Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Summary

इस प्रोटोकॉल के लिए काटना आवश्यक कदम रूपरेखा, electroporation और संस्कृति माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के माध्यम से transfect. लघु अवधि संस्कृतियों अक्षतंतु परिणाम और मार्गदर्शन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लंबी अवधि के संस्कृतियों synaptogenesis और वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी विश्लेषण के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Hippocampal और cortical न्यूरॉन्स बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है केंद्रीय तंत्रिका (सीएनएस) neuronal ध्रुवीकरण प्रणाली, अक्षतंतु / dendrite परिणाम, और synapse गठन और समारोह का अध्ययन. संवर्धन इन न्यूरॉन्स की एक और लाभ यह है कि वे आसानी से फूट डालना, विशिष्ट axons और dendrites बहुत कम घनत्व पर एक दो आयामी सब्सट्रेट पर, बनाने. यह गुण उन्हें neuronal विकास के कई पहलुओं का निर्धारण करने के लिए अत्यंत उपयोगी बना दिया है. इसके अलावा, इन न्यूरॉन्स के लिए glial कंडीशनिंग प्रदान करके वे विकसित करने के लिए जारी, कार्यात्मक synaptic कनेक्शन बनाने और संस्कृति में कई महीनों के लिए जीवित. इस प्रोटोकॉल में हम टुकड़े करना करने के लिए एक तकनीक, संस्कृति और transfect भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स रूपरेखा. अभिकर्मक न्यूरॉन्स में nucleofection के माध्यम से चढ़ाना पहले डीएनए electroporating द्वारा पूरा किया है. इस प्रोटोकॉल fluorescently टैग संलयन विकास (~ 4-8hrs चढ़ाना के बाद) ध्रुवीकरण, अक्षतंतु परिणाम और शाखाओं में बंटी के दौरान प्रोटीन की गतिशीलता और समारोह का अध्ययन में जल्दी प्रोटीन व्यक्त का लाभ है. हम यह भी पता चला है कि चढ़ाना पहले इस एक अभिकर्मक न्यूरॉन (> संस्कृति में 2 महीने) के जीवन भर इमेजिंग के लिए उपयुक्त स्तर पर fluorescently टैग संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति का कहना है. इस प्रकार, इस पद्धति neuronal समारोह के छोटे या कोई व्यवधान के साथ प्रोटीन और CNS विकास में स्थानीयकरण समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी है.

Protocol

1. Coverslips और मंडलों की तैयारी

1. साफ coverslips और कक्षों की तैयारी स्वस्थ संस्कृतियों के लिए आवश्यक है. शॉर्टकट को इन चरणों में से किसी में नहीं लिया जाना चाहिए.
2. एक समर्पित ग्लास जार या बीकर में केंद्रित नाइट्रिक एसिड (HNO3) में रातोंरात (कैरोलिना सहायक ब्रांड 12mm या 22mm दौर, जर्मन ग्लास) coverslips धो लें.
3. नाइट्रिक एसिड से coverslips निकालें और बड़े पैमाने पर विआयनीकृत जल में (5-7x) धो.
4. एक लामिना का प्रवाह डाकू या जैव सुरक्षा कैबिनेट में coverslips और सूखी अलग. जब सूखा, उन्हें 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ बाँझ. प्लेस भंडारण के लिए एक बाँझ पेट्री डिश में coverslips निष्फल. यदि 12mm coverslips पर चढ़ाना न्यूरॉन्स एक बाँझ 35 मिमी डिश में सीधे coverslips जगह और धारा 2 के लिए आगे बढ़ना.
5. इमेजिंग कक्षों 35 मिमी पेट्री डिश के तल में एक 15mm छेद (सभी burrs निकालने के लिए) ड्रिलिंग और आयल और पेट्रोलियम जेली की एक 3:1 मिश्रण के साथ साफ coverslips संलग्न द्वारा निर्माण कर रहे हैं.
6. / एक उबलते पानी के स्नान के अंदर एक चोटीदार ट्यूब में पेट्रोलियम जेली मिश्रण आयल पिगलो. एक छोटे पेंट ब्रश का प्रयोग करें और 15mm छेद के चारों ओर पकवान के नीचे कोट. आयल / पेट्रोलियम जेली मिश्रण क्रियाशीलता के रूप में इसे अलग कर देगा रखने के लिए सुनिश्चित करें. इस पेट्रोलियम जेली की एक उच्च एकाग्रता है, जो चिपचिपा हो जाते हैं जब व्यंजन इनक्यूबेटर में रखा जाता है, coverslip टुकड़ी में जिसके परिणामस्वरूप के साथ एक साथ चिपके कोठरियों में आमतौर पर परिणाम. शेष आयल / पेट्रोलियम जेली कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
7. पकवान उल्टा और एक फ्लैट ट्रे पर जगह जगह coverslip छेद पर. में गर्म 80 डिग्री सेल्सियस ओवन जब तक आयल मिश्रण पिघला है (~ 10 मिनट). एक सपाट सतह पर बर्तन निकालें और आयल मिश्रण सेट चलो.
8. व्यंजन मुड़ें और कवर और यूवी प्रकाश के साथ कक्षों के नीचे के दोनों अंदर बाँझ.
9. कोट coverslips या 1.0mg/mL (30kDa) borate बफर (0.1M सोडियम borate, पीएच 8.5) में एक घंटे के लिए पाली - घ lysine साथ कक्षों के कांच क्षेत्रों. टिशू कल्चर ग्रेड विआयनीकृत जल की प्रचुर मात्रा के साथ 3-5 बार कुल्ला करें. Borate बफर के सभी निशान को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें. सूखी और बाद में उपयोग के लिए तुरंत या दुकान कक्षों / coverslips उपयोग. हम आम तौर पर तैयारी के एक माह के भीतर साफ coverslips का उपयोग करें.

