Summary
Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir sistem
Abstract
Ökaryotik hücrelerde genlerin transgenik ifade ilgi bir gen ortaya çıkan fenotip analizi kolaylaştırmak için heterolog ifade sisteminin kontrolü altında ifade edildiği güçlü bir ters genetik bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, normal organizmada bulunan bir gen ifade etmek için bir gen ürünü bir mutant formu ifade etmek, ya da gen ürünü bir dominant-negatif bir form içinde ifade etmek için kullanılabilir. Transkripsiyonel yönetmelik 2-4 yorumlanan B hücreleri 1, gelişimi ve farklılaşmasında önemli bir kontrol mekanizması hematopoetik sistem, çalışmaya yararlıdır.
Fare genetik, insan genlerini ve hastalıkların çalışma için güçlü bir araçtır. Fare ve insan genomu karşılaştırmalı bir analiz genom 5 üzerinden% 90 synteny korunması ortaya koymaktadır. Ayrıca, fare modellerinde kullanılan teknoloji, örneğin, gen kesintileri ve alel değiştirme 6 insan genlerinin çalışma için geçerli Ancak, transgenik fare yaratma, hem de mali ve teknik nitelikte kaynakların büyük bir anlaşma gerektirir . Fare suşlarının knock out kütüphaneleri (Komp, EUCOMM, NorCOMM) veya büyük ölçekli çabaları ve işbirliği 7 gerektiren mutagenez indüklenen suşları (RIKEN), derlemek için çeşitli projeler başladı. Bu nedenle, ilk önce bir fare modeli ilerleyen önce birincil hücrelerinin bir hücre kültürü modelinde istenen bir genin fenotipi çalışma arzu edilir.
Retroviral DNA istikrarlı, tercihen içinde veya transkripsiyon birimleri veya CpG adaları yakınında, konak DNA'sına entegre ve transkripsiyonel susturulması 8 9 kaçınarak faiz paketlenmiş gen ekspresyonu kalıtsal. Genler sonra, transkripsiyon ve protein üretimini yüksek verimlilik, yüksek verimlilik retroviral organizatörü kontrolü altında kopyalanır. Bu nedenle, retroviral ifade transfect için zor hücreleri kullanılan hücrelerin mitoz sırasında aktif bir devlet olabilir. Virüs yapısal genler ambalaj hücre hattı içinde yer olduğundan, ilgi gen klonu için kullanılan ifade vektörler viral revertants olasılığını ortadan kaldırır ve viral süpernatantlar ile çalışma güvenliğini artırır, virüs yapısal genleri içeren bulaşıcı virionlar 10 üretilmektedir.
Burada rekombinant retroviral üretim ve dalak B hücreleri sonraki enfeksiyon için bir protokol mevcut. Izolasyondan sonra, kültürlü Th elde edilen lenfokinler ve B hücre çoğalması ve farklılaşması 11 bir patlama neden olur anti-CD40, dalak hücreleri ile uyarılır . Bu protokol, dalak plasmasitik farklılaşma ikna etmek için değil, antijenik stimülasyon önce ilk hematopoetik olaylar aşağıdaki B hücreleri izole olarak, geç B hücre gelişimi ve farklılaşmasında meydana gelen olayların çalışma için idealdir.
Protocol
1. Dalak B-Lenfosit İzolasyon ve Uyarım
- YARDIM-eksik fareler 12 yaş 2-3 ay arasında dalak Hasat. Dalak izolasyon steril şartlarda yapılır ve% 15 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk fosfat buffer salin (PBS) organları geçici olarak tutulur.
- Dalak sonra steril bir doku kültürü kaput aktarılır ve% 2.5 FBS ile takviye 5 ml PBS içinde homojenize edilir. Homojenat 15 ml şahin tüpüne aktarın.
- 4 1000rpm 10 dakika homojenize dalak doku örneği Santrifüj ° C pelet hücreleri.
- Süpernatant santrifüj sonra süzün. Kırmızı kan hücreleri tarafından kirlenmesini önlemek için, 10 ml kırmızı kan hücresi hücre pelet (RBC) 7 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis tamponu tekrar
- 1000 rpm'de 10 dakika ve süzün süpernatant örnek Santrifüj ve 10 ml PBS% 2.5 FBS içeren hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin.
- 100 mcL kısım çıkarın ve ölü hücreleri hariç tripan mavi kullanarak standart bir hemasitometre kullanarak 1:1000 dilüsyon hücreleri saymak. Yaklaşık 20-30 milyon hücreler dalak başına elde edilebilir.
- 1000rpm az 10 dakika boyunca örnek Santrifüj ve süpernatantı süzün.
- % 0.5 'lik bir konsantrasyon 90 mcL başına 10 7 hücre BSA / PBS içeren 2mm EDTA pelletini tekrar.
