Inducción y seguimiento de activos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en ratas

Summary

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria. Aquí se demuestra la forma de inducir DTH activa en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Abstract

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria que se infiltran en el sitio de la inyección de un antígeno contra el que ha sido el sistema inmunológico preparado. La reacción inflamatoria se caracteriza por enrojecimiento e inflamación del sitio de estímulos antigénicos. Es un modelo práctico para determinar la eficacia in vivo de los inmunosupresores. DTH cutánea puede ser inducido, ya sea por transferencia adoptiva de linfocitos T antígeno-específicos o mediante la inmunización activa con un antígeno, y el desafío posterior intradérmica con el antígeno para inducir la reacción inflamatoria en la piel de una zona determinada. Respuestas DTH pueden ser inducidas a diversos antígenos, por ejemplo, la ovoalbúmina, la tuberculina, toxoide tetánico, o hemocianina de lapa hemocianina (KLH).

Aquí se demuestra la forma de inducir una reacción activa de DTH en ratas Lewis. En primer lugar, preparará una emulsión de agua en aceite de KLH, nuestro antígeno de interés, en el adyuvante completo de Freund e inyectar esta emulsión por vía subcutánea a ratas. Esto se preparan al sistema inmunológico para desarrollar células T de memoria dirigidos a KLH. Siete días después, nos pondrá a prueba a las ratas por vía intradérmica en la espalda con KLH en un lado y con la ovoalbúmina, un antígeno irrelevante, en el otro lado. La reacción inflamatoria será visible 16-72 horas más tarde y en la zona roja e hinchada se medirá como una indicación de la gravedad de DTH.

Protocol

1. Preparación de la emulsión

1. La emulsión es una mezcla de 1:1 de antígeno (DTH pueden ser inducidas a varios antígenos: ovoalbúmina, toxoide tetánico, hemocianina de lapa hemocianina ....) en una solución acuosa añade adyuvante completo de Freund. Es muy importante añadir el antígeno al adyuvante y no al revés!
   
   
2. Hay una gran cantidad de residuos y la hora de hacer la inyección de una emulsión, por lo que siempre preparan 1,5 o 2 veces más de lo que usted necesita.
   
   
3. Disolver el antígeno en solución salina para preparar a 2 mg / ml. No filtro, ya que no quiere perder los agregados!
   
   
4. Ponga adyuvante completo de Freund H37Ra (Difco, catálogo # 231.131) en un tubo y agitar a gran velocidad. Añadir la caída de antígeno a gota y agitación. Cuando todos los antígenos, se añade, vortex por 5 minutos más. La mezcla se debe a su vez blanco.
   
   
5. Ponga la emulsión en una jeringa de vidrio y vincularlo a otro jeringa de vidrio mediante un puente de 18G (catálogo Fisher º 14-825-17L). Enviar la emulsión con una jeringa a otra hasta que se vuelve difícil (5-10 min). Lo mejor es utilizar dos jeringas de 5 ml. Si hay más de 5 ml de la emulsión se requieren, el uso de varios conjuntos de jeringas de 5 ml.
   
   
6. La emulsión puede ser almacenada en las jeringas a 4 ° C durante 3 semanas.

2. La inmunización de las ratas

1. Mezcla de la emulsión en las jeringas durante unos minutos y traslado a la jeringa utilizada para la inyección. Inyectar 200 ml por vía subcutánea en 1-2 sitios en la base de la cola el uso de agujas 23G y una punta Luer-Lok jeringa de 3 ml.

3. Desafío con el antígeno en la espalda

1. Siete días después de la inmunización, se afeitan dos manchas en el dorso de las ratas y inyectar por vía intradérmica 20 ml de una solución de antígeno 1 mg / ml en un lugar y solución salina (o antígeno irrelevante) en el otro sitio. No filtrar la solución de antígeno, ya que pueden perder los agregados que potencian la reacción inflamatoria.
   
   
2. Las ratas deben ser anestesiado para evitar movimientos. Inyectar la solución por vía intradérmica con agujas 27G ½ y jeringas de 1 ml. Cambie las agujas entre las inyecciones.
   
   Nota: el reto se puede hacer en el pabellón de las orejas en lugar de la parte de atrás para mediciones más precisas. Ver video en http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. La medición de DTH

1. El sitio de la inyección comenzará a girar y la hinchazón de color rojo como un signo de inflamación. Medir el diámetro de la zona inflamada con una regla o, mejor aún, un calibrador. La inflamación máximo debe ocurrir entre 24 y 72 horas.

Discussion

Para una medición más precisa de la reacción de DTH se recomienda un desafío a las ratas con el antígeno en el pabellón de la oreja. La reacción se puede medir una diferencia de inflamación del oído entre las autoridades de antígeno desafío auditivo y el oído desafió con solución salina sola o con el antígeno irrelevante. Una demostración del problema en el oído se muestra en 1.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra	Reagent	Difco Laboratories	231131	Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin	Reagent	Sigma-Aldrich	H-5654
Ovalbumin	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5503
5 ml glass syringes	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B	Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Lewis rats	Animal	Harlan Laboratories		Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826 AA	It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes	Tool	Fisher Scientific	05-561-63
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14040-182
1 ml regular tip syringes	Tool	Fisher Scientific	22-257-154
27G 1/2" needles	Tool	Fisher Scientific	14-826-48
Electric cordless trimmer	Tool	Braintree Scientific, Inc.	CLP-32130	To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.