Summary
Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in un
Abstract
L'espressione transgenica di geni nelle cellule eucariotiche è un potente approccio inverso genetica in cui è espresso un gene di interesse sotto il controllo di un sistema di espressione eterologo per facilitare l'analisi del fenotipo risultante. Questo approccio può essere utilizzato per esprimere un gene che non si trova normalmente nell'organismo, per esprimere una forma mutante di un prodotto del gene, oppure a un eccesso di esprimere un dominante negativo forma del prodotto genico. E 'particolarmente utile nello studio del sistema ematopoietiche, dove regolazione trascrizionale è un meccanismo di controllo importante nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule B 1, recensione in 2-4.
Genetica del topo è un potente strumento per lo studio dei geni e delle patologie umane. Un'analisi comparativa del mouse e genoma umano rivela conservazione delle synteny in oltre il 90% del genoma 5. Inoltre, gran parte della tecnologia utilizzata in modelli murini è applicabile allo studio dei geni umani, per esempio, le interruzioni dei geni e la sostituzione allelica 6 . Tuttavia, la creazione di un topo transgenico richiede una grande quantità di risorse sia di natura tecnica e finanziaria. Diversi progetti hanno cominciato a compilare le librerie di ceppi di topi knock out (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagenesi indotta da ceppi (RIKEN), che richiedono grandi sforzi e la collaborazione 7. Pertanto, è auspicabile primo studio il fenotipo di un gene desiderato in un modello di coltura cellulare di cellule primarie prima di passare a un modello murino.
DNA retrovirale integra nel DNA ospite, preferibilmente all'interno o in prossimità di unità di trascrizione o isole CpG, con conseguente stabile e ereditabile espressione del gene di interesse confezionato evitando silenziamento trascrizionale 8 9. I geni sono poi trascritti sotto il controllo di un promotore retrovirali ad alta efficienza, con una conseguente alta efficienza di trascrizione e produzione di proteine. Pertanto, l'espressione retrovirali possono essere utilizzati con le cellule di difficile trasfezione, a condizione che le cellule sono in uno stato attivo durante la mitosi. Perché i geni strutturali del virus sono contenuti all'interno della linea cellulare di packaging, i vettori di espressione utilizzata per clonare il gene di interesse non contengono geni strutturali del virus, che sia elimina la possibilità di revertanti virale e aumenta la sicurezza di lavorare con surnatanti virale come non virioni infettivi vengono prodotti 10.
Qui vi presentiamo un protocollo per la produzione ricombinante retrovirali e successiva infezione delle cellule B della milza. Dopo l'isolamento, le cellule coltivate splenica sono stimolati con Th linfochine derivati e anti-CD40, che induce una raffica di proliferazione e differenziazione delle cellule B 11. Questo protocollo è l'ideale per lo studio di eventi che si verificano in ritardo nello sviluppo delle cellule B e la differenziazione, le cellule B sono isolate dalla milza seguenti iniziale eventi ematopoietiche, ma prima di stimolazione antigenica per indurre la differenziazione plasmocitaria.
Protocol
1. Splenica B-linfociti isolamento e stimolazione
- Raccolta della milza di topi con deficit AID 12 tra 2-3 mesi di età. L'isolamento della milza viene eseguita in condizioni sterili e gli organi sono temporaneamente conservati in soluzione fisiologica fredda tampone fosfato (PBS) contenente 15% siero fetale bovino (FBS).
- La milza è poi trasferito in una cappa sterile colture di tessuti e omogeneizzato in 5 ml di PBS integrata con il 2,5% FBS. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 ml falco.
- Centrifugare il campione omogeneizzato di tessuto splenico a 1000rpm per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule.
- Decantare il surnatante dopo centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di globuli rossi (RBC) tampone di lisi a temperatura ambiente per 7 minuti per evitare la contaminazione da parte dei globuli rossi.
- Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti e decantare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente 2,5% FBS.
- Rimuovere 100 microlitri aliquota e contare le cellule a una diluizione 1:1000 utilizzando un emocitometro standard utilizzando trypan blu per escludere qualsiasi cellule morte. Circa 20-30 milioni di cellule possono essere ottenuti per milza.
- Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti e decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 0,5% BSA / PBS contenente 2mM EDTA a una concentrazione di 10 7 cellule per 90 microlitri.
