Induktion och övervakningen av en aktiv Fördröjda överkänslighetsreaktioner (DTH) hos råttor

Summary

Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor lymfocyter minne T. Här visar vi hur du framkalla aktiv DTH i Lewis råttor och övervaka det inflammatoriska svaret.

Abstract

Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor lymfocyter minne T som infiltrerar injektionsstället av ett antigen mot vilket immunförsvaret har primade. Den inflammatoriska reaktionen kännetecknas av rodnad och svullnad på platsen antigena utmaning. Det är en praktisk modell för att bestämma in vivo-effekten av immunosuppressiva medel. Kutan DTH kan induceras antingen genom adoptiv transfer av antigen-specifika T-lymfocyter eller genom aktiv immunisering med ett antigen, och efterföljande intradermalt utmaning med det antigen att framkalla den inflammatoriska reaktionen i ett visst hudområde. DTH svar kan förmås att olika antigener, t.ex. äggalbumin, tuberkulin, stelkramp, eller nyckelhål ostronpest hemocyanin (KLH).

Här kan vi visa hur man framkalla en aktiv DTH reaktion i Lewis råttor. Vi kommer först fram en vatten-i-olja emulsion av KLH, vår antigen av intresse, i fullständig Freunds adjuvans och injicera denna emulsion subkutant till råttor. Detta kommer att prime immunförsvaret att utveckla celler minne T riktad till KLH. Sju dagar senare kommer vi att utmana råttor intradermalt på baksidan med KLH på ena sidan och med äggalbumin, en irrelevant antigen, på andra sidan. Den inflammatoriska reaktionen kommer att vara synlig 16-72 timmar senare och de röda och svullna området kommer att mätas som en indikation på DTH svårighetsgrad.

Protocol

1. Beredning av emulsion

1. Emulsionen är en 1:1 blandning av antigen (DTH kan förmås att olika antigener: äggalbumin, tillade stelkramp, nyckelhålet ostronpest hemocyanin ....) i vattenlösning för att slutföra Freunds adjuvans. Det är mycket viktigt att lägga antigen i adjuvant och inte tvärtom!
   
   
2. Det finns en hel del avfall när de gör och injicera en emulsion, så alltid förbereda 1,5 eller 2 gånger mer än vad du behöver.
   
   
3. Lös antigen i saltlösning för att förbereda en 2 mg / ml. Inte filtret, eftersom du inte vill förlora aggregaten!
   
   
4. Sätt komplett Freunds adjuvans H37Ra (Difco, katalog # 231.131) i ett rör och vortexa med hög hastighet. Lägg till antigen droppvis medan vortexa. När alla antigenet läggs virvel i 5 minuter. Blandningen ska bli vit.
   
   
5. Sätt emulsionen i ett glas spruta och länka den till en annan glasspruta med en 18G bro (Fisher katalog # 14-825-17L). Skicka emulsionen från spruta till den andra tills det blir svårt (5-10 min). Det är bäst att använda två 5 ml sprutor. Om mer än 5 ml emulsion krävs, använda flera uppsättningar av 5 ml sprutor.
   
   
6. Emulsionen kan förvaras i sprutorna vid 4 ° C i 3 veckor.

2. Immunisering av råttorna

1. Blanda emulsionen i sprutor under några minuter och transfer till sprutan som används för injektionen. Injicera 200 ml subkutant i 1-2 platser vid basen av svansen med hjälp av 23G nålar och ett Luer-Lok Tips 3 ml spruta.

3. Utmana med antigen i ryggen

1. Sju dagar efter vaccination, raka 2 fläckar på ryggen på råttor och injicera intradermalt 20 ml av en 1 mg / ml antigen lösning i en plats och koksaltlösning (eller irrelevanta antigen) i den andra platsen. Filtrera inte antigenet lösning, eftersom du kan förlora aggregat som förstärker den inflammatoriska reaktionen.
   
   
2. Råttorna ska anesthesized att undvika rörelser. Injicera lösningen intradermalt med hjälp av 27G ½ nålar och sprutor 1 ml. Byt nålar mellan injektionerna.
   
   Obs: utmaningen kan göras i ytterörat på öronen istället för tillbaka för mer exakta mätningar. Se video med http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Mätning av DTH

1. Injektionsstället börjar bli röda och svullnad som ett tecken på inflammation. Mät diametern på det inflammerade området med hjälp av en linjal eller ännu bättre, en tjocklek. Den maximala svullnaden skulle uppstå mellan 24 och 72 timmar.

Discussion

För en mer exakt mätning av DTH-reaktionen rekommenderar vi utmanar råttorna med antigenet i ytterörat av örat. Reaktionen kan då mätas som en skillnad i örat svullnad mellan de berörda antigen-utmanade örat och örat utmanas med antingen koksaltlösning ensam eller med irrelevanta antigen. En demonstration av utmaningen i örat visas i 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.