- Özellikle non-B hücreleri bağlamak için anti-CD43 antikor kaplı manyetik bilye hücrelere ekleyin. 90 mcL başına 10 mcL boncuk (10 7 hücreleri) kullanın. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 20 dakika için.
- Hücrelerin etiketli edildikten sonra,% 2.5 FBS / PBS tüp başına ekleyerek yıkayın. 1000 rpm'de 10 dakika boyunca örnek santrifüjleyin.
- Süpernatant Durusu. Ml başına 10x10 7 hücre konsantrasyonunda% 0,1 BSA / PBS hücrelerin tekrar
- Mount bir manyetik ayırıcı bir manyetik sıralama sütun. Flow-through toplamak ve sütun BSA / PBS başbakan ve yıkama 3ml% 0.5 'yüklemek için konik bir tüp doğrudan sütun altına yerleştirin.
- Yıkama sıvısı akardı sonra, yeni bir toplama tüpü ile değiştirin. Örnek 1 ml den az ise,% 0.5 'BSA / PBS / EDTA ile 1 ml numune hacmi ayarlamak ve sütunda örnek yük. Yük hücreleri kolon başına sadece 1 ml maksimum ve gerekirse birden çok sütun kullanabilirsiniz.
- Hücreleri pasif sütunun altında sütun üzerinden akış ve konik tüp ilişkisiz hücreleri toplamak için izin verin. 3 mL% 0,5 BSA / PBS-through akış toplamaya devam ederken, sütun 4 kez yıkayın.
- CD43 negatif dinlenme B hücreleri zenginleştirilmiş olacağı flow-through toplayın. Sütun atın. 1000 rpm'de 10 dakika flow-through santrifüjleyin.
- Süpernatant boşaltın ve 10 ml orta (15% FCS / + glutamin, Pen / Strep, Sigara esansiyel amino asitler, 50 mcM Β-ME)
- Ml'de 10 6 hücre kültürü, hücre ve güvenin .
- B hücre büyüme ve çoğalmasını teşvik etmek için, sırasıyla, son konsantrasyonu 20 mcg / ml ve 1 mcg / mL olduğu gibi rekombinant IL-4 ve anti-CD40 antikoru ile orta takviyesi, ve hücreler bir kültür şişesi aktarmak.
- Hücrelerin bir gecede Kültür. Hücre sayımı ve uygun olarak IL-4 ve CD40 ekleyerek ml'de 10 6 hücre seyreltik.
- 72 saat önce viral enfeksiyon Kültür hücreleri.
2. Üretici Hücreler, Transfeksiyon
Katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat kullanarak transfeksiyon için kurulan protokolleri kullanın. Plaka başına 100 mikrogram plazmid DNA ile DNA inşa başına Transfect 10cm 3 tabak,. Biz rutin olarak kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 13, 14 ve klorokin ile desteklenmiş yüksek viral titresi unutmayın .
- Üretici hücreleri transfekte olarak% 60 -70% konfluent Phoenix hücreleri kullanın. Bu izdiham hücre sayısı az, 10 cm plaka başına 5 milyon hücre olmalıdır.
- Transfeksiyon için bir saat önce, Phoenix hücre büyümesi için taze eksiksiz bir medya ortamı değiştirin.
- Steril bir eppendorpf tüp, ambalaj inşa DNA, 0,5 M CaCl 2 250 mcL 100 mikrogram birleştirmek ve steril su ile 500 mcL son ses seviyesini ayarlamak
- 1 ml pipet kullanarak, şiddetle 15 mL polipropilen tüp içinde 500 mcL 2X HNP ile bu çözüm karışımı
- Bu karışımı oda sıcaklığında 8-10 dakika dinlenmek için izin verin. Bu süre zarfında bir çökelti oluşacaktır.
- Boyunca karışımı eşit olarak dağıtmak için orta dönen hücrelere açılan akıllıca transfeksiyon karışımı ekleyin.
- 37 hücreleri ° C'de 12 saat boyunca.
- 12 saat sonrası transfeksiyon, 8 ml tam B hücre büyümesini orta orta değiştirin ve 37 ° C inkübatör hücreleri geri dönmek.
3. Uyarılmış Dalak B Hücreleri Enfeksiyon
- Post-transfe 48hr Phoenix hücrelerden süpernatantıction ve herhangi bir hücre enkaz kaldırmak için 0.2 mikron filtre ile süpernatantı geçmek.
- 3 mL karıştırın virüs içeren önceden aktive B hücreleri (adım 1) 3 mL süpernatant. Hücrelerin viral adsorpsiyon artırmak amacıyla, ml başına 16 mikrogram final konsantrasyonda polybrene ekleyin.