2. Neuronal विच्छेदन और मध्यम संस्कृति की तैयारी

1. टिशू कल्चर ग्रेड पानी के लिए 10x HBSS और 100X HEPES की उचित मात्रा में जोड़कर विच्छेदन मध्यम (डीएम) तैयार करें. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस विच्छेदन के दौरान बर्फ पर रखें.
2. विच्छेदन दिन पहले चढ़ाना (प्रधानमंत्री) मध्यम और सीरम मुक्त माध्यम (SFM) तैयार करते हैं. प्रधानमंत्री Neurobasal मध्यम, B27 पूरक, 2 मिमी glutamine, 0.3% ग्लूकोज, 37.5 मिमी NaCl और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के होते हैं. SFM Neurobasal मध्यम, B27 पूरक, 2 मिमी glutamine, 0.3% ग्लूकोज और 37.5 मिमी NaCl के होते हैं.
3. विच्छेदन और एक टिशू कल्चर में दुकान के लिए केवल पर्याप्त टोपी के साथ रातोंरात इनक्यूबेटर थोड़ा अधखुला इतना है कि मध्यम equilibrates के _{तापमान} और सीओ 2 सामग्री बनाओ. हम अतिरिक्त ग्लूकोज जोड़ने और लगभग 310mOsm NaCl साथ osmolality वृद्धि. हम पाते हैं संस्कृतियों अधिक शारीरिक osmolality (Neurobasal osmolality आम तौर पर 205 245mOsm) में बेहतर कर.

