Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

Published: February 18, 2011 doi: 10.3791/2371

Summary

Эффективной системы структуры и функции анализа гена в

Protocol

1. Селезенки В-лимфоцитов изоляции и стимуляции

  1. Урожай селезенки от AID-дефицитных мышей 12 от 2-3 месяцев. Изоляции селезенки осуществляется в стерильных условиях и органов временно храниться в холодном солевом фосфатном буфере (PBS), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
  2. Селезенка затем перевели в стерильную капот культуры тканей и гомогенизировали в 5 мл PBS дополнена 2,5% FBS. Передача гомогената на 15 мл трубки сокола.
  3. Центрифуга гомогенизированный образец ткани селезенки на 1000rpm в течение 10 минут при 4 ° С для осаждения клеток.
  4. Декантируйте супернатант после центрифугирования. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл клеток крови красный (РБК) лизис буфера при комнатной температуре в течение 7 минут, чтобы избежать загрязнения красных кровяных телец.
  5. Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут и сцедить надосадочную и ресуспендирования клеток в 10 мл PBS, содержащего 2,5% FBS.
  6. Удалить 100 мкл и считать клеток в разведении 1:1000 с использованием стандартного hemacytometer с трипановым синим, чтобы исключить любой мертвых клеток. Примерно 20-30 миллионов клеток могут быть получены в селезенке.
  7. Центрифуга образца при 1000rpm в течение 10 минут и сцедить супернатант.
  8. Ресуспендируют гранулы в 0,5% BSA / PBS содержащей 2 мМ ЭДТА в концентрации 10 7 клеток на 90 мкл.
  9. Добавить анти-CD43 антитела, покрытые магнитных шариков, чтобы клетки специфически связываются не-В-клеток. Используйте 10 мкл бисером на 90 мкл (10 7 клеток). Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 минут.
  10. Как только клетки были помечены, вымыть их, добавляя 2,5% FBS / PBS в верхней части трубки. Центрифуга образца при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
  11. Декантируйте супернатант. Ресуспендируют клеток в 0,1% BSA / PBS в концентрации 10х10 7 клеток на миллилитр.
  12. Гора магнитная сортировку колонок на магнитном сепараторе. Позиция конической трубе непосредственно под колонки для сбора проточные и нагрузки колонки с 3 мл 0,5% BSA / PBS, чтобы премьер и мыть.
  13. После мытья жидкость текла через, замените ее на новую трубку коллекции. Если в образце составляет менее 1 мл, отрегулируйте объем образца до 1 мл 0,5% BSA / PBS / ЭДТА и загрузить образец в колонку. Загружать только 1 мл максимум клеток на колонке и использовать несколько столбцов, если это необходимо.
  14. Разрешить клетки пассивно потока через колонку и собирают свободные клетки в конической трубе при колонке. Вымойте графе 4 раза с 3 мл 0,5% BSA / PBS, продолжая собирать проточные.
  15. Соберите все проточные, в котором CD43 отрицательные покоящихся клеток B будет обогащаться. Откажитесь от колонки. Центрифуга проточные при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут.
  16. Слейте надосадочную жидкость и добавляют 10 мл среды (15% FCS / + глютамин, Pen / Strep, Номера для Незаменимые аминокислоты, 50 мкМ Β-ME)
  17. Граф клеток и культуры на 10 6 клеток на мл.
  18. В целях стимулирования B клеточного роста и пролиферации, дополнения среде с рекомбинантным IL-4 и анти-CD40 антитела, такие, что окончательная концентрация 20 мкг / мл и 1 мкг / мл, соответственно, и передачи клеткам культуры колбу.
  19. Культура клетки на ночь. Граф клеток и разбавить до 10 6 клеток на миллилитр, добавив, IL-4 и CD40 в случае необходимости.
  20. Культуры клеток для 72 часов до вирусной инфекции.

2. Трансфекция Производитель Клетки

Используйте установленные протоколы для трансфекции с использованием либо катионными липидами или фосфата кальция. Трансфекции 10 см 3 в пластине построить ДНК, с использованием 100 мкг плазмидной ДНК на пластине. Мы обычно используют фосфат кальция трансфекции метод 13, 14 и отметить высокий титр вирусных когда дополнен хлорохину.

  1. Используйте 60% -70% сливной клетки Феникс в качестве продюсера ячейки, которые будут трансфекции. В это число клеток слияния должна быть не менее 5 миллионов клеток на 10 см тарелку.
  2. За час до трансфекции, заменить средства массовой информации со свежими полной информации для роста клеток Феникс.
  3. В стерильную пробирку eppendorpf, объединить 100 мкг упаковки построить ДНК, 250 мкл 0,5 М CaCl 2, а также настроить конечного объема до 500 мкл стерильной водой
  4. Использование 1 мл пипетки, энергично перемешать это решение с 500 мкл 2X ГНП в 15 мл трубки полипропилена
  5. Разрешить эту смесь, чтобы отдохнуть при комнатной температуре в течение 8-10 минут. За это время осадок будет форма.
  6. Добавить трансфекции смесь по каплям к клеткам в то время как закрученной среды, чтобы равномерно распределить смесь во всем.
  7. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 12 часов.
  8. 12 часов после трансфекции, замените среду с 8 мл полной среды рост клеток B и вернуть клетки 37 ° C инкубатора.