- 30 90 dakika 2500 rpm'de santrifüj hücreleri enfekte ° C
- 37 az 48-72 saat daha inkübe spin ° C hücre büyümesi ve çoğalması için izin hemen sonra.
4. Akım Sitometri Analizi
- Kullanarak, B220 ve yüzey IgG1 yüzey ifade etmek için bir akış sitometresinde hücreleri analiz. Hücrelerinin yüzeyinde IgG1 varlığı sınıf anahtarı rekombinasyon başarılı kurtarma YARDIM gen retroviral tamamlama yoluyla bir sonucu olarak meydana gelmiştir gösterir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Biz başarıyla YARDIM eksikliği (YARDIM-/ -) protein faktörü Etkinleştirme İndüklenmiş sitidinin Deaminaz (AID) eksikliği kurtarıldı retroviral transdüksiyon kullanarak B-lenfositleri. Kısaca, Çocuk ve kadınlarda Maid-GFP 15-18 ile Phoenix hücreleri transfecting fare AID (MAID) proteini rekombinant retrovirüsler ifade oluşturulur. Hasat virüsler, ex vivo sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) stimülasyon koşulları 19 YARDIM-eksik farelerde elde YARDIM eksikliği B hücreleri enfekte olmuş . Enfekte B hücreleri daha sonra kültür flow sitometri analizi kullanarak 72 saat sonra KSS IgG1 incelendi. Şekil 2 KSS YARDIM ifade kurtarma bir sonucu olarak meydana geldiğini belirten YARDIM değil boş bir yapı ile B hücrelerinin yüzeyinde IgG1 tespiti gösterir.
Şekil 1: Üretici hücreleri içinde retroviral ambalaj şeması: Ψ tarafından temsil edilen, daha önce 15 açıklandığı gibi ilgi Gen, Çocuk ve kadınlarda IRES-GFP içine subcloned. Plazmid kullanılarak kalsiyum fosfat yöntemi, 13, 14, gag-pol ve zarf proteini (Phoenix, Orbigen) üretme kapasitesine sahip bir ecotropic viral ambalaj hücre hattı içine transfekte oldu. Transfeksiyon Kırk sekiz saat sonra, süpernatant içeren viral parçacıkların farelerden elde edilen hedef birincil B hücreleri içine enfeksiyon için toplandı.
Şekil 2: YARDIM eksik B hücreleri, anti-CD40 ile uyarılan ve IL-4, Çocuk ve kadınlarda Maid-GFP veya tek başına, GFP ifade eden bir retrovirüs içeren bir retrovirüs ile enfekte edildi . IgG1 KSS FACS analizi ile değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şekil 1 burada tarif ve tasvir olarak dalak B hücreleri retroviral transdüksiyon lymphopoesis gelişimsel olayların birçok transkripsiyonel Kural 1, 2 kontrol edilir çünkü, B-lenfositleri çalışma yararlı genetik bir yaklaşımdır . CD40L üzerinden tetikleme B hücre olgunlaşması, daha sonraki aşamalarında, B hücre büyüme indüksiyon, hücre döngüsü içine giriş ve çoğalması 11, 20 için gereklidir . Şekil 2'de görüldüğü gibi, B hücrelerinin çoğalması bu patlama geçmesi in vitro anti-CD40 ve IL4 ile uyarılır ve retroviral vektörlerin, B hücre gelişimi bu aşamalar sırasında işlev üzerinden ifade proteinler için yararlı araçlar olabilir. Şekil örnekte. 2, YARDIM-retrovirally fare YARDIM gen getirerek eksik CSR (burada IgG1) geçmesi mümkün olan B hücreleri bu işlev için kurtarıldı edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım bize GFP pozitif hücreler için (bkz. Şekil 1) KSS uğramadığını (IgG1 + GFP +) izlemek için izin verir.
Bu yöntem, transgenik fare oluşturmak için zaman yatırım aksine dalak hasattan sonra az bir hafta içinde tamamlanacak. Fare modelleme üzerinde avantajlıdır. Tip analiz araştırmacı uygulamaları için uygun olabilir, biz burada Şekil 2'de, flow sitometri ile sınıf anahtarı rekombinasyon analiz sunduk . Ayrıca, bu yöntem, retrovirally transduced hücreleri 15, 21 protein çekimini takiben biyokimyasal yaklaşımların bir dizi için uygundur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
CK, Columbia Üniversitesi Yüksek Lisans programı tarafından desteklenmektedir. UB Amerika Lösemi ve Lenfoma Derneği, Yeni Araştırmacı Ödülü Lösemi Araştırma Vakfı alıcı üyesidir ve Columbia Üniversitesi New Fakültesi başlangıç fonu tarafından destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