- Aggiungi anticorpi anti-CD43 sfere magnetiche rivestito le cellule di legare specificamente cellule non-B. Usa 10 perle microlitri per 90 microlitri (10 7 cellule). Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 20 minuti.
- Una volta che le cellule sono stati etichettati, lavarli con l'aggiunta di 2,5% FBS / PBS alla parte superiore del tubo. Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti.
- Decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS a una concentrazione di 10x10 7 celle per ml.
- Montare una colonna magnetica ordinamento su un separatore magnetico. Posizionare un tubo conico direttamente sotto la colonna di raccogliere il flusso-through e caricare la colonna con 3 ml 0,5% BSA / PBS al primo e lavare.
- Una volta che il liquido di lavaggio ha scorreva, sostituirlo con un tubo di nuova collezione. Se il campione è inferiore a 1 ml, regolare il volume campione ad 1 ml con 0,5% BSA / PBS / EDTA e caricare il campione nella colonna. Caricare solo un massimo di 1 ml di cellule per colonna e utilizzare più colonne, se necessario.
- Permettono alle cellule di flusso passivamente attraverso la colonna e raccogliere le cellule non legato nel tubo conico sotto la colonna. Lavare la colonna 4 volte con 3 ml 0,5% BSA / PBS, pur continuando a raccogliere le flow-through.
- Raccogliere tutte le flow-through, in cui le cellule CD43 negative B riposo sarà arricchita. Eliminare la colonna. Centrifuga flow-through a 1000 rpm per 10 minuti.
- Scolate il surnatante e aggiungere 10 ml di mezzo (15% FCS / + glutammina, Pen / Strep, aminoacidi non essenziali, 50 mM Β-ME)
- Contare le celle e la cultura a 10 6 cellule per ml.
- Al fine di stimolare la crescita e la proliferazione delle cellule B, integrare il supporto con anticorpo IL-4 e anti-CD40 in modo tale che le concentrazioni finali sono 20 mg / ml e 1 mg / ml, rispettivamente, e trasferire le cellule in un pallone cultura.
- Coltura delle cellule durante la notte. Contare le celle e diluire a 10 6 cellule per ml, l'aggiunta di IL-4 e CD40 a seconda dei casi.
- Celle di coltura per 72 ore prima dell'infezione virale.
2. Trasfezione delle cellule Produttore
Utilizzano i protocolli stabiliti per la trasfezione utilizzando lipidi cationici o fosfato di calcio. Trasfezione 10 centimetri 3 Piastra per costruire il DNA, utilizzando 100 mg di DNA plasmidico per piastra. Noi abitualmente uso di fosfato di calcio metodo di trasfezione 13, 14 e nota alto titolo virale quando è integrato con la clorochina.
- Usa il 60% -70% delle cellule confluenti Phoenix come cellule produttore per essere transfettate. A questo conta delle cellule confluenza dovrebbe essere di 5 milioni di cellule per 10 piastra cm.
- Un'ora prima della transfezione, sostituire il supporto con freschi multimediale completa per la crescita cellulare Phoenix.
- In una provetta sterile eppendorpf, unire 100 mg di imballaggio costruire DNA, 250 ml di 0,5 M CaCl 2, e regolare il volume finale a 500 microlitri di acqua sterile
- Usando una pipetta da 1 ml, mescolare vigorosamente questa soluzione con 500 microlitri HNP 2X in un tubo di polipropilene 15 ml
- Lasciare il composto a riposare a temperatura ambiente per 8-10 minuti. Durante questo periodo si forma un precipitato.
- Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia per le cellule, mentre vorticose del mezzo per distribuire uniformemente il composto in tutto.
- Incubare le cellule a 37 ° C per 12 ore.
- 12 ore dopo la trasfezione, sostituire il supporto con 8ml completo mezzo di crescita delle cellule B e le cellule ritorno ai 37 ° C incubatore.
3. L'infezione di cellule stimolate B splenica
- Rimuovere il surnatante dalle cellule Phoenix 48 ore post-transfection e passare il sovranatante attraverso un filtro 0,2 micron per rimuovere i detriti.
- Mescolare 3 mL di virus contenenti surnatante con 3 ml di pre-cellule B attivate (come al punto 1). Al fine di migliorare l'adsorbimento virale alle cellule, aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 16 mg per ml.
- Infettare le cellule mediante centrifugazione a 2500 rpm per 90 minuti a 30 ° C.
- Immediatamente dopo lo spin, incubare per ulteriori 48-72 ore a 37 ° C per consentire la crescita cellulare e la proliferazione.
4. Citometria a Flusso Analisi
- Utilizzando un citofluorimetro, analizzare le cellule per l'espressione superficiale di IgG1 B220 e superficie. La presenza di IgG1 sulla superficie delle cellule indica che l'interruttore di ricombinazione di classe si è verificato a seguito di salvataggio di successo attraverso la complementazione retrovirali del gene AID.
5. Rappresentante Risultati
Abbiamo liberato con successo la carenza del fattore proteico citidina deaminasi indotta da attivazione (AID) da AID-deficienti (AID-/ -) linfociti B con trasduzione retrovirale. In breve, abbiamo generato retrovirus ricombinante esprimente SOCCORSO mouse (cameriera) proteina trasfezione delle cellule Phoenix con PMX-Maid-GFP 15-18. I virus raccolti sono stati infettati in AID-deficienti cellule B ottenute da AID topi con deficit di ricombinazione ex interruttore classe vivo (CSR) condizioni di stimolazione 19. Le cellule B infettate sono stati poi analizzati per la RSI a IgG1 dopo 72 ore di cultura in citometria a flusso di analisi. La figura 2 mostra la rilevazione di IgG1 sulla superficie delle cellule B con aiuti, ma non il costrutto vuoto, a indicare che la RSI si è verificato a seguito di aiuti al salvataggio espressione.
Figura 1: Schema di imballaggio retrovirale all'interno delle cellule produttore: Gene di interesse, rappresentate da Ψ, era subcloned in PMX-IRES-GFP, come descritto in precedenza 15. Il plasmide è stato transfettate in una linea cellulare di packaging ecotropic virale in grado di produrre gag-pol e proteine busta (Phoenix, Orbigen), utilizzando il metodo di fosfato di calcio 13, 14. Quarantotto ore dopo la trasfezione, surnatante contenente particelle virali è stato raccolto per l'infezione in cellule B target primario ottenuti da topi.
Figura 2: le cellule B SOCCORSO carenti, stimolati con anti-CD40 e IL-4 sono state infettate con un retrovirus contenente PMX-Maid-GFP o un retrovirus che esprime GFP solo. Il livello di CSR per IgG1 è stata valutata mediante analisi FACS.
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Discussion
Trasduzione retrovirale delle cellule B della milza, come descritto qui e come illustrato nella figura 1 è un approccio genetico che è utile nello studio dei linfociti B, perché molti degli eventi di sviluppo in lymphopoesis sono controllati da regolazione trascrizionale 1, 2. Negli ultimi stadi di maturazione delle cellule B, innescando via CD40L è essenziale per l'induzione della crescita delle cellule B, l'ingresso nel ciclo cellulare e la proliferazione 11, 20. Come mostrato nella Figura 2, le cellule B possono essere stimolate in vitro con anti-CD40 e IL4 di sottoporsi a questa esplosione di proliferazione, e vettori retrovirali sono strumenti utili a un eccesso di esprimere proteine che possono funzionare durante queste fasi di sviluppo delle cellule B. Nell'esempio mostrato in fig. 2, ci dimostrano che gli aiuti con deficit di cellule B che non sono in grado di sottoporsi a RSI (qui per IgG1) possono essere salvati per questa funzione retrovirally introdurre il gene AID mouse. Questo approccio ci consente di tenere traccia di cellule GFP-positive (vedi Figura 1) che hanno subito la RSI (IgG1 GFP + +).
Questo metodo è più vantaggioso di modellazione del mouse, nel senso che può essere completato in meno di una settimana dopo la raccolta splenica in contrasto con l'investimento di tempo per creare un topo transgenico. Il tipo di analisi può essere adattata alle applicazioni per lo sperimentatore; qui abbiamo presentato l'analisi della ricombinazione classe interruttore mediante citometria di flusso come in figura 2. Inoltre, questo metodo è adatto per una vasta gamma di approcci biochimici dopo l'estrazione delle proteine dalle cellule trasdotte retrovirally-15, 21.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
CK è supportato dal programma Columbia University Graduate. UB è Fellow della Leukemia and Lymphoma Society of America, il destinatario del Premio New Investigator dalla Fondazione per la Ricerca leucemia ed è supportato da Facoltà Columbia University di New start-up fondi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
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