Summary
체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.
Abstract
신경 능선은 embryogenesis 동안 신경 ectoderm에서 발생에만 일시적으로 지속. 초기 실험은 이미 신경 문장 하나의 불가분의 일부로 pluripotent 전구 세포를 침대. Phenotypically, 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)는 동시에 신경 문장 2,3,4,5으로부터 마이 그 레이션하는 동안 p75 (낮은 affine 신경 성장 인자 수용체, LNGFR)와 SOX10 표현에 의해 정의됩니다. 이러한 전구 세포는 평활근 세포, chromaffin 세포, 뉴런과 glial 세포뿐만 아니라, melanocytes, 연골과 뼈 6,7,8,9로 구별하실 수 있습니다. 시험 관내, 특별한 신경 크레스트 줄기 세포 매체 (NCSCM)에 NCSC를 육성하기 위해서는 10 필요합니다. NCSCM의 가장 복잡한 부분은 NCSC뿐만 아니라 신경 explants 다른 유형의 성장 요인의 필수 소스를 대표하는 여자는 배아 추출물 (시)의 준비입니다. 시 옆에 다른 NCSCM 재료는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정으로 도전하는 세부 사항에 대해 알고 높은 중요 CCE 사용하여 실험실 표준 장비를 생산. 이 프로토콜에서는 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.
Protocol
동물 실험 기관에 의해 규정된 동물 실험 절차와 규정에 대한 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH의 지침에 따라, 유럽 커뮤니티 이사회 지침 (86/609/EEC)에 따라 수행다고 저자 상태 관리 및 뒤스부르크 - 에센 대학 (독일)에서위원회 (IACUC)를 사용합니다.
1 부 : (비디오에 표시되지 않음) 설정
(인큐베이터 밖으로 알을 복용하기 전에) 자료 및 솔루션 준비
- 계란은 37 11일위한 humidified 인큐베이터에 incubated해야 ° C (100 ° F).
- 70 % 에탄올 스프레이, 깨끗한 접시, 정밀 청소 집게, 4 ° C (40 ° F) 추운 살균 얼음 DMEM 60 ML 무균 주사기
- 50 ML 무균 코닝 튜브 ° C 감기 DMEM가 1시 1분의 비율 (DMEM 분해 질량)에서 분해 배아를 섞어 4 반 가득해야합니다. 즉시 계란이 여자는 태아의 인큐베이터의 해부 밖으로 가져옵니다 같은 것은 시작되어야한다.
- 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다.
2 부 : 칙 태아의 해부 (비디오에서 보여준)
- 최소한 30 초 동안 70 % 에탄올 스프레이로 incubated 알을 습식 및 과도하게 계란을 흔들림없는 동안 깨끗하고 부드러운 종이 타올로 신중하게 건조.
참고 : 우리는 동시에 60 개 이상의 여자는 배아를 해부하지 권장합니다. - 날카로운 모서리로부터적으로하여 신중하게 계란을 열고 노른자의 자루 또는 여자는 배아 자체를 파괴하지주의와 배아를 꺼내.
- 빨리 탯줄의 시작에 대한 검색 및 노른자의 자루 또는 작은 혈관을 파괴하지 않고 맑은 포장을 엽니다. 그런 다음 정확한 깨끗한 포셉과 탯줄을 해부하다.
- 난황 자루의 배아를 꺼내주세요.
참고 : 태아가 (비디오에 표시되지 않음) 신속하게 참수해야합니다. - 4 최소한의 필수적인 매체 배아를 수집 ° C.
파트 3 : 칙 태아의 물에 담가서 부드럽게 함
- 60 ML 멸균 주사기 밖으로 플런저를 가져가라.
- 한 60 ML 주사기로 약 10 배아를 전송합니다.
- 분해 물질을 잃을 위험하지 위해 신중하게 다시 주사기로 플런저를 넣어.
- 플런저를 밀어 물에 담가서 부드럽게.
- 준비 코닝 튜브 1시 1분 (DMEM 분해 질량)의 비율로 DMEM과 절반 채워진에서 분해 덩어리를 수집합니다. 10 배아에게 약 25 ML의 볼륨을 사용하는 것은 생산이다.
- 4 45 분 ° C. 위해 쉐이크에 혼합 플레이스
파트 4 : 칙 배의 원심 분리 - DMEM 서스펜션
- 여자의 배아를 전송 - DMEM 서스펜션을 원심 분리 튜브에.
- 배아의 25 MG 당 1 밀리그램의 농도에서 살균 hyaluronidase를 추가합니다.
- 매우 정확하게 테어 원심 분리 튜브.
참고 : 원심 분리가 매우 높은 G - 포스 및 재료 또는 불균형 튜브를 사용하는 경우 원심 분리기가 발생할 수의 손상에서 실행되는이 단계는주의해서 수행해야합니다. 모든 튜브에 대한 소수점은 DMEM으로 누락된 금액을 조정하여 접수해야 다음 세 위치에 대한 기계에 따라 무게 높은 정확도. - 4 원심 분리기의 온도를 줄이기 ° C.
참고 : 또한 원심 분리의 회전자는 밤 동안 냉각 챔버 또는 냉장고에 보관해야합니다. - 적어도 180.000 xgx H. 6 시간 원심 분리기 참고 : 단일 단계의 분리에 관한 뛰어난 결과를 얻으려면이 266.000 xgx H.를 사용하여 가능하면 진공 조정을 사용합니다.
5 부 : 칙의 배아 추출의 여과
원심 분리 후, 세 단계가 발견하실 수 있습니다 지방산 조각, 중간에 투명 액상 및 원심 분리 관의 하단에있는 펠렛과 함께 상위 거무죽죽한 액상 참고 사항 :. 떨려 또는 활발한 centrifuged 혼합물의 이동하면되어야합니다 이것은 명확한 중앙 액체 단계를 잃는하여 원심 분리 단계의 결과를 파괴처럼 엄격히 피해야.
참고 : 모든 다음 단계는 층류 공기 흐름 벤치를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야 :
- 0.45 μm의의 모공과 필터 시스템에 투명한 액체 단계를 피펫. 다음 연결된 진공 펌프 스위치.
참고 : 하단에있는 펠렛를 만지지 마십시오. 이것은 추출하고 필터 시스템의 차단의 오염으로 이어질 것입니다. - 0.22 μm의와 연결된 진공 펌프의 스위치를 다시의 모공과 필터 시스템에 사전 추출물을 전송합니다.
- 나누어지는 획득 여자는 배아 추출물에게무균 15 ML 코닝 튜브 인치
- 신속 -80에서 aliquots를 저장할 ° C (-62 ° F). 참고 : -80에 저장된 경우 최대 2 년 동안 마지막시 ° C.
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Discussion
이 프로토콜은 과거 10,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 전 출판물 이외에도 우리는 여기 개별 서로 다른 프로세스의 단계 더 확장을 보여줍니다. 이것은 올바른 절차와 신뢰할 수있는 결과를 확보 중요한 세부 실험자을 지원합니다. 해부 과정시 추출의 필수적인 부분이므로 나아가, 우리는 모든 세부 사항에 노른자의 자루의 배아를 복용의 절차를 설명합니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다.
부화가 끝난 후 여자는 태아의 해부는 가능한 빨리 시작되어야합니다. 이전 해부 죽은되고 태아도 부정적인 결과에 영향을 미칠 수 효소 활성화 및 단백질 저하로이 프로토콜의 모든 단계를 사용하지 않아야합니다.
시작하기 전에 몇 가지 수작업에 대한 교육 신속하고 정확하게 실시해야 해부 프로세스의 모든 단계로 수행되어야합니다.을 그것은 부정적인 간섭 단백질의 주목할만한 양의 동행했다 노른자위와 오염을 피하기 위해, 전체 과정의 성공을 위해 중요합니다. 배아는 노른자의 자루 밖으로 찍은 후 그들은 (비디오에 표시되지 않음) 신속하게 참수해야합니다.
온도뿐만 아니라 회전자의 민첩함도 매우 중요합니다. 효소 활성화 및 NCSCM에 필요한 요소의 품질 및 수량의 감소를 방지하기 위해 원심 분리기 및 로터의 온도가 4 감소되어야 ° C. 원심 분리 단계 후에 취소 중앙 액체 단계 NCSCM 위해 필수적인 성장 요소를 포함한 중요한 사전 추출물입니다. 다른 분수의 상당한 분리 및 요소의 농축을 달성하기 위해 우리는보다 낮은 180.000 xgx H.는 민첩함하지 권장 필요
원심 분리 튜브의 상단에있는 맑은 액상 및 거무죽죽한 액체 상 사이의 밀도의 차이는 떨고는 피할 수있는 두 부분으로 remixing을 방지하지 않으므로. 그것의 지방 부분이 곧 필터 시스템의 막히는로 이어질 것처럼 거무죽죽한 액체 단계의 구성 요소, 0.45 μm의 필터 시스템을 통해 filtrated 수 없습니다. 그것의 부분은 필터 시스템의 막히는로 이어질 것처럼 원심의 하단에있는 또한 펠렛은 전혀 손도 안됩니다.
최종 단계에서 NCSCs의 재배에 대한시의 잠재력은 검증되어야한다. 줄기 세포의이 multipotent 과도 인구는 충분한 생산시를 추가하지 않고 미디어에 신속하게 국제 경쟁력을 잃고. 따라서 transgene - 활동에 의존 방식으로 초기 NCSC 마커를 표현하고 NCSC 생물학을 연구하는 데 사용되는 유전자 변형 마우스 라인 (JoMa1)는시 10 때마다 새로 얻은 담당 재배됩니다. NCSCs의 성공적인 재배는시의 적절한 검증을 나타냅니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
마커스 Pajtler과 로버트 Bohrer의 지원과 조언이 프로토콜의 시각화를위한 귀중한되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
