução por via intradérmica, utilizando 27G ½ agulhas e seringas de 1 ml. Mudança de agulhas entre as injecções.
   
   Nota: o desafio pode ser feito no pavilhão das orelhas, em vez de as costas para as medições mais precisas. Veja vídeo em http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Medição de DTH

1. O local da injecção irão começar a transformar vermelhas e inchaço como um sinal de inflamação. Medir o diâmetro da área inflamada usando uma régua ou, melhor ainda, um paquímetro. O inchaço máxima deve ocorrer entre 24 e 72 horas.

Discussion

Para uma medição mais precisa da reação DTH recomendamos desafiando os ratos com o antígeno no pavilhão da orelha. A reação pode ser medido como uma diferença no ouvido inchaço entre o ouvido antígeno desafiou relevantes eo ouvido desafiados com solução salina, sozinho ou com o antígeno irrelevante. Uma demonstração do desafio no ouvido é mostrado na 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.