पुनः संयोजक रेट्रोवायरल बी कोशिकाओं का उत्पादन और संक्रमण

Summary

और एक में एक जीन की संरचना और समारोह विश्लेषण के एक कुशल प्रणाली

Protocol

1. प्लीहा - संबंधी बी लिम्फोसाइट अलगाव और उत्तेजना

1. उम्र के 2-3 महीने के बीच ^से 12 सहायता - चूहों की कमी spleens हार्वेस्ट . तिल्ली के अलगाव बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है और अंगों को अस्थायी रूप से ठंड फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा जिसमें 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में रखा जाता है है.
2. तिल्ली तो एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के लिए स्थानांतरित कर रहा है और पीबीएस के 5 एमएल 2.5% FBS के साथ पूरक में homogenized है. एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब homogenate स्थानांतरण.
3. 1000rpm पर 10 मिनट के लिए 4 में homogenized प्लीहा - संबंधी ऊतक नमूना अपकेंद्रित्र ° सी गोली कोशिकाओं के लिए.
4. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला छानना. 10 एमएल लाल रक्त कोशिका में सेल गोली (आरबीसी) 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर lysis बफर Resuspend लाल रक्त कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचने के लिए.
5. 10 मिनट और छानना सतह पर तैरनेवाला के लिए 1000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र और 10 एमएल पीबीएस 2.5% FBS युक्त कोशिकाओं resuspend.
6. 100 μL विभाज्य निकालें और एक 1:1000 कमजोर पड़ने का उपयोग एक मानक trypan नीला का उपयोग करने के लिए किसी भी मृत कोशिकाओं को बाहर hemacytometer में कोशिकाओं की गिनती. लगभग 20-30 मिलियन कोशिकाओं तिल्ली प्रति प्राप्त किया जा सकता है.
7. 1000rpm पर नमूना 10 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र छानना.
8. 0.5% BSA / पीबीएस 90 μL प्रति 10 ⁷ कोशिकाओं के एक एकाग्रता में युक्त 2mm EDTA में गोली Resuspend.
9. कोशिकाओं को विरोधी CD43 एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के लिए विशेष रूप से गैर - बी कोशिकाओं बाँध जोड़ें. 90 μL प्रति 10 μL मोती (10 ⁷ कोशिकाओं) का उपयोग करें. अच्छी तरह मिक्स और 4 में सेते ° C 20 मिनट के लिए.
10. एक बार कोशिकाओं लेबल किया गया है, FBS / पीबीएस ट्यूब के शीर्ष करने के लिए 2.5% जोड़ने द्वारा उन्हें धो लो. 10 मिनट के लिए 1000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र.
11. सतह पर तैरनेवाला छानना. मिलीलीटर प्रति 10x10 ⁷ कोशिकाओं के एक एकाग्रता में 0.1% / BSA पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend.
12. एक चुंबकीय विभाजक पर एक चुंबकीय छँटाई स्तंभ माउंट. स्थिति स्तंभ के नीचे सीधे एक चोटीदार ट्यूब के लिए प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा और 3ml 0.5% के साथ / BSA पीबीएस प्रधानमंत्री और धोने के लिए स्तंभ लोड.
13. एक बार धोने तरल पदार्थ के माध्यम से बह गया है, एक नया संग्रह ट्यूब के साथ की जगह. यदि नमूना कम से कम 1 एमएल है, एमएल 1 0.5% BSA / / पीबीएस EDTA के साथ नमूना मात्रा और समायोजित स्तंभ में नमूना लोड. केवल 1 स्तंभ प्रति कोशिकाओं की एमएल अधिकतम लोड और यदि आवश्यक एकाधिक स्तंभों का उपयोग.
14. कोशिकाओं को निष्क्रिय कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए और स्तंभ के तहत शंक्वाकार ट्यूब में अनबाउंड कोशिकाओं को इकट्ठा करने की अनुमति दें. 3 एमएल 0.5% / BSA पीबीएस जबकि के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा जारी के साथ स्तंभ 4 बार धोएं.
15. सभी में जो प्रवाह के माध्यम से CD43 नकारात्मक आराम बी कोशिकाओं समृद्ध हो जाएगा ले लीजिए. स्तंभ त्यागें. प्रवाह के माध्यम से 10 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
16. सतह पर तैरनेवाला नाली और 10 एमएल माध्यम (15% FCS / + glutamine, पेन / Strep, गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 50 सुक्ष्ममापी Β-ME) जोड़ने
17. 10 मिलीलीटर प्रति ⁶ कोशिकाओं और कोशिकाओं और संस्कृति की गणना .
18. आदेश में बी सेल के विकास और प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए, पुनः संयोजक आईएल-4 और विरोधी CD40 एंटीबॉडी जैसे कि अंतिम सांद्रता 20 μg / एमएल और 1 / μg एमएल के साथ मध्यम पूरक, क्रमशः, और एक संस्कृति फ्लास्क कोशिकाओं हस्तांतरण.
19. कोशिकाओं रातोंरात संस्कृति. कोशिकाओं की गणना और ⁶ प्रति 10 मिलीलीटर कोशिकाओं को पतला, उचित रूप में आईएल -4 और CD40 जोड़ने.
20. वायरल संक्रमण से पहले 72 घंटे के लिए संस्कृति की कोशिकाओं.