3. लंबे समय तक संस्कृति के लिए cortical Glial फीडर परत तैयारी

1. यदि लंबे समय तक संस्कृतियों के लिए तैयार हो रहे हैं, cortical या hippocampal dissections के साथ जारी रखने से पहले प्रोटोकॉल दो से तीन सप्ताह के इस हिस्से का प्रदर्शन.
2. Glial मध्यम (जीएम) सदस्य के साथ, 0.3% ग्लूकोज, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% घोड़े सीरम तैयार करें.
3. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करके P1-P3 माउस पिल्ले euthanize. बर्फ और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे से एक पिल्ला से निकालें. जल्दी से कैंची से सिर काटना. ठंड डीएम (2.1 कदम) से युक्त डिश के लिए पूरे मस्तिष्क निकालें.
4. दो प्रमस्तिष्क गोलार्द्धों और meninges निकालें. आबकारी neocortex और एक नए नहीं मीडिया वाले पकवान को हटाएं. 4 कुल दिमाग से cortices तैयार करें.
5. संभव के रूप में ठीक है के रूप में एक स्वच्छ, बाँझ धार के साथ cortices कीमा और 50 एमएल शंक्वाकार ठंड डीएम के 12 एमएल युक्त ट्यूब के लिए एक प्लास्टिक विंदुक के साथ कटा ऊतक निकालने. 0.25% (1.5 एमएल) और 0.1% (1.5 एमएल), क्रमशः के अंतिम सांद्रता trypsin और DNase जोड़ें. आंतरायिक घूमता के साथ 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं.
6. Cortical ऊतक युक्त ट्यूब निकालें और टिशू कल्चर हुड में लाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ. Pipet cortical एक 10 एमएल विंदुक के साथ और ऊतक नीचे लगभग 10-15 बार, या जब तक अधिकांश हिस्सा गायब हो जाते हैं.
7. 37 डिग्री सेल्सियस आंतरायिक घूमता के साथ एक और 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में ट्यूब लौटें.
8. 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब अच्छी तरह से साफ और टिशू कल्चर हुड वापस लाने. Pipet cortical एक मीटर के साथ 5 और ऊतक नीचेएल विंदुक लगभग 10-15 बार, या जब तक हिस्सा गायब हो.
9. गर्म जीएम के 15 एमएल और 200xg (1000rpm) पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें.
10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, ताजा जीएम के 20 एमएल में pelleted कोशिकाओं resuspend और एक hemocytometer साथ गिनती. 5 - 7.5x10 प्लेट 75cm ² फ्लास्क प्रति जीएम के 15 एमएल में ⁶ कोशिकाओं.
11. एक दिन और संस्कृति में हर 2-3 दिनों के बाद के बाद, अपने हाथ के खिलाफ फ्लास्क दस्तक द्वारा ढीले कोशिकाओं बेदखल. किसी भी उखाड़ फेंकना कोशिकाओं के साथ साथ मध्यम निकालें और ताजा जीएम के 15 एमएल के साथ बदलें.
12. Glia बोतल में वृद्धि के 1-2 सप्ताह के बाद काटा जा सकता है है, जब वे के बारे में 7-10% मिला हुआ हैं. व्यक्तिगत glia साथ लेपित coverslips तैयार करने के लिए, जगह 6 नाइट्रिक एसिड और साफ एक 10cm पकवान में 25mm दौर coverslips निष्फल, और जगह प्रत्येक coverslip पर एक छोटे पेंट ब्रश के साथ एक त्रिकोणीय पैटर्न में आयल / पेट्रोलियम जेली के 03:01 मिश्रण के 3 बिंदु . 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ खुला व्यंजन समझो. कोट 0.1 मिलीग्राम / एमएल borate बफर में (30kDa) पाली - घ lysine एक घंटे के लिए है, तो बड़े पैमाने पर धो (3-5x) बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड विआयनीकृत जल के साथ और सूख जाने के साथ coverslips.
13. इनक्यूबेटर से glial युक्त कुप्पी निकालें, मध्यम त्यागने और पूर्व गर्म trypsin / EDTA समाधान के 5 एमएल के साथ कुल्ला. कुप्पी से trypsin / EDTA समाधान निकालें और कुप्पी में ताजा पूर्व गर्म trypsin / EDTA के 3 एमएल विंदुक. 37 डिग्री सेल्सियस जीएम के 5 एमएल जोड़ने के लिए trypsinization रोक से पहले 1 मिनट के लिए फ्लास्क सेते हैं.
14. 10-15 बार pipetting दोहराया कुप्पी से glia, निकालें और फिर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब मीडिया स्थानांतरण. 200xg (1000rpm) में 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. निकालें सतह पर तैरनेवाला और 10cm पकवान युक्त coverslips प्रति 12.5 एमएल जीएम के में जीएम के 10 एमएल, गिनती कोशिकाओं, और थाली 5x10 ⁵ कोशिकाओं को जोड़ने .
15. ताजा पूर्व गर्म जीएम हर 2-3 दिन के साथ मध्यम विनिमय. न्यूरॉन विच्छेदन के पहले दिन, जीएम हटाने और SFM (2.2 अनुभाग) के साथ बदलें. 4.12 चरण में इस glial वातानुकूलित SFM का उपयोग करें जब cortical या hippocampal संस्कृतियों बाढ़.

