Induzione e Monitoraggio di Active ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in ratti

Summary

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici. Qui mostriamo come per indurre DTH attivo nei ratti Lewis e monitorare la risposta infiammatoria.

Abstract

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici che si infiltrano nel sito di iniezione di un antigene contro il quale il sistema immunitario è stato innescato. La reazione infiammatoria è caratterizzata da arrossamento e gonfiore nel sito di uno stimolo antigenico. Si tratta di un modello pratico per determinare l'efficacia in vivo di immunosoppressori. DTH cutanea può essere indotta in seguito a trasferimenti adottivo di antigene-specifica dei linfociti T o per l'immunizzazione attiva con un antigene, e la successiva sfida intradermica con l'antigene per indurre la reazione infiammatoria della pelle in una zona determinata. Risposte DTH può essere indotto a vari antigeni, per esempio ovalbumina, tubercolina, tossoide tetanico, o buco della serratura patelle hemocyanin (KLH).

Qui mostriamo come per indurre una reazione attiva DTH nei ratti Lewis. Per prima cosa preparare un acqua in emulsione di olio KLH, antigene di nostro interesse, in adiuvante completo di Freund e questa emulsione iniettare per via sottocutanea nei ratti. Questo sarà il primo sistema immunitario di sviluppare cellule T di memoria diretta a KLH. Sette giorni dopo ci sarà una sfida per i ratti intradermica sul retro con KLH da un lato e con ovalbumina, un antigene irrilevante, sul lato opposto. La reazione infiammatoria sarà visibile 16-72 ore più tardi e la zona rossa e gonfia sarà misurata come indice di gravità DTH.

Protocol

1. Preparazione della emulsione

1. L'emulsione è una miscela 1:1 di antigene (DTH può essere indotto a vari antigeni: ovoalbumina, tossoide tetanico, buco della serratura patelle hemocyanin ....) in soluzione acquosa aggiunto per completare adiuvante di Freund. E 'molto importante aggiungere l'antigene per l'adiuvante e non viceversa!
   
   
2. Ci sono un sacco di rifiuti al momento e iniettando una emulsione, in modo sempre preparare 1,5 o 2 volte più di quello che vi serve.
   
   
3. Sciogliere l'antigene in soluzione fisiologica per preparare un 2 mg / ml soluzione. Non filtrare, come non si vuole perdere la aggregati!
   
   
4. Mettete adiuvante completo di Freund H37Ra (Difco, catalogo # 231131) in una provetta e miscelare ad alta velocità. Aggiungere la goccia a goccia, mentre l'antigene vortex. Quando tutti l'antigene è aggiunto, vortex per 5 minuti. La miscela dovrebbe diventare bianco.
   
   
5. Mettere l'emulsione in una siringa di vetro e collegarlo ad un altro siringa in vetro con un ponte 18G (catalogo Fisher # 14-825-17L). Invia l'emulsione da una siringa all'altra fino a quando diventa difficile (5-10 minuti). E 'meglio utilizzare due siringhe da 5 ml. Se più di 5 ml di emulsione sono necessari, usano vari gruppi di 5 siringhe ml.
   
   
6. L'emulsione può essere memorizzato in siringhe a 4 ° C per 3 settimane.

2. Immunizzazione dei topi

1. Mescolare l'emulsione nelle siringhe per qualche minuto e il trasferimento alla siringa usata per l'iniezione. Iniettare 200 ml per via sottocutanea in 1-2 siti alla base della coda con aghi 23G e una Luer-Lok tip siringa da 3 ml.

3. Sfida con l'antigene nella parte posteriore

1. Sette giorni dopo l'immunizzazione, barba 2 spot sul dorso dei topi e intradermica iniettare 20 ml di una mg / ml soluzione 1 antigene in un punto e soluzione salina (o antigene irrilevante) nel punto altri. Non filtrare la soluzione antigene, come si può perdere aggregati che aumentare la reazione infiammatoria.
   
   
2. I ratti devono essere anesthesized per evitare movimenti. Iniettare la soluzione intradermica con 27G ½ aghi e siringhe da 1 ml. Cambia aghi tra le iniezioni.
   
   Nota: la sfida può essere fatto nel padiglione delle orecchie al posto della schiena per misure più precise. Guarda il video a http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Misura della DTH

1. Il sito di iniezione inizierà a girare rosso e gonfiore in segno di infiammazione. Misurare il diametro della zona infiammata con un righello o, meglio ancora, una pinza. Il gonfiore massimo dovrebbe avvenire tra il 24 e 72 ore.

Discussion

Per una misurazione più precisa della reazione DTH si consiglia sfida i topi con l'antigene nel padiglione dell'orecchio. La reazione può essere misurata come differenza all'orecchio gonfiore tra le pertinenti antigene-sfidato l'orecchio e l'orecchio sfidato sia con soluzione salina da solo o con l'antigene irrilevante. Una dimostrazione della sfida a livello dell'orecchio mostrato in 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.