Summary
Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.
Abstract
La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale 1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale 2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso 6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto 10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell'embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.
Protocol
Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).
Parte 1: Impostazione (non mostrato in video)
PREPARAZIONE MATERIALI E SOLUZIONI (prima di prendere le uova fuori dell'incubatore)
- Le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato per 11 giorni a 37 ° C (100 ° F).
- Etanolo Spray 70%, piastre pulite, precise pinze pulite, 4 ° C (40 ° F) freddo sterile DMEM su ghiaccio e 60 ml siringhe sterili
- 50 mL Provette sterili Corning devono essere riempito a metà con 4 ° C a freddo DMEM per miscelare gli embrioni macerare con un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Non appena le uova vengono portati fuori dal dissezione incubatore di embrioni di pollo deve essere avviato.
- Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti.
Parte 2: Preparazione del embrioni di pollo (dimostrata su Video)
- Bagnare le uova incubate con uno spray etanolo al 70% per almeno 30 secondi e asciugare accuratamente con asciugamani puliti carta morbida, mentre non scuotere troppo le uova.
Nota: Si consiglia di non sezionare più di 60 embrioni di pollo contemporaneamente. - Aprire le uova con attenzione da lanciasse contro un bordo tagliente ed estrarre l'embrione con cautela, non distruggendo il sacco vitellino e l'embrione stesso pulcino.
- Ricerca per l'inizio del cordone ombelicale in modo rapido ed aprire la confezione trasparente, senza distruggere il sacco vitellino o le navi poco. Poi sezionare il cordone ombelicale con precise pinze pulite.
- Prendete l'embrione fuori dal sacco vitellino.
Nota: Gli embrioni devono essere decapitato in fretta (non mostrato nel video). - Raccogliere gli embrioni in minima quantità di terreno necessario a 4 ° C.
Parte 3: Macerazione delle embrioni di pollo
- Prendete lo stantuffo di una siringa da 60 ml sterile.
- Trasferimento di circa 10 embrioni in una siringa da 60 ml.
- Mettere lo stantuffo con attenzione nella siringa per non rischiare di perdere materiale macerato.
- Macerare premendo lo stantuffo.
- Raccogliere la massa macerare nel provette preparate corning mezza piena di DMEM ad un rapporto di 1:1 (massa macerata: DMEM). Utilizzando 10 embrioni un volume di circa 25 ml viene prodotto.
- Mettere il composto in uno shaker per 45 minuti a 4 ° C.
Parte 4: centrifugazione del embrione di pollo - Sospensione DMEM
- Trasferire la embrione di pollo - sospensione DMEM nei tubi centrifugazione.
- Aggiungi ialuronidasi sterile ad una concentrazione di 1 mg per 25 mg di embrione.
- Tara i tubi centrifugazione con estrema precisione.
Nota: Questa operazione deve essere effettuata con cautela, poiché centrifugazione viene eseguita molto alto G-Force e di danni materiali o centrifuga potrebbe verificarsi se si utilizza tubi squilibrato. Con una elevata precisione di pesatura secondo macchina per quanto riguarda le tre posizioni dopo il punto decimale per tutti i tubi dovrebbero essere ricevuti regolando la quantità mancante con DMEM. - Ridurre la temperatura della centrifuga a 4 ° C.
Nota: Anche il rotore centrifugazione devono essere conservati in una camera di raffreddamento o frigorifero per una notte. - Centrifugare 6 ore a meno di 180,000 xgx h. Nota: per risultati superiori per quanto riguarda la separazione delle singole fasi uso 266,000 xgx h. Se possibile, utilizzare la regolazione del vuoto.
Parte 5: Filtrazione dell'estratto embrione di pollo
Dopo la centrifugazione, tre fasi si possono notare: La tomaia fase squallido liquida con frammenti di grasso, la fase liquido limpido in mezzo e il pellet alla base del tubo di centrifugazione. Nota: Shaking o in movimento vivace della miscela deve essere centrifugata assolutamente evitata, in quanto ciò avrebbe distrutto il risultato della fase di centrifugazione, perdendo la fase liquido limpido centrale.
Nota: Tutti i passaggi che seguono devono essere eseguite in condizioni sterili con un banco d'aria a flusso laminare:
- Pipettare la fase chiara liquido in un sistema di filtri con pori di 0,45 micron. Poi accendere la pompa del vuoto collegata.
Nota: non toccare il pellet in basso. Ciò porterebbe a una contaminazione di estratto e un blocco del sistema di filtraggio. - Trasferire la pre-estratto in un sistema di filtri con pori di 0,22 micron e accendere la pompa del vuoto collegata di nuovo.
- L'aliquota raggiunta estrarre embrione di polloin sterili da 15 ml tubi Corning.
- Memorizzare rapidamente le aliquote a -80 ° C (-62 ° F). Nota: L'durare fino a due anni CEE se conservati a -80 ° C.
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Discussion
Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito.
La dissezione del embrioni di pollo deve essere iniziato appena possibile dopo l'incubazione è terminato. Gli embrioni sono morti prima di dissezione non deve essere utilizzato per qualsiasi iniziativa di questo protocollo, come l'attivazione e la degradazione enzimatica delle proteine potrebbero influenzare negativamente il risultato.
Prima di iniziare una mano sulla formazione deve essere eseguita come tutte le fasi del processo di dissezione deve essere effettuata velocemente e con precisione. E 'importante per il successo dell'intera procedura, al fine di evitare la contaminazione con il tuorlo d'uovo che è stato accompagnato da una notevole quantità di proteine interferire negativamente. Dopo gli embrioni sono stati portati via dei sacchi tuorlo dovrebbero essere decapitato in fretta (non mostrato nel video).
Temperatura e celerità del rotore sono molto importanti, anche. Al fine di evitare l'attivazione enzimatica e una riduzione della qualità e quantità dei fattori necessari per la NCSCM la temperatura della centrifuga e il rotore deve essere ridotto a 4 ° C. Dopo la fase di centrifugazione la fase liquido limpido centrale è l'importante pre-estratto contenente i fattori di crescita essenziale per la NCSCM. Per ottenere una notevole separazione delle diverse frazioni e un arricchimento dei fattori necessari si consiglia una celerità non inferiore a 180,000 xgx h.
Come la differenza di densità tra la fase liquida e chiara la fase liquida squallido nella parte superiore del tubo di centrifugazione non impedisce a un rimescolamento delle due parti eventuali vibrazioni deve essere evitato. I componenti della fase liquida squallido non può essere filtrato attraverso un sistema di filtro 0,45 micron, come le parti grasse che sarebbe ben presto portare ad un intasamento del sistema di filtraggio. Anche il pellet alla base della centrifuga non dovrebbe essere toccato a tutti, come parti di essa porterebbe ad intasamento del sistema di filtraggio.
Nella fase finale il potenziale della CEE per la coltivazione di NCSCs deve essere convalidato. Questa popolazione multipotenti transitorio di cellule staminali perde la sua vitalità rapidamente nei media senza avere un adeguato aggiunto prodotto CEE. Quindi una linea di topi transgenici (JoMa1), che esprime primi marcatori NCSC in un transgene-attività dipendente e viene usato per studiare biologia NCSC è coltivato in ogni carica appena ottenuto dei paesi CEE 10. La coltivazione di successo di NCSCs rappresenta una validazione appropriata della CEE.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il supporto e la consulenza di Markus Pajtler e Robert Bohrer sono stati preziosi per la visualizzazione di questo protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
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