Summary
لزراعة الخلايا الجذعية العصبية قمة (NCSC) في المختبر ، مطلوب المتوسطة الخاصة (NCSCM). جزء أساسي من NCSCM الفرخ هو استخراج الجنين (CEE). نحن هنا وصف دقيق تقنيات لإنتاج كمية من أوروبا الوسطى والشرقية إلى أقصى حد نوعية نقية وعالية ، بما في ذلك تفاصيل مثل العزلة ، والنقع ، الطرد المركزي ، وعمليات الترشيح.
Abstract
قمة العصبية تنشأ من الأديم الظاهر العصبي خلال مرحلة التطور الجنيني ، واستمرت لفترة مؤقتة فقط. التجارب المبكرة تثبيتهم بالفعل الخلايا الاصلية المحفزة لتكون جزءا لا يتجزأ من العرف العصبي 1. Phenotypically ، وتعرف الخلايا الجذعية العصبية قمة (NCSC) في وقت واحد معربا عن P75 (منخفضة أفيني مستقبلات عامل نمو الأعصاب ، LNGFR) وSOX10 خلال هجرتهم من قمة العصبية 2،3،4،5. يمكن لهذه الخلايا الاصلية تفرق في خلايا العضلات الملساء والخلايا أليفة الكروم ، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، وكذلك الخلايا الصباغية والغضاريف والعظام 6،7،8،9. لزراعة NCSC في المختبر ، وخاصة قمة العصبية الجذعية المتوسطة الخلية (NCSCM) مطلوب 10. الجزء الأكثر تعقيدا في NCSCM هو إعداد استخراج الجنين الفرخ (CEE) الذي يمثل مصدرا أساسيا من عوامل النمو لNCSC فضلا عن أنواع أخرى من explants العصبية. المكونات الأخرى بجانب NCSCM CEE متاحة تجاريا. CCE المنتجة باستخدام معدات المختبر القياسية فإنه من الأهمية العالية لمعرفة التفاصيل الصعبة مثل العزلة ، والنقع ، الطرد المركزي ، وعمليات الترشيح. في هذا البروتوكول وصفنا تقنيات دقيقة لإنتاج كمية من أوروبا الوسطى والشرقية إلى أقصى حد نوعية نقية وعالية.
Protocol
الدولة من الكتاب والتي أجريت على حيوانات التجارب وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس (86/609/EEC) ، في أعقاب المبادئ التوجيهية لمعاهد الصحة القومية بشأن رعاية واستخدام الحيوانات لإجراءات تجريبية والانظمة التي وضعتها المؤسسات الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة دويسبورغ إيسن (ألمانيا).
الجزء 1 : إعداد (لا يظهر على الفيديو)
إعداد المواد والحلول (قبل اتخاذ البيض من أصل الحاضنة)
- البيض يجب أن تكون المحتضنة في حاضنة مرطب لمدة 11 يوما على 37 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت).
- 70 ٪ رذاذ الايثانول ، لوحات نظيفة ، وملقط نظيفة دقيقة ، 4 درجات مئوية (40 درجة فهرنهايت) الباردة العقيمة DMEM على الجليد و 60 مل الحقن المعقمة
- 50 مل العقيمة أنابيب كورنينج يجب أن تكون نصف مملوءة 4 درجات مئوية الباردة DMEM لخلط الأجنة متآكلة في نسبة 1:1 (كتلة متآكلة : DMEM). حالما يتم أخذ البيض من أصل تشريح حاضنة لافراخ الدجاج يجب أن تكون بدأت.
- تعقيم أدوات تشريح في الأوتوكلاف أو في اليوم التشريح ، غمر الأدوات في الايثانول 70 ٪ لمدة 20 دقيقة.
الجزء 2 : تشريح لافراخ الدجاج (برهنت على الفيديو)
- الرطب البيض المحتضنة مع رذاذ الايثانول 70 ٪ على الأقل 30 ثانية وتجفيفها بعناية مع مناشف ورقية نظيفة ناعمة بينما لا تهتز البيض بشكل مفرط.