2. निर्माता कक्ष के अभिकर्मक

अभिकर्मक के लिए स्थापित प्रोटोकॉल या तो cationic लिपिड या कैल्शियम फॉस्फेट का उपयोग कर का उपयोग करें. डीएनए का निर्माण प्रति transfect 10cm ³ थाली, प्लेट प्रति 100 μg प्लास्मिड डीएनए का उपयोग कर. हम नियमित रूप से कैल्शियम फॉस्फेट ^{अभिकर्मक विधि 13,} 14 का उपयोग करें और उच्च वायरल टिटर नोट जब क्लोरोक्वीन के साथ पूरक.

1. 60% -70% मिला हुआ फीनिक्स कोशिकाओं का उपयोग के रूप में उत्पादक कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट हो. इस संगम कोशिका गिनती में 10 सेमी प्लेट प्रति 5 मिलियन कोशिकाओं होना चाहिए.
2. एक अभिकर्मक के लिए पहले घंटे, फीनिक्स सेल के विकास के लिए नए सिरे से पूरा मीडिया के साथ मीडिया की जगह.
3. एक बाँझ eppendorpf ट्यूब में, पैकेजिंग निर्माण डीएनए, 0.5m CaCl ₂ के 250 μL के 100 μg गठबंधन, और 500 μL बाँझ पानी के साथ अंतिम मात्रा को समायोजित
4. 1 एमएल विंदुक का प्रयोग, सख्ती 500 μL 2X HNP के साथ एक 15ml polypropylene ट्यूब में इस समाधान का मिश्रण
5. इस मिश्रण कमरे के तापमान पर 8-10 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति दें. इस समय के दौरान एक वेग फार्म का होगा.
6. कोशिकाओं को ड्रॉप - बुद्धिमान जबकि मध्यम घूमता करने के लिए समान रूप से पूरे मिश्रण वितरित अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें.
7. 37 में कोशिकाओं सेते ° C 12 घंटे के लिए.
8. 12 के बाद अभिकर्मक घंटे 8ml पूरा बी सेल मध्यम विकास के साथ मध्यम जगह और 37 ° सी इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटने.

3. प्रेरित प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं के संक्रमण

1. फीनिक्स के बाद transfe 48hr कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला निकालेंction और सतह पर तैरनेवाला एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए किसी भी सेल मलबे को हटाने.
2. वायरस के 3 एमएल मिक्स पूर्व सक्रिय बी कोशिकाओं (के रूप में चरण 1 में) 3 एमएल के साथ सतह पर तैरनेवाला युक्त. आदेश में वायरल सोखना कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए, एमएल प्रति 16 μg के अंतिम एकाग्रता में polybrene जोड़ें.
3. 2500 rpm पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं में 90 मिनट के लिए 30 संक्रमित डिग्री सेल्सियस
4. तुरंत बाद स्पिन, 37 पर आगे 48-72 बजे के लिए सेते ° सी सेल के विकास और प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए.

4. प्रवाह cytometry विश्लेषण

1. एक प्रवाह cytometer का प्रयोग, B220 और सतह IgG1 की सतह अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण. कोशिकाओं की सतह पर IgG1 की उपस्थिति का संकेत है कि वर्ग स्विच पुनर्संयोजन सहायता जीन की रेट्रोवायरल complementation के माध्यम से सफल बचाव का एक परिणाम के के रूप में हुई है.

5. प्रतिनिधि परिणाम

हम सफलतापूर्वक प्रोटीन कारक सक्रियकरण सहायता की कमी (सहायता / -) से प्रेरित Cytidine deaminase (सहायता) की कमी बचाया है रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग बी लिम्फोसाइटों. संक्षेप में, हम पुनः संयोजक ^15-18 PMX-नौकरानी - GFP के साथ फीनिक्स कोशिकाओं transfecting द्वारा माउस (नौकरानी) सहायता प्रोटीन व्यक्त रेट्रोवायरस उत्पन्न . पूर्व vivo वर्ग स्विच (सीएसआर) पुनर्संयोजन उत्तेजना शर्तों ¹⁹ में सहायता की कमी चूहों से प्राप्त सहायता की कमी बी कोशिकाओं में काटा वायरस संक्रमित थे. संक्रमित बी कोशिकाओं तो संस्कृति में 72hrs प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग करने के बाद सीएसआर के लिए IgG1 विश्लेषण थे. चित्रा 2 सहायता लेकिन खाली नहीं का निर्माण के साथ बी कोशिकाओं की सतह पर IgG1 का पता लगाने से पता चलता है, यह दर्शाता है कि सीएसआर सहायता अभिव्यक्ति बचाव का एक परिणाम के रूप में हुई है.