4. Cortical और / या hippocampal विच्छेदन और electroporation

1. Nucleofection समाधान (Lonza) की उचित मात्रा में निकालें, गठबंधन, और विच्छेदन शुरू करने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म. चूंकि Nucleofection समाधान एक सीमित जीवनकाल है जब संयुक्त, हम केवल प्रत्येक तैयारी (100 μL प्रति अभिकर्मक) के लिए आवश्यक राशि गठबंधन.
2. E15.5 में सीओ ₂ (प्लग के दिन E0.5 है) के साथ एक गर्भवती माउस और एक 10cm पेट्री डिश में गर्भाशय निकालना euthanize . ठंड डीएम (2.1 अनुभाग) में fetuses और सिर काटना निकालें.
3. ठंड डीएम की एक अलग पकवान में पूरे मस्तिष्क निकालें और एक तुला टंगस्टन सुई के साथ, दोनों neocortices को हटायें. ठंड डीएम के नए पकवान में microforceps और जगह cortices साथ meninges निकालें. एक छोटे परितारिका या Wecker कैंची के साथ, या 1.5 एमएल Eppendorf ठंड डीएम के 1.0 एमएल के साथ भरा ट्यूब में हिप्पोकैम्पस और जगह प्रांतस्था हटा दें. इस ट्यूब बर्फ पर रखें.
4. सभी cortices या hippocampi विदारक करने के बाद, Eppendorf ट्यूब एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए जगह और ट्यूब ऊतक युक्त 2.5% trypsin के 110 μL जोड़ें.
5. 1.0 एमएल PM (2.2 अनुभाग) के साथ धीरे inverting Eppendorf ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला और धोने cortices या hippocampi निकालें. धोने दो बार दोहराएँ, ट्यूब में प्रधानमंत्री के 1 एमएल छोड़ने.
6. हिस्सा एक P1000 विंदुक के साथ 15 बार Triturate, और एक नया 15 एमएल शंक्वाकार PM की 4 एमएल युक्त ट्यूब / सतह पर तैरनेवाला कोशिकाओं को हटाने, Eppendorf ट्यूब में किसी भी हिस्सा है कि रहने को छोड़कर.
7. 20xg (350rpm) पर ब्रेक से 7 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूब स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्रत्येक अभिकर्मक के लिए premixed, कमरे के तापमान nucleofection समाधान (Lonza) के 100 μL जोड़ने. Triturate P1000 पिपेट की एक कोमल और नीचे गति के साथ 5 बार.
8. प्रत्येक नए Eppendorf ट्यूब nucleofection मिश्रण / समाधान सेल के 100 μL निकालें और डीएनए की उचित राशि जोड़ें. संस्कृतियों के लिए लंबे समय तक हम आम तौर पर 1 अभिकर्मक प्रति डीएनए के 2μg उपयोग. हालांकि, यह केवल लेबल संस्कृति में न्यूरॉन्स की एक छोटे से अनुपात <10%. हम आम तौर पर अभिकर्मक प्रति डीएनए के 5 10μg उपयोग अगर अल्पावधि संस्कृति के लिए उच्च दक्षता अभिकर्मक चाहते हैं. हम डीएनए की 40μg की कुल करने के लिए इस्तेमाल किया है, जब दो अलग अलग plasmids के साथ transfecting. प्लास्मिड ते बफर में 1μg / μL पर संग्रहीत हैं.
9. क्युवेट (Lonza) सेल निलंबन / डीएनए जोड़ें और Nucleofector (Lonza) में कोशिकाओं electroporate, हे-005 (माउस सीएनएस न्यूरॉन्स) प्रोग्राम का उपयोग.
10. जल्दी कार्य, क्युवेट पूर्व गर्म और equilibrated PM 500 μL जोड़ सकते हैं और समाधान / एक नया 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब कोशिकाओं को निकालने. प्रत्येक अभिकर्मक की 1.0 एमएल मात्रा लाने के लिए पर्याप्त PM जोड़ें. 3-5x10 ³ कोशिकाओं / दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए ² सेमी युवा संस्कृतियों, या 5-10x10 ³ कोशिकाओं / ² सेमी के लिए पर एक hemocytometer और प्लेट के साथ कोशिकाओं < गणना./ Li>
11. अल्पकालिक संस्कृतियों, बाढ़ गरम की 2.0 एमएल, चढ़ाना के एक घंटे बाद सीओ _{2-equilibrated} SFM के साथ 35 मिमी संस्कृति व्यंजन. Coverslips का उपयोग अगर, हम प्रधानमंत्री के एक आधा दूर और यह SFM के साथ की जगह है, तो दो बार दोहराएँ. या तो इमेजिंग कक्षों बाढ़ या एक बहुत ही कम सीरम सामग्री (<0.5%) में coverslips परिणाम धोने. लघु अवधि संस्कृतियों एक glial फीडर परत के साथ सुसंस्कृत हो जरूरत नहीं है और जरूरत है फिर से खिलाया नहीं किया जा.
12. दीर्घकालिक संस्कृतियों के लिए, हम आयल / पेट्रोलियम जेली की तीन बिंदु युक्त glia कवर coverslip हटाने और यह 35 मिमी डिश में छेद 15mm, प्रारंभिक चढ़ाना के बाद एक घंटे से अधिक पलटना. Glial पकवान से वातानुकूलित SFM के दो मिलीलीटर तो इमेजिंग कक्ष में जोड़ा जाता है. लंबी अवधि संस्कृतियों फ़ीड करने के लिए, हम SFM हर 2-3 दिनों की एक तिहाई को हटाने और यह ताजा, पूर्व _{गर्म और} CO 2-equilibrated SFM के साथ प्रतिस्थापित.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1. Hippocampal न्यूरॉन्स रहने वाले प्रतिनिधि के विकास के क्रमिक चरणों में hippocampal न्यूरॉन्स रहते हैं. बनती छवियों दोनों एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि और एक इसी फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ के रूप में दिखाए जाते हैं. इन कोशिकाओं के प्रत्येक और pCAX वैक्टर में EGFP ट्यूबिलिन DsRed2 के साथ किया गया ट्रांसफ़ेक्ट है. स्टेज 1 (1DIV), चरण 2 (1DIV), 3 स्टेज (2DIV), स्टेज 4 (11DIV) और चरण 5 (32DIV): न्यूरॉन्स इन विट्रो में निम्नलिखित दिन (DIV) पर imaged थे. स्केल बार 20μm है.

Discussion

संवर्धन भ्रूण hippocampal और cortical माउस न्यूरॉन्स के लिए इस प्रोटोकॉल बैंकर प्रोटोकॉल, जो चूहे ^{न्यूरॉन्स} 1,2 का उपयोग करता है की एक संशोधन के रूप में विकसित किया गया था. हम संवर्धन माउस और हम्सटर न्यूरॉन्स के ^लिए 3,4,5,6,7 में अच्छी तरह के रूप में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है . इस प्रोटोकॉल दोनों hippocampal और neocortical न्यूरॉन्स के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है और ^एक Meberg और 8 मिलर द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान है. आम तौर पर, हम लंबे समय तक संस्कृति के लिए hippocampal न्यूरॉन्स का उपयोग करें, क्योंकि वे अच्छी तरह से विशेषता है और एक और अधिक मॉडल प्रणाली की स्थापना की. इसके अलावा, वे neocortex से न्यूरॉन्स की एक और अधिक सजातीय आबादी शामिल होने की संभावना हैं. हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग भी जीवित है और इसी तरह अंतर (अप्रकाशित डेटा) neocortical न्यूरॉन्स सुसंस्कृत. हम नियमित रूप से अल्पकालिक संस्कृति के लिए hippocampal और neocortical न्यूरॉन्स का उपयोग करें. Neocortex के विच्छेदन भी hippocampal विच्छेदन (hippocampi की जोड़ी प्रति 2.5x10 ⁵ न्यूरॉन्स) है, जो यह उदाहरण के लिए पश्चिमी सोख्ता है, के लिए सामग्री की एक बेहतर विकल्प बनाता है की तुलना में काफी अधिक न्यूरॉन्स ^(cortices की जोड़ी प्रति 1.5x10 6 न्यूरॉन्स) में परिणाम है.

किसी भी प्राथमिक संस्कृति के साथ के रूप में, यह आवश्यक है के लिए समय है कि यह पशु की मौत से कोशिकाओं के चढ़ाना लेता कम से कम. यह आम तौर पर 10-20 dissections लेने के लिए विच्छेदन और चढ़ाना में लगातार तेजी से हो जाएगा. इसके अलावा, जब Lonza Nucleofector के साथ काम, यह electroporation प्रक्रिया के दौरान जल्दी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता तेजी से कम हो जाती है अगर वे nucleofection बफर में छोड़ दिया जाता है.

ज्यादातर हमारे इमेजिंग के कुल आंतरिक reflectance प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) के साथ आयोजित किया जाता है. माइक्रोस्कोपी के इस प्रकार केवल इमेजिंग coverslip परे कई सौ नैनोमीटर में सक्षम है. इसलिए, न्यूरॉन्स के क्षेत्रों है कि छवि हम अक्सर, axonal विकास शंकु और वृक्ष के समान spines, सीधे coverslip करने के लिए पालन किया जाना चाहिए. इस प्रकार, हम कम घनत्व संस्कृतियों है कि लंबी अवधि संस्कृति के लिए glial खिला की आवश्यकता का उपयोग करें. हम उच्च घनत्व संस्कृतियों का इस्तेमाल किया है (> 2x10 ⁴ कोशिकाओं / ² सेमी), glial फीडर परतों के बिना, लंबे समय तक संस्कृतियों के लिए और पाया है कि वे थोड़ा खिला के साथ बहुत अच्छी तरह से जीवित रहते हैं. हालांकि, इन न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines बार बार भी सब्सट्रेट से दूर दूर TIRFM में छवि के लिए कर रहे हैं, हालांकि वे व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ आसानी से पता लगाया जा सकता है.

