Summary
Эффективной системы структуры и функции анализа гена в
Protocol
1. Селезенки В-лимфоцитов изоляции и стимуляции
- Урожай селезенки от AID-дефицитных мышей 12 от 2-3 месяцев. Изоляции селезенки осуществляется в стерильных условиях и органов временно храниться в холодном солевом фосфатном буфере (PBS), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Селезенка затем перевели в стерильную капот культуры тканей и гомогенизировали в 5 мл PBS дополнена 2,5% FBS. Передача гомогената на 15 мл трубки сокола.
- Центрифуга гомогенизированный образец ткани селезенки на 1000rpm в течение 10 минут при 4 ° С для осаждения клеток.
- Декантируйте супернатант после центрифугирования. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл клеток крови красный (РБК) лизис буфера при комнатной температуре в течение 7 минут, чтобы избежать загрязнения красных кровяных телец.
- Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут и сцедить надосадочную и ресуспендирования клеток в 10 мл PBS, содержащего 2,5% FBS.
- Удалить 100 мкл и считать клеток в разведении 1:1000 с использованием стандартного hemacytometer с трипановым синим, чтобы исключить любой мертвых клеток. Примерно 20-30 миллионов клеток могут быть получены в селезенке.
- Центрифуга образца при 1000rpm в течение 10 минут и сцедить супернатант.
- Ресуспендируют гранулы в 0,5% BSA / PBS содержащей 2 мМ ЭДТА в концентрации 10 7 клеток на 90 мкл.
- Добавить анти-CD43 антитела, покрытые магнитных шариков, чтобы клетки специфически связываются не-В-клеток. Используйте 10 мкл бисером на 90 мкл (10 7 клеток). Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 минут.
- Как только клетки были помечены, вымыть их, добавляя 2,5% FBS / PBS в верхней части трубки. Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
- Декантируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 0,1% BSA / PBS в концентрации 10х10 7 клеток на миллилитр.
- Гора магнитная сортировку колонок на магнитном сепараторе. Позиция конической трубе непосредственно под колонки для сбора проточные и нагрузки колонки с 3 мл 0,5% BSA / PBS, чтобы премьер и мыть.
- После мытья жидкость текла через, замените ее на новую трубку коллекции. Если в образце составляет менее 1 мл, отрегулируйте объем образца до 1 мл 0,5% BSA / PBS / ЭДТА и загрузить образец в колонку. Загружать только 1 мл максимум клеток на колонке и использовать несколько столбцов, если это необходимо.
- Разрешить клетки пассивно потока через колонку и собирают свободные клетки в конической трубе при колонке. Вымойте графе 4 раза с 3 мл 0,5% BSA / PBS, продолжая собирать проточные.
- Соберите все проточные, в котором CD43 отрицательные покоящихся клеток B будет обогащаться. Откажитесь от колонки. Центрифуга проточные при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
- Слейте надосадочную жидкость и добавляют 10 мл среды (15% FCS / + глютамин, Pen / Strep, Номера для Незаменимые аминокислоты, 50 мкМ Β-ME)
- Граф клеток и культуры на 10 6 клеток на мл.
- В целях стимулирования B клеточного роста и пролиферации, дополнения среде с рекомбинантным IL-4 и анти-CD40 антитела, такие, что окончательная концентрация 20 мкг / мл и 1 мкг / мл, соответственно, и передачи клеткам культуры колбу.
- Культура клетки на ночь. Граф клеток и разбавить до 10 6 клеток на миллилитр, добавив, IL-4 и CD40 в случае необходимости.
- Культуры клеток для 72 часов до вирусной инфекции.
2. Трансфекция Производитель Клетки
Используйте установленные протоколы для трансфекции с использованием либо катионными липидами или фосфата кальция. Трансфекции 10 см 3 в пластине построить ДНК, с использованием 100 мкг плазмидной ДНК на пластине. Мы обычно используют фосфат кальция трансфекции метод 13, 14 и отметить высокий титр вирусных когда дополнен хлорохину.
- Используйте 60% -70% сливной клетки Феникс в качестве продюсера ячейки, которые будут трансфекции. В это число клеток слияния должна быть не менее 5 миллионов клеток на 10 см тарелку.
- За час до трансфекции, заменить средства массовой информации со свежими полной информации для роста клеток Феникс.
- В стерильную пробирку eppendorpf, объединить 100 мкг упаковки построить ДНК, 250 мкл 0,5 М CaCl 2, а также настроить конечного объема до 500 мкл стерильной водой
- Использование 1 мл пипетки, энергично перемешать это решение с 500 мкл 2X ГНП в 15 мл трубки полипропилена
- Разрешить эту смесь, чтобы отдохнуть при комнатной температуре в течение 8-10 минут. За это время осадок будет форма.
- Добавить трансфекции смесь по каплям к клеткам в то время как закрученной среды, чтобы равномерно распределить смесь во всем.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 12 часов.