3. Заражение Вынужденное селезенки клетки B

  1. Удалить супернатант из клеток Феникс 48hr после transfection и передать супернатанта через 0,2 мкм фильтр для удаления любой ячейке мусора.
  2. Смешайте 3 мл вируссодержащих супернатанта с 3 мл предварительно активированный В-клеток (как в шаге 1). В целях повышения вирусной адсорбции клеток, добавить polybrene в конечной концентрации 16 мкг на мл.
  3. Infect клетки центрифугированием при 2500 оборотах в минуту в течение 90 минут при температуре 30 ° C.
  4. Сразу же после спина, инкубировать дальнейшего 48-72 часов при 37 ° C для обеспечения роста и пролиферации клеток.

4. Анализ проточной цитометрии

  1. Использование потока цитометр, анализировать клетки для поверхностного выражения B220 и поверхностных IgG1. Наличие IgG1 на поверхности клеток показывает, что рекомбинация класса переключатель произошло в результате успешного спасения через ретровирусных дополняемости ПОМОЩИ гена.

5. Представитель Результаты

Мы успешно спасли дефицита Активация белка фактор индуцированного дезаминазы цитидин (AID) от AID-дефицитных (AID-/ -) В-лимфоциты использовании ретровирусной трансдукции. Одним словом, мы получили рекомбинантные ретровирусы выражения мыши AID (горничная) белка путем трансфекции клеток с Phoenix PMX-рабыни GFP 15-18. Собрано вирусы были инфицированы в AID B-дефицитных клеток, полученных от AID-дефицитных мышей в бывшей естественных класса переключатель рекомбинации (КСО) стимуляции условиях 19. Инфицированных клеток затем были проанализированы в области КСО для IgG1 после 72 часа в культуре с использованием анализа проточной цитометрии. На рисунке 2 показан обнаружения IgG1 на поверхности В-клеток с AID, но не пустой строить, указывая, что КСО произошло в результате ПОМОЩИ спасательных выражения.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема ретровирусных упаковке в течение производитель клеток: Гена интерес, в лице Ψ, субклонировали PMX-IRES-GFP, как описано выше 15. Плазмиду трансфицировали в ecotropic вирусных клеточной линии упаковки, способных производить кляп-пол и конверт белка (Феникс, Orbigen), используя метод фосфата кальция 13, 14. Сорок восемь часов после трансфекции, супернатант, содержащий вирусные частицы были собраны для инфекции в целевой первичных клеток, полученных от мышей.

Рисунок 2
Рисунок 2: ПОМОЩЬ В дефицитных клеток, стимулированных анти-CD40 и ИЛ-4 были инфицированы ретровирусом содержащие PMX-рабыни GFP или ретровируса выражения GFP в одиночку. Уровень корпоративной социальной ответственности в IgG1 оценивалась с помощью анализа FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ретровирусные трансдукции клеток селезенки, как описано здесь и как изображено на рисунке 1, генетический подход, который полезен при изучении В-лимфоцитов, поскольку многие из развития событий в lymphopoesis контролируются регуляции транскрипции 1, 2. В более поздних стадиях созревания В-клеток, запуская через CD40L имеет важное значение для индукции роста В-клеток, вступление в клеточный цикл, а 11 пролиферации, 20. Как показано на рисунке 2, В-клетки могут стимулироваться в пробирке с анти-CD40 и IL4 пройти этого всплеска распространения, и ретровирусные векторы являются полезными инструментами для более-экспресс белки, которые могут работать на этих стадиях развития клеток. В примере, показанном на рис. 2, мы показываем, что AID-дефицитных клеток, которые не в состоянии пройти КСО (здесь, чтобы IgG1) может быть спасена для этой функции retrovirally введения гена мыши AID. Такой подход позволяет нам отслеживать для GFP-положительных клеток (см. рисунок 1), которые подверглись КСО (IgG1 + GFP +).

Этот метод имеет преимущество во мыши моделирования в том, что она может быть завершена менее чем за одну неделю после селезенки урожая, в отличие от времени инвестиций для создания трансгенных мышей. Тип анализа может быть адаптирована к приложениям, следователя, здесь мы представили анализ класс рекомбинации переключатель с помощью проточной цитометрии как показано на рисунке 2. Кроме того, этот метод подходит для целого ряда биохимических подходов следующие белка извлечения из retrovirally-трансдуцированных клетки 15, 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

СК при поддержке Колумбийского университета Высшей программы. UB является членом лейкемии и лимфомы общества Америки, получателем Новая премия следователя от лейкемии исследовательского фонда и при поддержке Колумбийского университета в Нью факультет стартовый капитал.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS Atlanta Biologicals S11550
RPMI Invitrogen 22400
PBS Invitrogen 20012
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
CD43 beads Miltenyi Biotec
B Cell Complete Media Various Various Components RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol
IL-4
Anti-CD40 BD Biosciences 553787
polybrene Sigma-Aldrich 107689 

Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Used at 100mM
Ph–nix Eco cells (Murine) Orbigen RVC-10002
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) eBioscience 15-0452-81
PE-α-mouse-IgG1 BD Biosciences A85-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
  2. Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
  3. Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
  4. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  5. Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
  6. Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
  7. Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
  8. Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
  9. Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
  10. Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
  11. Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
  12. Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
  13. Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
  14. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
  15. Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
  16. Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
  17. McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
  18. Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
  19. Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
  20. Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
  21. Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).

Tags

Инфекция выпуск 48 Ретровирусные трансдукции первичных элементов B
Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keim, C., Grinstein, V., Basu, U.More

Keim, C., Grinstein, V., Basu, U. Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells. J. Vis. Exp. (48), e2371, doi:10.3791/2371 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter