ラットにおけるアクティブ遅延型過敏（DTH）の誘導とモニタリング

Summary

遅延型過敏症（DTH）はCCR7 -エフェクターメモリーTリンパ球によって媒介炎症反応です。ここでは、ルイスラットでアクティブなDTHを誘導し、炎症反応を監視する方法を示します。

Abstract

遅延型過敏症（DTH）は、免疫系がプライミングされているに対して、抗原の注射の部位に侵入CCR7 -エフェクターメモリーTリンパ球によって媒介炎症反応です。炎症反応は、抗原投与の部位の発赤や腫れが特徴です。それは、免疫抑制剤のin vivo有効性の判断に便利なモデルです。皮膚DTHは、抗原特異的Tリンパ球の養子移入によってまたは抗原、および特定の皮膚領域での炎症反応を誘導する抗原とその後の皮課題と能動免疫のいずれかによって誘導することができる。 DTH反応は例えば卵白アルブミン、ツベルクリン、破傷風トキソイド、またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のために、種々の抗原に誘導することができる。

ここでは、ルイスラットでアクティブなDTH反応を誘導する方法を示します。我々は最初の完全フロイントアジュバントにKLH、興味のある私たちの抗原、の油中水型のエマルジョンを調製し、ラットに皮下このエマルジョンを注入します。これは、KLHに向けメモリーT細胞を開発するために免疫システムをプライミングします。七日後に私たちは反対側に、一方の側に、卵白アルブミン、無関係の抗原とKLHとの背中に皮ラットに挑戦する。炎症反応は、16から72時間後に表示されますし、赤く腫れ面積はDTH重症度の指標として測定されます。

Protocol

1。エマルションの調製

1. エマルジョンは、抗原の1:1混合物である（DTHを種々の抗原に誘導することができる：卵白アルブミン、破傷風トキソイド、水溶液中のキーホールリンペットヘモシアニン....)は、フロイントアジュバントを完了するために追加しました。それは、アジュバントとしない他の方法でラウンドして抗原を追加することが非常に重要です！
   
   
2. 乳剤を作り、注入物がたくさんあるので、常に必要なものよりも1.5〜2倍以上を準備。
   
   
3. 2 mg / mlの溶液を調製するために生理食塩水に抗原を溶かす。あなたが凝集体を失うしたくないので、フィルターしないでください！
   
   
4. 高速でチューブとボルテックスでフロイントアジュバントH37Ra（Difco社製、カタログ＃231131）を完了置く。ボルテックスしながらドロップによる抗原のドロップを追加。さらに5分間抗原のすべてが追加され、渦。混合物は白くなります。
   
   
5. ガラス製注射器でエマルジョンを入れ、（フィッシャーのカタログ＃14から825 - 17L）18Gのブリッジを使用して別のガラスシリンジにリンクします。それがハードになる（5〜10分）まで、シリンジから他にエマルジョンを送る。 2本の5 mLシリンジを使用するのが最良です。エマルジョンのより5mlを必要としている場合は、5mlのシリンジのいくつかのセットを使用してください。
   
   
6. エマルジョンは3週間は4℃で注射器に格納することができます。

2。ラットの予防接種

1. 数分間シリンジでエマルジョンを混合し、注射用注射器に移す。 23G針とルアー先端3 mlの注射器を使用して、尾の基部で1-2部位の皮下に200 mlを注入する。

3。バックの抗原と課題

1. 予防接種7日後、ラットの背中に2スポットをそると皮その他のスポットの1つのスポットと生理食塩水（または無関係な抗原）で1 mg / mlの抗原溶液20mlを注入する。あなたが炎症反応を高めるための集計を失う可能性があるので、抗原溶液をフィルタリングしない。
   
   
2. ラットは運動を避けるためにanesthesizedされるべきである。皮内に27G ½針と1 mlのシリンジを使用してソリューションを注入する。注射の間に針を変更してください。
   
   注 ：課題ではなく、より正確な測定のためのバックの耳の耳介に行うことができます。でビデオを参照してくださいhttp://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4。 DTHの測定

1. 注射部位が赤く、炎症の兆候として、腫脹が開始されます。定規または、いっそのこと、キャリパーを使用して炎症部位の直径を測定する。最大の腫れは、24および72時間の間に発生しなければなりません。

Discussion

DTH反応のより正確な測定のために我々は、耳の耳介に抗原のラットに挑戦することをお勧めします。反応は、その後、関連する抗原チャレンジ耳と単独で生理食塩水のどちらか、または無関係な抗原を持つ障害者の耳との間で腫れ耳の差として測定することができる。耳のチャレンジのデモは、1に示されています。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.