- 12 часов после трансфекции, замените среду с 8 мл полной среды рост клеток B и вернуть клетки 37 ° C инкубатора.
3. Заражение Вынужденное селезенки клетки B
- Удалить супернатант из клеток Феникс 48hr после transfection и передать супернатанта через 0,2 мкм фильтр для удаления любой ячейке мусора.
- Смешайте 3 мл вируссодержащих супернатанта с 3 мл предварительно активированный В-клеток (как в шаге 1). В целях повышения вирусной адсорбции клеток, добавить polybrene в конечной концентрации 16 мкг на мл.
- Infect клетки центрифугированием при 2500 оборотах в минуту в течение 90 минут при температуре 30 ° C.
- Сразу же после спина, инкубировать дальнейшего 48-72 часов при 37 ° C для обеспечения роста и пролиферации клеток.
4. Анализ проточной цитометрии
- Использование потока цитометр, анализировать клетки для поверхностного выражения B220 и поверхностных IgG1. Наличие IgG1 на поверхности клеток показывает, что рекомбинация класса переключатель произошло в результате успешного спасения через ретровирусных дополняемости ПОМОЩИ гена.
5. Представитель Результаты
Мы успешно спасли дефицита Активация белка фактор индуцированного дезаминазы цитидин (AID) от AID-дефицитных (AID-/ -) В-лимфоциты использовании ретровирусной трансдукции. Одним словом, мы получили рекомбинантные ретровирусы выражения мыши AID (горничная) белка путем трансфекции клеток с Phoenix PMX-рабыни GFP 15-18. Собрано вирусы были инфицированы в AID B-дефицитных клеток, полученных от AID-дефицитных мышей в бывшей естественных класса переключатель рекомбинации (КСО) стимуляции условиях 19. Инфицированных клеток затем были проанализированы в области КСО для IgG1 после 72 часа в культуре с использованием анализа проточной цитометрии. На рисунке 2 показан обнаружения IgG1 на поверхности В-клеток с AID, но не пустой строить, указывая, что КСО произошло в результате ПОМОЩИ спасательных выражения.
Рисунок 1: Схема ретровирусных упаковке в течение производитель клеток: Гена интерес, в лице Ψ, субклонировали PMX-IRES-GFP, как описано выше 15. Плазмиду трансфицировали в ecotropic вирусных клеточной линии упаковки, способных производить кляп-пол и конверт белка (Феникс, Orbigen), используя метод фосфата кальция 13, 14. Сорок восемь часов после трансфекции, супернатант, содержащий вирусные частицы были собраны для инфекции в целевой первичных клеток, полученных от мышей.
Рисунок 2: ПОМОЩЬ В дефицитных клеток, стимулированных анти-CD40 и ИЛ-4 были инфицированы ретровирусом содержащие PMX-рабыни GFP или ретровируса выражения GFP в одиночку. Уровень корпоративной социальной ответственности в IgG1 оценивалась с помощью анализа FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ретровирусные трансдукции клеток селезенки, как описано здесь и как изображено на рисунке 1, генетический подход, который полезен при изучении В-лимфоцитов, поскольку многие из развития событий в lymphopoesis контролируются регуляции транскрипции 1, 2. В более поздних стадиях созревания В-клеток, запуская через CD40L имеет важное значение для индукции роста В-клеток, вступление в клеточный цикл, а 11 пролиферации, 20. Как показано на рисунке 2, В-клетки могут стимулироваться в пробирке с анти-CD40 и IL4 пройти этого всплеска распространения, и ретровирусные векторы являются полезными инструментами для более-экспресс белки, которые могут работать на этих стадиях развития клеток. В примере, показанном на рис. 2, мы показываем, что AID-дефицитных клеток, которые не в состоянии пройти КСО (здесь, чтобы IgG1) может быть спасена для этой функции retrovirally введения гена мыши AID. Такой подход позволяет нам отслеживать для GFP-положительных клеток (см. рисунок 1), которые подверглись КСО (IgG1 + GFP +).
Этот метод имеет преимущество во мыши моделирования в том, что она может быть завершена менее чем за одну неделю после селезенки урожая, в отличие от времени инвестиций для создания трансгенных мышей. Тип анализа может быть адаптирована к приложениям, следователя, здесь мы представили анализ класс рекомбинации переключатель с помощью проточной цитометрии как показано на рисунке 2. Кроме того, этот метод подходит для целого ряда биохимических подходов следующие белка извлечения из retrovirally-трансдуцированных клетки 15, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
СК при поддержке Колумбийского университета Высшей программы. UB является членом лейкемии и лимфомы общества Америки, получателем Новая премия следователя от лейкемии исследовательского фонда и при поддержке Колумбийского университета в Нью факультет стартовый капитал.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
RPMI | Invitrogen | 22400 | |
PBS | Invitrogen | 20012 | |
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
IL-4 | |||
Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).