चित्रा 1: उत्पादक कोशिकाओं के भीतर रेट्रोवायरल पैकेजिंग की योजना: ब्याज की जीन, Ψ द्वारा प्रतिनिधित्व किया है, PMX-IRES GFP में subcloned किया गया था, के रूप में ^पहले 15 में वर्णित है. प्लाज्मिड एक ecotropic वायरल पैकेजिंग सेल ढकोसला नीति और लिफाफा प्रोटीन (फीनिक्स, Orbigen) उत्पादन, कैल्शियम फॉस्फेट विधि ^{13, 14} का उपयोग करने में सक्षम लाइन में ट्रांसफ़ेक्ट था . चालीस - आठ घंटे के अभिकर्मक के बाद, सतह पर तैरनेवाला युक्त वायरल कणों संक्रमण के लिए लक्ष्य प्राथमिक बी चूहों से प्राप्त कोशिकाओं में काटा गया था.

चित्रा 2: सहायता की कमी बी कोशिकाओं, विरोधी CD40 के साथ उत्तेजित और आईएल-4 PMX नौकरानी - GFP या GFP अकेले व्यक्त retrovirus युक्त retrovirus से संक्रमित थे . IgG1 के लिए सीएसआर के स्तर FACS विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था.

Discussion

प्लीहा - संबंधी बी कोशिकाओं के रेट्रोवायरल पारगमन के रूप में यहाँ वर्णित है और चित्रा 1 के रूप में चित्रित एक आनुवंशिक दृष्टिकोण है कि बी लिम्फोसाइटों के अध्ययन में उपयोगी है क्योंकि lymphopoesis में विकास की घटनाओं की कई transcriptional विनियमन ^{1, 2} द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. बी सेल परिपक्वता, CD40L के माध्यम से ट्रिगर के बाद के चरणों में बी सेल के विकास का प्रेरण, कोशिका चक्र में प्रवेश, और प्रसार ^{11, 20} के लिए आवश्यक है . चित्रा 2 में दिखाया गया है, बी कोशिकाओं विरोधी CD40 और IL4 के साथ इन विट्रो में प्रेरित किया जा सकता है प्रसार के इस फट से गुजरना, और रेट्रोवायरल वैक्टर एक्सप्रेस प्रोटीन है कि बी सेल के विकास के इन चरणों के दौरान कार्य कर सकते हैं के लिए उपयोगी उपकरण हैं. उदाहरण में छवि में दिखाया गया. 2, हम प्रदर्शन की कमी बी कोशिकाओं है कि सीएसआर (यहाँ IgG1 के लिए) से गुजरना करने में असमर्थ हैं कि सहायता retrovirally माउस सहायता जीन शुरू करने से इस समारोह के लिए बचाया जा सकता है. यह दृष्टिकोण हमें GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए ट्रैक करने के लिए (चित्रा 1 देखें) (IgG1 + + GFP) कि सीएसआर आया है की अनुमति देता है.

कि यह प्लीहा - संबंधी कटाई के बाद कम से कम एक सप्ताह में पूरा किया जा सकता है समय के लिए निवेश एक ट्रांसजेनिक माउस बनाने के लिए विरोध के रूप में माउस मॉडलिंग से अधिक यह विधि फायदेमंद है. विश्लेषण के प्रकार अन्वेषक अनुप्रयोगों के अनुरूप किया जा सकता है, यहाँ हम चित्रा 2 के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा वर्ग स्विच पुनर्संयोजन के विश्लेषण प्रस्तुत किया है . इसके अलावा, इस पद्धति retrovirally - transduced ^{15 कोशिकाओं, 21} से प्रोटीन निष्कर्षण निम्नलिखित जैव रासायनिक दृष्टिकोण की एक सीमा के लिए उपयुक्त है .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FCS	Atlanta Biologicals	S11550
RPMI	Invitrogen	22400
PBS	Invitrogen	20012
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
CD43 beads	Miltenyi Biotec
B Cell Complete Media	Various	Various Components	RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol
IL-4
Anti-CD40	BD Biosciences	553787
polybrene	Sigma-Aldrich	107689
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628	Used at 100mM
Ph–nix Eco cells (Murine)	Orbigen	RVC-10002
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220)	eBioscience	15-0452-81
PE-α-mouse-IgG1	BD Biosciences	A85-1