ملاحظة : من المستحسن عدم تشريح افراخ الدجاج أكثر من 60 في وقت واحد. - فتح البيض بعناية من قبل محطما ضد حافة حادة واخراج الجنين بحذر عدم تدمير أو صفار كيس الجنين الفرخ نفسه.
- بحث عن بداية الحبل السري بسرعة وفتح التفاف واضحة من دون تدمير كيس المح أو أي سفن صغيرة. تشريح ثم الحبل السري مع ملقط نظيفة دقيقة.
- يأخذ الجنين من كيس المح.
ملاحظة : يجب قطع رأس الجنين بسرعة (لا يظهر في شريط الفيديو). - جمع الأجنة في الوسيلة الأساسية في الحد الأدنى من 4 درجات مئوية.
الجزء 3 : تعطين لافراخ الدجاج
- أخذ حقنة من المكبس معقمة 60 مل.
- نقل الأجنة حوالي 10 حقنة في واحدة 60 مليلتر.
- وضع المكبس الخلفي بعناية في حقنة لكي لا تجازف بخسارة مادية متآكلة.
- أضعف من خلال دفع المكبس إلى أسفل.
- جمع الشامل في أنابيب متآكلة استعداد كورنينج نصف مليئة DMEM في نسبة 1:1 (كتلة متآكلة : DMEM). أجنة باستخدام 10 وبلغ حجم التداول حوالي 25 مل ويتم إنتاج.
- ضع الخليط على شاكر لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية.
الجزء 4 : الطرد المركزي للجنين الفرخ -- DMEM تعليق
- نقل الجنين الفرخ -- في أنابيب الطرد المركزي DMEM التعليق.
- إضافة هيالورونيداز العقيمة في تركيز 1 ملغ 25 ملغ من الجنين.
- أنابيب الطرد المركزي الفارغة بدقة متناهية.
ملاحظة : يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بحذر كما هو الطرد المركزي تعمل على سرعات عالية جدا بالقوة ز وأضرار مادية أو الطرد المركزي يمكن أن تحدث في حالة استخدام أنابيب غير متوازن. مع دقة عالية وزنها فقا آلة بشأن المناصب الثلاثة يجب أن تسلم بعد الفاصلة العشرية للجميع أنابيب من خلال تعديل كمية المفقودين مع DMEM. - خفض درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
ملاحظة : يجب أيضا أن يتم تخزين الدوار الطرد المركزي في غرفة التبريد أو الثلاجة طوال الليل. - الطرد المركزي 6 ساعات على الأقل لساعة. xgx 180،000 ملاحظة : للحصول على نتائج متفوقة بشأن فصل واحد من مراحل استخدام 266،000 xgx ح إذا كان ذلك ممكنا ، استخدم التكيف فراغ.
الجزء 5 : الترشيح لاستخراج الجنين الفرخ
بعد الطرد المركزي ، ويمكن لاحظت ثلاث مراحل : المرحلة العليا وسائل قذرة مع شظايا الدهنية ، وهي مرحلة واضحة في منتصف السائل وبيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. ملاحظة : المصافحة أو الانتقال السريع من الخليط بالطرد المركزي يجب أن يكون تجنب تماما ، لأن هذا من شأنه أن يدمر نتيجة للخطوة الطرد المركزي التي تفقد واضحة المرحلة السائلة المركزية.
ملاحظة : جميع الخطوات التالية التي يتعين القيام بها تحت ظروف معقمة باستخدام تدفق الهواء مقاعد البدلاء الصفحي :
- ماصة المرحلة السائلة واضحة في نظام التصفية مع مسام 0.45 ميكرون. ثم التبديل على مضخة فراغ متصل.
ملاحظة : لا تلمس بيليه في القاع. هذا من شأنه أن يؤدي إلى تلوث للاستخراج وجود انسداد في نظام التصفية. - نقل استخراج مسبقا في نظام التصفية مع مسام 0.22 ميكرون والتبديل على مضخة فراغ متصلا مرة أخرى.
- قسامة الجنين بلغ استخراج الفرخفي أنابيب معقمة كورنينج 15 مل.