हमारे अध्ययन के अधिकांश में हम चढ़ाना पहले न्यूरॉन्स transfect, और संस्कृति में तीन महीने के लिए के लिए fluorescently लेबल प्रोटीन imaged. Fluorescently लेबल प्रोटीन की इस अभिव्यक्ति दीर्घकालिक हमें विश्वास देता है कि डीएनए (1 2μg) की कम मात्रा का उपयोग करके हम overexpression कलाकृतियों न्यूरॉन्स में उत्पादन कर रहे हैं. हालांकि, इस प्रक्रिया को भी प्रोटीन की overexpression का अध्ययन करने के लिए अगर डीएनए की उच्च मात्रा (10 20μg) का उपयोग किया जाता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. plasmids है कि हम न्यूरॉन्स transfect उपयोग आमतौर पर EGFP या mCherry संलयन प्रोटीन होते हैं, हालांकि हम भी DsRed2 या अकेले EGFP के साथ neuronal cytoplasm लेबल. यह electroporation तकनीक vectors की एक संख्या के साथ अच्छी तरह से काम करता है. पाली हम plasmids कि सीएमवी बढ़ाने और बीटा ग्लोबिन के साथ एक प्रमोटर β-actin होते हैं पसंद करते हैं एक पूंछ (pCAGGs ^{या pCAX} plasmids) 9, अभिव्यक्ति की अपेक्षाकृत उच्च स्तर के कारण, और तथ्य यह है कि वे न्यूरॉन्स द्वारा अच्छी तरह सहन कर रहे हैं दोनों छोटी और लंबी अवधि संस्कृति में. आम तौर पर, प्रोटीन चढ़ाना के बारे में 4 घंटे के भीतर ^{व्यक्त} और 10 10-24hrs के भीतर इमेजिंग के लिए पर्याप्त स्तर तक पहुँचने शुरू करते हैं. हम सफलतापूर्वक अल्पावधि संस्कृतियों में सीएमवी प्रमोटर संचालित plasmids का इस्तेमाल किया है, लेकिन पाया गया है कि वे overexpression की उच्च स्तर के कारण है कि लंबी अवधि संस्कृति में न्यूरॉन्स को मार सकते हैं. फिर भी, हमने पाया है कि कम घनत्व संस्कृतियों के glial कंडीशनिंग सीएमवी प्रमोटर संचालित plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के अस्तित्व के साथ मदद करता है, उच्च घनत्व (गैर - glial खिलाया) संस्कृतियों की तुलना में,.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Borate	Fisher Scientific	S93356	Store borate buffer at room temperature (RT).
Poly-d-Lysine	Sigma-Aldrich	P7886-100mg	Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C.
Trypsin (10x)	Invitrogen	15090-046	Store aliquots at -80°C.
DNase (10x)	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Store aliquots at -80°C.
MEM	Invitrogen	11095-080	Store at 4°C.
HBSS (10x)	Invitrogen	14185-052	Store at RT.
HEPES (100x)	Invitrogen	15630-080	Store at 4°C.
Penicillin/Streptomycin (100x)	Invitrogen	15140-122	Store aliquots at -80°C.
Horse Serum	Hyclone	SH3007403	Store aliquots at -80°C.
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25200-056	Store at 4°C.
Neurobasal E (NB)	Invitrogen	21103-049	Store at 4°C.
B27 Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044	Store aliquots at -80°C.
Glutamine (100x)	Invitrogen	25030-081	Store aliquots at -80°C
30% Glucose in NB (100X)	Fisher Scientific	BP350-500	Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C.
3.75M NaCl in NB (100X)	Fisher Scientific	BP358-1	Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH3007003	Store aliquots at -80°C.
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w)	Fisher Scientific	Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1	Combine in conical tube and melt in boiling water.
Concentrated Nitric Acid (HNO3)	Fisher Scientific	A509-212	Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows.
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X)	Sigma-Aldrich	C6645	Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.