- مخزن بسرعة aliquots في -80 درجة مئوية (-62 درجة فهرنهايت). ملاحظة : CEE الماضي لمدة تصل إلى سنتين إذا المخزنة في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند هذا البروتوكول على إدخال تعديلات على الإجراءات التي تم وصفها في الماضي 10،11. بالإضافة إلى المنشورات السابقة التي نعرضها هنا هي الخطوات الفردية المختلفة لعملية التوسع أكثر من ذلك. هذا يدعم مجرب مع تفاصيل مهمة ضمان اجراءات صحيحة ونتائج موثوق بها. كذلك ، عملية التشريح هو جزء أساسي من استخراج أوروبا الوسطى والشرقية وصفنا الإجراء أخذ الأجنة من الكيس المحي في كل تفاصيلها. هناك عدة نقاط هامة لاحظ كما هو مبين أدناه.
يجب أن تبدأ في تشريح افراخ الدجاج في أقرب وقت ممكن بعد الحضانة قد انتهت. لا ينبغي أن يجري أجنة ميتة قبل تشريح تستعمل لأية خطوات من هذا البروتوكول تنشيط الأنزيمية وتدهور البروتين قد تؤثر سلبا على النتيجة.
قبل بدء بعض اليد على التدريب كما يجب أن يتم تنفيذ كل خطوات عملية التشريح أن تنفذ بسرعة وبدقة. من المهم لنجاح العملية بالكامل ، لتجنب التلوث مع صفار البيض الذي كان يرافقه على كمية من البروتينات يذكر التدخل سلبا. بعد أن تم نقل الأجنة من أكياس صفار تكون مقطوعة الرأس انهم بسرعة (لا يظهر في شريط الفيديو).
درجة الحرارة فضلا عن سرعته من الدوار هي مهمة جدا ، جدا. وينبغي من أجل تفادي تفعيل الأنزيمية وانخفاض نوعية وكمية من العوامل اللازمة لNCSCM يتم تخفيض درجة حرارة الطرد المركزي والدوار إلى 4 درجات مئوية. بعد خطوة الطرد المركزي واضحة المرحلة السائلة المركزي هو المهم قبل استخراج يحتوي على عوامل أساسية لنمو NCSCM. لتحقيق فصل كبير من كسور مختلفة وإثراء العوامل اللازمة نوصي سرعته لا تقل عن 180.000 xgx ح
والفرق في الكثافة بين السائل واضحة المرحلة والمرحلة السائلة حقيرا في الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي لا يمنع وقوع remixing من جزئين أي اهتزاز لابد من تجنبها. لا يمكن لمكونات المرحلة السائلة حقيرا يكون مرشح من خلال نظام 0.45 ميكرون التصفية ، حيث أن الأجزاء الدهنية من أنه سيكون قريبا جدا تؤدي إلى انسداد في نظام التصفية. لا ينبغي أيضا بيليه في الجزء السفلي من أجهزة الطرد المركزي يمكن لمسها في كل شيء ، كما أنها أجزاء من شأنها أن تؤدي إلى انسداد في نظام التصفية.
في الخطوة الاخيرة من إمكانات أوروبا الوسطى والشرقية لزراعة NCSCs يجب أن يكون التحقق من صحتها. هذه الفئة من السكان multipotent عابرة للخلايا الجذعية تفقد قدرتها على البقاء في وسائل الإعلام بسرعة دون الحاجة الكافية وأضاف أوروبا الوسطى والشرقية المنتجة. لذلك يزرع خط الماوس المعدلة وراثيا (JoMa1) ، الذي يعبر عن علامات مبكرة NCSC بطريقة تعتمد على التحوير والنشاط ، ويستخدم لدراسة البيولوجيا في كل NCSC الاتهام التي حصل حديثا في أوروبا الوسطى والشرقية 10. زراعة ناجحة لNCSCs يمثل التحقق المناسب من أوروبا الوسطى والشرقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
كان الدعم والمشورة من Pajtler ماركوس وروبرت Bohrer لا تقدر بثمن لتصور من هذا البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
